Identification et isolement de progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements et unités formant colonies à partir de tissus murins par cytométrie en flux

Ce protocole permet l’identification et l’isolement des progéniteurs érythroïdes BFU-E et CFU-E directement à partir de tissus de souris fraîchement récoltés comme la moelle osseuse et la rate. En utilisant cette technique, nous pouvons isoler des populations pures de progéniteurs érythroïdes, ce qui n’était pas possible avec les protocoles d’écoulement précédents. Cette méthode améliore considérablement notre capacité à étudier des modèles murins de maladies érythroïdes en permettant l’isolement des progéniteurs pour de nombreuses expériences en aval.

Pour commencer, placez les fémurs et le tibia fraîchement disséqués directement dans un tampon de coloration à froid ou SB-5 et gardez les tubes sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à extraire la moelle osseuse. Placez un mortier stérilisé propre sur de la glace dans un seau et transférez les os dans le mortier. À l’aide des ciseaux à dissection, coupez environ 1 millimètre des extrémités de chaque os.

Utilisez une seringue de 3 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 26 contenant du SB-5 pour rincer la moelle des os et la recueillir dans le mortier et répétez le processus 3 à 5 fois en utilisant un tampon frais à chaque fois jusqu’à ce que les os apparaissent incolores. Filtrez la moelle rincée à travers un maillage de 100 micromètres et recueillez les cellules dans un tube centrifuge de 50 millilitres placé sur de la glace. Ensuite, utilisez le mortier et le pilon pour écraser les os rincés dans 5 à 10 millilitres de SB-5.

Filtrer le mélange d’os broyés et tamponner à travers la crépine cellulaire de 100 micromètres pour le mettre en commun avec les cellules précédemment collectées. Installez un filtre maillé de 100 micromètres sur un tube centrifuge vide de 50 millilitres placé sur de la glace. Placez une seule rate sur le filtre à mailles et ajoutez 0,5 à 1 millilitre de SB-5 à la rate pour vous assurer qu’elle ne sèche pas.

À l’aide du côté en caoutchouc d’un piston de seringue de 3 ou 5 millilitres, écrasez la rate à travers le treillis. Ajouter plus de SB-5, 5 millilitres à la fois, et continuer à écraser jusqu’à ce que toutes les cellules aient été collectées dans le tube. Préparer une suspension unicellulaire en pipetant de haut en bas les cellules collectées avec 2 millilitres de SB-5 à l’aide d’une grande pointe d’orifice.

Colorer les contrôles de fluorescence moins un ou FMO en ajoutant tous les anticorps sauf l’anticorps homonyme du FMO à la suspension cellulaire dans le tube FACS. Pour colorer les témoins monocolores, ajoutez un seul anticorps à la suspension cellulaire dans le tube FACS. Vortex chaque tube de contrôle pendant 2 à 3 secondes à 3000 tr / min, puis incuber à 4 degrés Celsius en se balançant pendant 2,5 heures dans l’obscurité.

Après l’incubation, lavez les cellules avec SB-5 et comportez le volume de la suspension cellulaire à 4 millilitres avec SB-5. Faites tourner les cellules à 900 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius et aspirez le surnageant. Re-suspendez les commandes non tachées et toutes les commandes unicolores dans 300 microlitres de SB-5 et filtrez à travers un treillis filtrant de 40 micromètres dans de nouveaux tubes FACS.

Fabriquer une solution DAPI SB-5 en diluant le stock DAPI dans un rapport de 1 à 10 000 dans SB-5. Re-suspendez le FMOS dans 1,8 millilitre de DAPI SB-5 et DAPI monocolore contrôle dans 300 microlitres de DAPI SB-5, puis filtrez-les à travers un treillis filtrant de 40 micromètres dans de nouveaux tubes FACS. Après avoir ajouté le mélange principal d’anticorps à chaque échantillon, vortex des tubes pendant 2 à 3 secondes à 3000 tr/min suivi d’une incubation à 4 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 2,5 heures dans les conditions de bascule.

Après avoir lavé les cellules comme démontré précédemment, remettre les échantillons en suspension dans 1,8 millilitre de DAPI SB-5 et filtrer à travers un filtrage de 40 micromètres dans un nouveau tube FACS et analyser les échantillons à l’aide d’un cystomètre. Utilisez la dispersion vers l’avant pour éliminer les débris en fonction de leur taille, puis utilisez l’histogramme de la hauteur de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion vers l’avant pour exclure les agrégats de cellules et sélectionner des cellules individuelles. Répétez l’exclusion avec l’histogramme de la hauteur de diffusion latérale par rapport à la zone de diffusion latérale.

Excluez les cellules mortes en bloquant les cellules positives pour DAPI. Sélectionnez la lignée négative TUR one 19 cellules positives de kit négatif. Et parmi ceux-ci, sélectionnez une sous-population qui exprime la DC 55.

Subdiviser la lignée négative TUR one 19, kit négatif, positif, CD 55 cellules positives en 2 populations principales, P six et P sept basées sur l’expression de CD 49 F et CD 1 0 5. Maintenant basé sur l’expression de DC 150 et DC 41, subdiviser P 6 en P 3, P 4 et P 5. De même, sur la base de l’expression de la DC 150 et de la DC 71, subdiviser P 7 en BFUE, CFUE précoce et CFUE tardive.

Dans la présente étude, des unités d’éclatement et de formation de colonies ont été identifiées à partir des cellules de moelle osseuse et de rate fraîchement récoltées. Après 72 heures d’érythropoïétine, ou injection de véhicule chez les souris, la stimulation de l’érythropoïétine a montré une expansion de la colonie précoce et tardive formant des populations unitaires P 1 faible et P 1 élevée dans les cellules de moelle osseuse et de rate récoltées. La réponse des progéniteurs de la moelle osseuse et de la rate à l’érythropoïétine in vivo a également montré un nombre plus élevé de cellules dans les colonies précoces et tardives formant des populations unitaires P 1 faible et P 1 élevée, par rapport au contrôle du véhicule.

Il est très important de générer une suspension unicellulaire avant de marquer les cellules avec des anticorps. Cela peut être réalisé en pipetant de haut en bas à plusieurs reprises et en incluant l’EDTA dans le tampon. Les progéniteurs purifiés peuvent être utilisés pour toute analyse cellulaire et moléculaire en aval.

Par exemple, la transcriptomique unicellulaire, l’atesque, les tests de colonies et la biochimie. Cette technique nous a aidés à tester les prédictions d’expériences de séquençage d’ARN unicellulaire.