Résolution de problèmes pratiques liés à la micro-indentation basée sur la microscopie à force atomique sur des explants de cartilage articulaire humain

L’objectif de ce protocole était de créer un modèle in vitro pour étudier les propriétés mécaniques du cartilage articulaire au cours de l’apparition et de la progression de l’arthrose. Le principal avantage de la technique actuelle est que les explants de cartilage sont faciles à générer et très représentatifs du cartilage d’âge natif. Ce modèle peut être utilisé pour analyser et surveiller diverses approches arthrosiques, diagnostiques et thérapeutiques au niveau biomécanique.

Pour commencer, coupez le cartilage de l’os à l’aide d’un scalpel. À l’aide d’un poinçon de biopsie, générez des disques de quatre millimètres de diamètre. Placez le disque sur un dispositif de coupe sur mesure.

À l’aide d’une spatule, fixez et stabilisez le disque cartilagineux. Coupez le disque cartilagineux avec une lame de rasoir. À l’aide d’une spatule, récupérez le disque et placez-le dans un tube de 1,5 millilitre.

Pour rester dans les échantillons de cartilage, ajoutez 130 microlitres de colorant de fluorescence perméable aux cellules à chaque puits de la plaque à 96 puits et répartissez le disque sur la plaque comme un disque par puits. Placez la plaque à 96 puits sur le support de plaque du microscope à fluorescence. Sélectionnez le filtre de fluorescence approprié et l’objectif.

Positionnez l’objectif sous le puits présélectionné contenant du cartilage individuel. Concentrez-vous sur le disque pour voir le motif cellulaire. Sélectionnez la fonction de navigation pour obtenir une vue d’ensemble de l’ensemble du puits.

Utilisez le bouton gauche de la souris et faites-le glisser pour naviguer vers une autre position de scène. Sélectionnez un carré qui englobe la zone d’intérêt à numériser. Sélectionnez l’option de point de mise au point de la carte du logiciel, puis sélectionnez chaque tuile individuelle en cliquant avec le bouton gauche de la souris au centre de celle-ci.

Sélectionnez l’option Focus map dans la fenêtre qui s’affiche avec toutes les tuiles précédemment sélectionnées. Double-cliquez sur une vignette pour l’afficher et la mettre au point. Ensuite, cliquez sur Z pour enregistrer le plan focal et passer à la vignette suivante.

Après avoir ajusté le plan focal pour chaque tuile individuelle, commencez l’acquisition de l’image en appuyant sur démarrer la numérisation. Fixez chaque disque cartilagineux présélectionné contenant un motif cellulaire dans des boîtes de Pétri en ajoutant suffisamment de colle biocompatible sur les côtés supérieur, inférieur, gauche et droit du disque. Recouvrez les disques de 2,5 millilitres de milieu Leibovitz sans L-glutamine.

Positionnez la boîte de Pétri dans le porte-échantillon de l’appareil AFM. Pour calibrer le porte-à-faux AFM, placez-le sur la surface du porte-à-faux de la brique de verre de manière à ce qu’il repose sur le plan optique poli au centre de la brique de verre. Abaissez le porte-à-faux par pas de 100 micromètres à l’aide de la fonction de moteur pas à pas jusqu’à ce qu’il soit complètement immergé dans le fluide.

Pour identifier le site de mesure du cartilage souhaité, commencez une approche par scanner avec le porte-à-faux sur une zone propre et sans échantillon de la boîte de Pétri. Rétractez ensuite le porte-à-faux à 1,5 millimètre du bas de la plaque. Passez de la vue fond clair à la vue fluorescence et identifiez visuellement le haut du disque.

Déplacez le porte-échantillon AFM d’exactement deux millimètres vers le milieu du disque. Exécutez une approche de scanner pour atteindre la surface du disque cartilagineux et rétractez le porte-à-faux de 100 micromètres. Pour générer une courbe de distance de force, concentrez-vous sur les cellules positionnées dans le site de mesure souhaité.

Cliquez sur le bouton Exécuter pour démarrer les mesures et acquérir cinq courbes de distance de force sur chaque site de mesure. Enregistrez les courbes une fois qu’elles sont inspectées. Pour estimer les modules de Young, à l’aide de l’option Ouvrir un lot de courbes de spectroscopie, ouvrez les courbes de distance de force générées à analyser.

Sélectionnez le modèle Hertz-fit, puis l’option d’élasticité-ajustement. Visualisez et documentez ensuite le module de Young. Adaptez en utilisant le coefficient de poisson de 0,5 et le rayon de pointe en porte-à-faux approprié.

Ensuite, vérifiez visuellement l’ajustement de la courbe de distance de force pour vous assurer de son exactitude. Pour la détermination de la profondeur d’indentation, ouvrez chacune des courbes de distance de force générées dans le logiciel d’analyse de données et sélectionnez le modèle d’ajustement de Hertz comme processus d’analyse. Appliquez l’option Soustraire le décalage de la ligne de base à la mise à zéro de l’axe de déviation verticale et sélectionnez la fonction Décalage plus inclinaison.

Utilisez la fonction de recherche de point de contact pour identifier automatiquement le point de contact. À l’aide de la fonction de position verticale de la pointe, soustrayez la distance en tenant compte uniquement de la déviation en porte-à-faux de la hauteur piézoélectrique brute pendant l’indentation. Sélectionnez l’option d’ajustement de l’élasticité pour afficher la courbe de distance de force traitée.

Sélectionnez ensuite la zone du graphique de manière à ce qu’elle s’aligne avec la valeur la plus négative sur l’axe vertical de la position de la pointe. Dans l’onglet des paramètres de la zone XMIN, lisez et documentez l’indentation. Les disques contenant des cordes simples ont montré des valeurs de rigidité plus élevées avec une médiane de 2,6 kilo pascals, ce qui est représentatif de zones cartilagineuses saines et non compromises.

Avec l’apparition et la progression de l’arthrose, les mesures de l’AFM ont montré une forte diminution progressive de la rigidité de 42 % dans les cordes doubles, de 77 % dans les petites grappes et, finalement, de 88 % dans les stades avancés représentés par de grandes grappes. Les disques contenant un motif diffus se sont affichés dans une élasticité élevée avec une variation importante des valeurs individuelles du module de Young. Pour tous les disques cartilagineux auxquels on a assigné une organisation cellulaire prédominante, la profondeur d’indentation associée au point de consigne utilisé s’est avérée inversement proportionnelle à la rigidité.

Les artéfacts observés dans les courbes de distance de force générées indiquent soit un contact sous-optimal entre le porte-à-faux de l’AFM et la surface du cartilage, soit une mauvaise fixation de l’échantillon à la boîte de Pétri. Nos explants de cartilage peuvent être traités et analysés à l’aide d’une variété de techniques de biologie moléculaire telles que l’analyse des protéines via eliza, l’immunomarquage, le moding occidental ou l’analyse génique par PCR. Cette méthode peut être utilisée pour étudier l’impact direct de nouvelles thérapies sur le cartilège articulaire et peut aider les chercheurs à obtenir des informations importantes sur les mécanismes potomanes de l’arthrose.