Détermination de la cinétique d’activation in vitro et cellulaire pour les aptamères d’ARN fluorogéniques

L’étude in vitro et de la cinétique des aptamères fluorogéniques cellulaires permet à l’utilisateur d’évaluer si les interactions des colorants aptamères sont suffisamment rapides pour étudier un processus d’intérêt en temps réel. Les techniques présentées permettent des mesures cinétiques quantitatives à l’intérieur et à l’extérieur de la cellule, l’une ou l’autre pouvant être pertinente en fonction de l’application de l’aptamère. Les méthodes présentées peuvent être appliquées à n’importe quel système d’ARN fluorogénique, y compris les aptamères alternatifs et les biocapteurs à base d’ARN pour les petites molécules.

Pour commencer, configurez le programme de renaturation de l’ARN à partir du thermocycleur. Créez le programme en sélectionnant créer un nouveau programme"ajouter une nouvelle phase"et ajoutez une nouvelle étape"plusieurs fois pour ajouter des étapes spécifiques à la température avant d’appuyer sur enregistrer"Ajuster les paramètres supplémentaires en fonction du programme. Pour renaturer les ARN d’épinards et de brocoli, préparez deux tiges micromolaires de chaque ARN dans de l’eau distillée double dans un tube PCR à paroi mince de 0,5 millilitre.

Ajoutez ensuite des volumes égaux de tampon de renaturation à deux x pour obtenir une solution d’ARN micromolaire. Placez les tubes dans le thermocycleur. Ouvrez le programme de renaturation enregistré et appuyez sur exécuter"Ensuite, configurez le programme d’injecteur de lecteur de plaques.

Sur le lecteur de plaque de fluorescence, sélectionnez la température et réglez-la à 37 degrés Celsius. Avant de commencer la cinétique, assurez-vous que la température s’est équilibrée à cette valeur. Ouvrez le logiciel du lecteur de plaques.

Sélectionnez les paramètres"puis la vue d’acquisition"pour entrer le programme pour les mesures cinétiques, sélectionnez la boucle"pour chaque puits. Ensuite, définissez le réglage de base sur 60 lectures de base et les paramètres d’injection intelligente pour une injection de 10 microlitres. Réglez la fluorescence lit la longueur d’onde d’excitation à 448 nanomètres, la longueur d’onde d’émission à 506 nanomètres et la cartouche à mono.

Définissez la durée totale de lecture sur 10 minutes avec un intervalle de lecture de 0,5 seconde. Réglez PMT et l’optique sur six flashs par lecture. Ensuite, boucle d’entrée au puits suivant.

Pour préparer l’injecteur à plaques, sélectionnez injecter sur le lecteur de plaques et fournir une plaque de collecte des déchets lorsque cela est indiqué. Sélectionnez ensuite laver et nettoyez le tube d’injection en suivant les instructions du lecteur de plaques avec un millilitre de volume d’eau distillée double, d’éthanol à 75%, puis d’eau distillée. Sélectionnez ensuite aspirer pour permettre à l’injecteur d’éjecter l’excès de liquide.

Sélectionnez ensuite prime pour amorcer l’injecteur avec deux 260 microlitres de 100 micromolaires D F H B I.To effectuer une expérience de cinétique ajouter 80 microlitres de mélange maître tampon de liaison à un puits d’une plaque inférieure claire de 96 puits. Ajoutez ensuite 10 microlitres d’ARN renaturé. Laisser la plaque et la solution D F H B I dans l’injecteur s’équilibrer à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ensuite, sélectionnez le puits à analyser dans les paramètres du logiciel sous la zone de lecture. Ensuite, sous l’onglet d’accueil, sélectionnez Exécuter"pour exécuter le programme cinétique décrit précédemment. Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les expériences soient terminées.

Après l’exécution, laver l’injecteur pour retirer le reste de la solution D F H B I du tube d’injection, comme indiqué précédemment. Pour configurer les fichiers expérimentaux, allumez le cytomètre en flux et l’ordinateur. Créez un nouveau fichier dans l’onglet de l’explorateur d’expériences en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le cytomètre en flux"nom d’utilisateur ».

Sélectionnez ensuite une nouvelle expérience"dans la fenêtre déroulante et lorsqu’une nouvelle fenêtre sur l’écran de l’ordinateur apparaît, sélectionnez le type d’expérience en tant que tubes"puis sélectionnez OK"Dans le nouveau fichier d’expérience, cliquez avec le bouton droit sur le dossier du groupe et sélectionnez ajouter un nouveau tube d’échantillon"Étiquetez les tubes d’échantillon pour chaque point de temps spécifique et répliquez en cliquant avec le bouton droit de la souris sur échantillon"et en sélectionnant renommer"dans le menu déroulant. Ensuite, préparez une solution cellulaire diluée en ajoutant 1,5 millilitre d’un X P B S et trois microlitres de cellules induites dans un milieu d’IA dans un tube de culture. Avant d’ajouter du colorant, mesurez la fluorescence de fond des cellules pour observer le pli s’allumer au fil du temps.

Une fois le colorant ajouté, placez le tube de culture contenant les cellules en P B S dans le tube de levage du tube d’échantillon et soulevez le tube de levage jusqu’à l’aiguille d’injection de l’échantillon. Sélectionnez ensuite le fichier d’échantillon approprié dans l’onglet du panneau de collecte et cliquez sur Enregistrer"Une fois l’exécution terminée, abaissez le tube d’échantillonnage avec le tube de culture à la main. Initier une étape de rinçage, rincer le système fluidique et minimiser le transfert entre chaque échantillon de réplication biologique.

Pour passer à l’exemple suivant, sélectionnez le fichier d’exemple suivant en cliquant sur l’icône en forme de flèche droite près du nom du tube d’échantillon sous l’icône d’enregistrement. Pour mesurer la fluorescence des cellules avec colorant, ajoutez 1,4 microlitre de stock de colorant concentré dans un X P B S avec des cellules, pour donner une concentration finale de 50 micromolaires D F H B I un T.Fixez le couvercle du tube de culture et inversez trois à cinq fois pour mélanger la solution uniformément. Ensuite, retirez le couvercle et placez le tube de culture dans le tube de levage du tube d’échantillon.

Après avoir soulevé le support jusqu’à l’aiguille d’injection de l’échantillon, cliquez sur l’icône « enregistrer » sous le fichier d’échantillon approprié. Ensuite, commencez une minuterie en appuyant sur start"La cinétique in vitro des aptamères fluorogéniques épinards deux et brocolis, a montré une cinétique d’association à deux phases pour la liaison au colorant D F H B I. Pour les deux aptamères, les données cinétiques étaient mieux ajustées par association à deux phases qu’à une phase à de longs temps de mesure.

La courbe de meilleur ajustement a déterminé les constantes de vitesse et les valeurs de demi-vie pour les associations rapides et lentes. Les épinards deux dans l’état de compétence de liaison, ont montré une allumure plus rapide que le brocoli. La cinétique de la deuxième phase pour les deux aptamères est similaire et peut correspondre à une étape commune de limitation de débit.

Les courbes cinétiques des aptamères sont composées d’un degré similaire d’ARN d’association rapide. Pour les cellules exprimant deux ARN T d’épinards, l’intensité de fluorescence moyenne ou M F I augmente immédiatement au point temporel nul. De plus, la fluorescence cellulaire a atteint sa valeur maximale équilibrée M F I en cinq minutes.

En revanche, les cellules témoins ont montré une faible fluorescence de fond et aucun changement dans les valeurs M F I avec l’addition D M S O Les méthodes présentées permettent aux chercheurs de déterminer comment ils peuvent rendre plus rapides les capteurs à base d’ARN dans les aptamères fluorogéniques.