Name: Résolution de problèmes pratiques liés à la micro-indentation basée sur la microscopie à force atomique sur des explants de cartilage articulaire humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Apprenez la micro-indentation par microscopie à force atomique sur des explants de cartilage articulaire humain. Ce protocole permet d'étudier les propriétés mécaniques du cartilage et la progression de l'arthrose.

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Nous remercions les chirurgiens orthopédistes du service de chirurgie orthopédique de l’hôpital universitaire de Tübingen pour avoir fourni les échantillons de tissus.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En tant que maladie progressive et multifactorielle, l’arthrose déclenche des changements structurels et fonctionnels dans le cartilage articulaire. Tout au long de l’arthrose, les altérations des caractéristiques mécaniques s’accompagnent de modifications structurelles et biochimiques à la surface du cartilage articulaire27,31. Les premiers événements pathologiques survenant dans l’arthrose sont l’épuisement des protéoglycanes associée à une perturbation du rése...

En raison de la taille toujours plus petite des appareils et des systèmes électroniques, le développement rapide de la technologie et des équipements micro et nano a pris de l’ampleur. L’un de ces dispositifs est la microscopie à force atomique (AFM), qui peut balayer des surfaces biologiques et récupérer des informations topographiques ou biomécaniques à l’échelle nanométrique et micrométrique 1,2. Parmi ses nombreuses fonctionnalités, cet outil peut être utilisé comme un micro- ainsi qu’un nano-pénétrateur pour obtenir des informations sur les propriétés mécaniques de divers systèmes biologiques 3,4,5,6. Les données sont collectées par contact physique avec la surface à travers une sonde mécanique, qui peut être aussi petite qu’environ 1 nm à son extrémité7. La déformation résultante de l’échantillon est alors affichée en fonction de la profondeur d’indentation de la pointe en porte-à-faux et de la force appliquée sur l’échantillon8.
L’arthrose est une maladie chronique dégénérative à long terme caractérisée par une détérioration du cartilage articulaire des articulations et des tissus environnants, ce qui peut entraîner une exposition complète des surfaces osseuses. Le fardeau de l’arthrose est considérable ; À l’heure actuelle, la moitié des femmes et un tiers des hommes âgés de 65 ans et plus souffrent d’arthrose9. Les traumatismes, l’obésité et l’altération de la biomécanique de l’articulation10 qui en résulte déterminent la dégénérescence du cartilage articulaire, qui est considérée comme un résultat final commun. L’étude pionnière de Ganz et al. a postulé que les premières étapes du processus d’arthrose peuvent impliquer les propriétés biomécaniques du cartilage11, et depuis lors, les chercheurs ont confirmé cette hypothèse12. De même, il est généralement admis que les propriétés biomécaniques du tissu sont fonctionnellement orchestrées par l’organisation ultrastructurale ainsi que par la diaphonie cellule-cellule et cellule-matrice. Toute altération peut avoir un impact considérable sur le fonctionnement biomécanique global des tissus13. À ce jour, le diagnostic d’arthrose est clinique et repose sur une radiographie sur film simple14. Cette approche est à double face : d’une part, l’absence d’un seuil dégénératif défini pour formuler le diagnostic d’arthrose rend la maladie difficile à quantifier et, d’autre part, les méthodes d’imagerie manquent de sensibilité et de standardisation et ne peuvent pas détecter les lésions cartilagineuses localisées15,16,17. À cette fin, l’évaluation des propriétés mécaniques du cartilage présente l’avantage décisif de décrire un paramètre qui change au cours de l’arthrose quelle que soit l’étiologie de la maladie et qui a une influence directe sur la fonctionnalité tissulaire à un stade très précoce. Les instruments d’indentation mesurent la force par laquelle le tissu résiste à l’indentation. En fait, il ne s’agit pas d’un concept nouveau ; Les premières études remontent aux années 1980 et 1990. Au cours de cette période, de nombreuses études ont suggéré que les instruments d’indentation conçus pour les mesures arthroscopiques du cartilage articulaire pourraient être bien adaptés pour détecter les changements dégénératifs dans le cartilage. Il y a encore 30 ans, certaines études ont pu démontrer que les instruments d’indentation étaient capables de détecter in vivo des changements à la surface du cartilage pendant la dégénérescence tissulaire en effectuant des mesures de rigidité compressive lors de l’arthroscopie18,19,20.
L’indentation AFM (AFM-IT) du cartilage articulaire fournit des informations sur une propriété mécanique essentielle du tissu, à savoir la rigidité. Il s’agit d’un paramètre mécanique qui décrit la relation entre une charge non destructive appliquée et la déformation résultante de la zone tissulaire dentelée21. L’AFM-IT s’est avérée capable de quantifier les modifications de la rigidité en fonction de l’âge dans les réseaux de collagène macroscopiquement non affectés, différenciant ainsi les changements pathologiques associés à l’apparition de l’arthrose (grade 0 sur l’échelle d’Outerbridge dans le cartilage articulaire)22. Nous avons précédemment montré que les AFM-ITs, sur la base de l’organisation spatiale des chondrocytes en tant que biomarqueur basé sur l’image pour la dégénérescence précoce du cartilage, permettent non seulement de quantifier mais aussi d’identifier les premiers changements mécaniques dégénératifs. Ces résultats ont déjà été confirmés par d’autres23,24. Par conséquent, l’AFM-IT agit comme un outil intéressant pour diagnostiquer et identifier les changements dégénératifs précoces. Ces changements peuvent déjà être mesurés au niveau cellulaire, ce qui redéfinit la compréhension du processus physiopathologique de l’arthrose.
Dans ce protocole, nous démontrons une procédure complète de classification histologique et biomécanique des explants de cartilage articulaire, de la préparation des explants de cartilage natif à l’acquisition et au traitement des données AFM. À travers une approche étape par étape, nous montrons comment générer, classer et classer visuellement le tissu cartilagineux articulaire selon différents stades de dégénérescence au moyen d’une imagerie 2D en grande mosaïque, suivie d’indentations micro-AFM.
Même si, à l’heure actuelle, l’AFM-IT est l’un des outils les plus sensibles pour mesurer les modifications biomécaniques du cartilage7, comme toute autre technique instrumentale, elle présente des limites et des particularités pratiques25 qui peuvent conduire à une acquisition erronée des données. À cette fin, nous soumettons à un examen minutieux les problèmes les plus courants qui surviennent lors des mesures AFM des explants de cartilage et décrivons, dans la mesure du possible, comment les minimiser ou les surmonter. Il s’agit notamment des aspects topographiques des échantillons et des difficultés à les stabiliser dans un environnement compatible avec l’AFM, des particularités physiques de la surface du tissu et des difficultés qui en résultent pour effectuer des mesures AFM sur de telles surfaces. Des exemples de courbes force-distance erronées sont également présentés, en mettant l’accent sur les conditions qui peuvent les provoquer. D’autres limitations inhérentes à la géométrie de la pointe en porte-à-faux et à l’utilisation du modèle Hertz pour l’analyse des données sont également discutées.

<table><tbody><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Tête de microscopique à force atomique (AFM)&nbsp ;</td><td>CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Allemagne</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>Colle d’échantillon biocompatible&nbsp ;</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Allemagne</td><td>H000033</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Cayman, Ann Arbor, Michigan, États-Unis</td><td>14948</td><td>Coloration perméable à la membrane cellulaire, utilisée pour le tri des disques cartilagineux - imagerie en vue de dessus</td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Allemagne</td><td>SAA-SPH-5UM</td><td>Nom de fréquence : 30KHz, k : 0,2N/m, nom de longueur : 115&mu ; m, largeur nom : 40&mu ; m,&nbsp ; Géométrie : Rectangulaire, pointe cylindrique avec un 5&mu ; m rayon d’extrémité Dispositif</td></tr> de <tr><td>traitement du cartilage&nbsp ;</td><td>Fait maison&nbsp ;</td><td>n/a</td><td>Dispositif de découpe en plastique contenant des ensembles prédéfinis de caméra CDD 4mmx1mm</td></tr><tr><td>intégrée dans l’AFM</td><td>The Imaging Source Europe GmbH, Brême, Allemagne</td><td>DFK 31BF03</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CDD intégrée dans le microscope à fluorescence</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Allemagne</td><td>DFC3000G</td><td></td></tr><tr><td>Cryotome</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Allemagne</td><td>CM3050S&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Le logiciel de traitement des données pour l’AFM</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Allemagne</td><td>n/a</td><td>Version 5.0.86, peut être téléchargé gratuitement à partir du site Web suivant https://customers.jpk.com</td></tr><tr><td>Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)&nbsp ;</td><td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence (Leica DMi8)</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Allemagne</td><td>11889113</td><td></td></tr><tr><td>Support de cantiliver en bloc de verre</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Allemagne</td><td>SP-90-05</td><td>Bloc de verre extra long avec faces inclinées, spécialement conçu pour être utilisé avec le JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).</td></tr><tr><td>Microscope à contraste de phase inversé (intégré dans l’AFM)</td><td>AxioObserver D1, microscopie Carl Zeiss, Iéna, Allemagne</td><td>L201306_03</td><td></td></tr><tr><td>milieu L-15 de Leibovitz sans L-glutamine&nbsp ;</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne</td><td>F1315</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope en verre</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage Avec DAPI</td><td>ibidi GmbH, Gr&auml ; felfing, Allemagne</td><td>50011</td><td>Média de montage avec contre-coloration nucléaire DAPI (4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole) utilisée pour les disques cartilagineux&nbsp ; imagerie en vue latérale</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Chauffage de boîte de Pétri associé à AFM (Petri Dish Heater)</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Allemagne</td><td>T-05-0117</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather Medical Products, Osaka, Japon</td><td>2023-01</td><td></td></tr><tr><td>Jupe en silicone</td><td>Bruker Nano GmbH, Berlin, Allemagne</td><td>n/a</td><td>Membrane de protection en silicone (D55x0.25) qui est placée sur la base de la base du bloc de verre pour éviter la condensation moyenne dans la tête AFM.</td></tr><tr><td>Programme statistique - SPSS</td><td>IBM, Armonk, New York, États-Unis</td><td>SPSS Statistics 22</td><td>Vesion 280.0.0.0 (190)</td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire&nbsp ;</td><td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Suisse</td><td>TPP93040</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Pays-Bas</td><td>SA6255012</td><td>Milieu d’enrobage soluble dans l’eau&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

résolution de problèmes pratiques liés à la micro-indentation basée sur la microscopie à force atomique sur des explants de cartilage articulaire humain

Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants

Sans aucun doute, la microscopie à force atomique (AFM) est actuellement l’une des techniques les plus puissantes et les plus utiles pour évaluer les micro et même nano-signaux dans le domaine biologique. Cependant, comme pour toute autre approche microscopique, des défis méthodologiques peuvent survenir. En particulier, les caractéristiques de l’échantillon, la préparation de l’échantillon, le type d’instrument et la sonde d’indentation peuvent entraîner des artefacts indésirables. Dans ce protocole, nous illustrons ces problèmes émergents sur des explants de cartilage articulaire sains et arthrosiques. À cette fin, nous montrons d’abord par une approche étape par étape comment générer, classer et classer visuellement des disques cartilagineux articulaires ex vivo selon différents stades de dégénérescence au moyen d’une grande imagerie par fluorescence en mosaïque 2D des explants de tissus entiers. La principale force du modèle ex vivo est qu’il comprend du cartilage humain natif et âgé qui permet d’étudier les changements liés à l’arthrose, de l’apparition précoce à la progression. En outre, les pièges courants dans la préparation des tissus, ainsi que la procédure AFM proprement dite ainsi que l’analyse des données ultérieure, sont également présentés. Nous montrons comment des étapes basiques mais cruciales telles que la préparation et le traitement des échantillons, les caractéristiques topographiques des échantillons causées par une dégénérescence avancée et l’interaction entre l’échantillon et la pointe de l’échantillon peuvent avoir un impact sur l’acquisition des données. Nous soumettons également à un examen minutieux les problèmes les plus courants de l’AFM et décrivons, dans la mesure du possible, comment les surmonter. La connaissance de ces limites est de la plus haute importance pour l’acquisition et l’interprétation correctes des données et, en fin de compte, l’intégration des résultats dans un contexte scientifique plus large.

À l’aide d’un dispositif de coupe fabriqué par nos soins, nous avons pu explanter et générer de petits disques cartilagineux (4 mm x 1 mm) à partir de condyles humains frais contenant un seul motif spatial cellulaire30 de cordes simples (SS, Figure 2A), de cordes doubles (DS), de petits amas (SC), de grands amas (BC ; Figure 2A) et diffuse (Figure 2B). Un explant de cartilage représentatif est représenté à <s...

Nous présentons une approche étape par étape pour identifier et résoudre les problèmes les plus courants associés aux micro-indentations de la microscopie à force atomique. Nous illustrons les problèmes émergents sur les explants de cartilage articulaire humain natif caractérisés par divers degrés de dégénérescence induite par l’arthrose.

Résolution de problèmes pratiques liés à la micro-indentation basée sur la microscopie à force atomique sur des explants de cartilage articulaire humain

Without a doubt, atomic force microscopy (AFM) is currently one of the most powerful and useful techniques to assess micro and even nano-cues in the ...

L’objectif de ce protocole était de créer un modèle in vitro pour étudier les propriétés mécaniques du cartilage articulaire au cours de l’apparition et de la progression de l’arthrose. Le principal avantage de la technique actuelle est que les explants de cartilage sont faciles à générer et très représentatifs du cartilage d’âge natif. Ce modèle peut être utilisé pour analyser et surveiller diverses approches arthrosiques, diagnostiques et thérapeutiques au niveau biomécanique.Pour commencer, coupez le cartilage de l’os à l’aide d’un scalpel. À l’aide d’un poinçon de biopsie, générez des disques de quatre millimètres de diamètre. Placez le disque sur un dispositif de coupe sur mesure.À l’aide d’une spatule, fixez et stabilisez le disque cartilagineux. Coupez le disque cartilagineux avec une lame de rasoir. À l’aide d’une spatule, récupérez le disque et placez-le dans un tube de 1,5 millilitre.Pour rester dans les échantillons de cartilage, ajoutez 130 microlitres de colorant de fluorescence perméable aux cellules à chaque puits de la plaque à 96 puits et répartissez le disque sur la plaque comme un disque par puits. Placez la plaque à 96 puits sur le support de plaque du microscop

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La biomécanique tissulaire est importante pour maintenir la forme et la fonction des cellules et pour déterminer le phénotype. Ce rapport fait la démonstration de protocoles mécaniques non destructifs pour caractériser les propriétés élastiques et viscoélastiques des tissus mous humains, qui peuvent être directement appliqués sur des substrats issus de l’ingénierie tissulaire pour permettre une correspondance étroite des matériaux modifiés avec les tissus natifs.

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Un expérimental et Finite Element Protocole pour Enquêter sur la transport des solutés neutres et chargés dans Cartilage Articulaire

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Visualisation en temps réel et l’analyse des chondrocytes blessures résultant d’un chargement mécanique des explants de Cartilage Murine Intact

Sonder pendant la chirurgie d’arthroscopie est normalement fait pour évaluer l’état du tissu mou, mais cette approche a toujours été subjective et qualitative. Ce rapport décrit un dispositif de sondage qui peut mesurer la résistance du tissu mou quantitativement avec un capteur de force tri-axial pendant l’arthroscopie.

Un dispositif de sondage pour mesurer quantitativement les propriétés mécaniques des tissus mous pendant l’arthroscopie

Nous présentons une méthode pour étudier les changements ostéoarthritiques tôt au niveau cellulaire dans le cartilage articulaire en utilisant la microscopie de force atomique (AFM).

Application de la microscopie de force atomique pour détecter l’arthrose précoce

Ce protocole décrit la préparation, les essais biotribologiques et l’analyse des cylindres ostéochondral glissant contre le matériel d’implant métallique. Les mesures des résultats incluses dans ce protocole sont l’activité métabolique, l’expression des gènes et l’histologie.

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Dans ce protocole, nous montrons comment préparer le tissu axolotl pour la microscopie à force atomique (AFM) et effectuer des mesures d’indentation dans le cartilage des membres intact et en régénération.

Mesures par microscopie à force atomique du cartilage dans des membres axolotls intacts et en régénération

Ce protocole visualise comment préparer des cryosections de tissu pulmonaire murin, effectuer des expériences de carte de force de microscopie à force atomique et analyser les données pour déterminer le module de Young de la membrane basale pulmonaire murine native.

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Apprenez la micro-indentation par microscopie à force atomique sur des explants de cartilage articulaire humain. Ce protocole permet d'étudier les propriétés mécaniques du cartilage et la progression de l'arthrose.

Résolution de problèmes pratiques liés à la micro-indentation basée sur la microscopie à force atomique sur des explants de cartilage articulaire humain (Vidéo) | JoVE Journal

Résolution de problèmes pratiques liés à la micro-indentation basée sur la microscopie à force atomique sur des explants de cartilage articulaire humain

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