Name: Modèle animal de poisson zèbre pour l’étude des réactions allergiques en réponse aux biomolécules de salive des tiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Découvrez un modèle de poisson zèbre pour étudier les réactions allergiques au syndrome alpha-Gal. Cette méthode reproduit les comportements humains et les réponses immunitaires à la salive de tique.

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Nous tenons à remercier les membres du groupe SaBio pour leur collaboration dans la conception expérimentale et l’assistance technique avec l’installation expérimentale sur les poissons et Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Espagne) pour avoir fourni le poisson zèbre. Ce travail a été soutenu par Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Espagne et EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras est financée par le Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Espagne, subvention IJC2020-042710-I.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Castille-La Manche dans le cadre de l’étude « Évaluation de la réponse immunitaire au vaccin inactivé contre M. bovis et provocation avec M. marinum dans le numéro de modèle du poisson zèbre PR-2017-05-12 ».
Les tiques ont été obtenues à partir de la colonie de laboratoire, où des échantillons représentatifs de tiques de la colonie ont été testés par PCR pour les agents pathogènes communs des tiques afin de confirmer l’absence d’agents pathogènes, et conservés à l’Institut de parasitologie, Centre de biologie de l’Académie tchèque des sciences (IP BC CAS), République tchèque.Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément à la loi sur la protection des animaux de la République tchèque n ° 246/1992 Sb (approbation éthique n ° 34/2018).
1. Traitement du poisson zèbre
NOTE: L’essai est conçu pour évaluer les réactions allergiques et la réponse immunitaire chez le poisson zèbre traité avec de la salive de tique en réponse à la consommation de viande de mammifère.
<ol><li>Traiter le poisson (comme expliqué à la rubrique 4) avec de la salive de tique, Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) commerciale (voir le tableau des matières), utilisée comme témoin positif, avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme témoin négatif. Le poisson-zèbre adulte est réparti au hasard en trois groupes équilibrés entre les sexes (figure 1). REMARQUE : Tout autre composé souhaité lié à l’AGS peut être évalué à l’aide de ce modèle.</li>
</ol>2. Extraction de la salive des tiques Ixodes ricinus 
<ol><li>Utilisez des tiques femelles semi-engorgées exemptes d’agents pathogènes nourries pendant 6-7 jours sur des cobayes.</li>
	<li>Traiter la tique avec 5 μL d’une solution à 2 % (poids/vol) de chlorhydrate de pilocarpine dans du PBS (voir le tableau des matières) à pH 7,4 dans l’hémocèle à l’aide d’une seringue de 50 μL avec une aiguille de 0,33 mm, comme décrit précédemment28 , pour induire la production de salive de tiques. REMARQUE: Les tiques sont manipulées à l’aide de forceps; Faites attention à ne pas appliquer trop de force lorsque vous les saisissez.</li>
	<li>Recueillir la salive à l’aide d’un embout de 10 μL monté sur une micropipette.<ol><li>Introduisez soigneusement l’embout à l’intérieur de l’hypostome de la tique.</li>
		<li>Conservez la salive dans un tube de 1,5 ml sur de la glace, mettez-la en piscine et conservez-la à -80 °C comme décrit précédemment27.</li>
	</ol></li>
	<li>Déterminer la concentration en protéines salivaires, pour établir la quantité de protéines à injecter dans le poisson comme dans les études précédentes27 à l’aide d’une trousse de dosage des protéines BCA (voir le tableau des matériaux) en suivant les recommandations du fabricant.</li>
</ol>3. Entretien du poisson zèbre
<ol><li>Maintenir le poisson zèbre dans un système d’eau à écoulement continu à 27 °C avec un cycle lumière/obscurité de 14 h/10 h (figure 2).</li>
	<li>Nourrissez les poissons deux fois par jour à 9 h 30 et à 13 h 30 avec des aliments secs pour poissons (50 à 70 μg/poisson) jusqu’au jour 2.</li>
	<li>Nourrir les poissons deux fois par jour à 9 h 30 et 13 h 30 avec des aliments secs pour chiens (50-70 μg/poisson) du jour 2 après l’injection de traitement jusqu’à la fin de l’expérience</li>
</ol>4. Injection de poisson zèbre
<ol><li>Sélectionnez 10 poissons par groupe avec un ratio femelles/mâles similaire et un poids similaire. REMARQUE : Le groupe 1 contient les poissons injectés avec du PBS, le groupe 2 contient les poissons injectés avec de la salive de tique et le groupe 3 contient les poissons injectés avec du α-Gal.</li>
	<li>Anesthésier brièvement le poisson par immersion dans du méthanesulfonate de tricaïne à 0,02 % (MS-222) (film 1). REMARQUE: Les poissons correctement anesthésiés montrent une respiration normale et aucune baignade, alors qu’ils pourraient être placés au fond du réservoir d’eau ou flottants. Chaque poisson doit être anesthésié individuellement pour éviter d’éventuels dommages physiologiques.</li>
	<li>Capturez les poissons anesthésiés à l’aide d’un filet de pêche.</li>
	<li>Placez le poisson sur sa moitié latérale à l’aide d’une pince ou des mains avec précaution, sur une éponge humide, avec la nageoire caudale du côté droit pour injecter les composés dans le même sens afin de contrôler les lésions.</li>
	<li>Injecter des groupes de poissons par voie intradermique, comme dans les études précédentes26, dans le muscle à 5 mm de la nageoire caudale et à un angle de 45° par rapport au corps du poisson (Film 2). Utiliser le traitement approprié aux jours 0, 3 et 8 tel que décrit précédemment 27 avec une seringue de 100 μL munie d’une aiguille de 1 cm, 29 G contenant 1 μL (avec 9 μg/μL de protéines) de salive d’I. ricinus dans 10 μL de PBS (salive de tiques), 5 μg de α-Gal dans 10 μL de PBS (α-Gal)27,  et 10 μL de PBS (figure 3). REMARQUE : La manipulation doit être effectuée rapidement et avec soin afin d’éviter tout dommage physique à l’animal. D’autres biomolécules dans la salive des tiques peuvent être évaluées en suivant ce protocole.</li>
	<li>Replacez le poisson traité dans un réservoir d’eau douce sans anesthésie pour la récupération. NOTE: Tous les poissons du même groupe peuvent être placés dans le même réservoir d’eau pour récupération.</li>
</ol>5. Alimentation du poisson zèbre
<ol><li>Écrasez la nourriture pour chiens avec un mortier et un pilon.</li>
	<li>Nourrir 50 à 70 μg/poisson deux fois par jour à 9 h 30 et à 13 h 30 avec des aliments secs pour poissons jusqu’au jour 2.</li>
	<li>Nourrir 50 à 70 μg/poisson deux fois par jour à 9 h 30 et à 13 h 30 avec de la purée pour chiens du jour 2 après l’injection de traitement jusqu’à la fin de l’expérience le jour 8. REMARQUE : Si les marqueurs d’immunité ou les titres d’anticorps dirigés contre les anticorps α-Gal ou IgE en réponse aux traitements ou à l’alimentation tout au long des différentes inoculations doivent être évalués, l’alimentation serait nécessaire jusqu’à la fin de l’expérience.</li>
</ol>6. Évaluation des réactions allergiques, des lésions et du comportement chez le poisson zèbre
<ol><li>Examiner les réactions allergiques de type hémorragique (rougeur de la peau, décoloration et hémorragie) à l’aide d’une loupe ou d’un stéréomicroscope pour en vérifier l’exactitude et indiquer l’emplacement de leur apparence sur le poisson en suivant la catégorisation incluse dans le tableau 1 (figure 4A). REMARQUE : Les réactions allergiques présentées à la figure 4 sont apparues après l’injection de salive de tique et la consommation d’aliments contenant de la viande rouge. Par conséquent, les réactions décrites sont le type de réactions associées à l’AGS, car des réactions similaires apparaissent dans le contexte clinique.<ol><li>Observez si une réaction apparaît après les traitements et lors de l’administration de nourriture deux fois par jour pendant que les poissons sont dans le réservoir d’eau.</li>
	</ol></li>
	<li>Examiner le comportement des poissons en évaluant les changements27 dans les habitudes de nage (mobilité, vitesse, immobile au fond du réservoir d’eau et nage en zigzag) en suivant la catégorisation incluse dans le tableau 1.</li>
	<li>Évaluer la mortalité accumulée, en indiquant le nombre de poissons morts, y compris l’heure et le jour de la mort (figure 4B). REMARQUE : Tous les paramètres sont évalués juste après le traitement ou après le changement d’aliment et suivis quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérience, le jour 8, catégorisant les variables qualitatives (tableau 1). À titre de recommandation, cette évaluation devrait être menée par un professionnel ayant des connaissances sur le poisson zèbre pour envisager des changements de comportement en fonction de ses antécédents et de son expérience de travail avec ce modèle animal.</li>
	<li>Calculez le nombre de poissons-zèbres par jour avec les réactions allergiques signalées, les comportements anormaux et les changements d’alimentation dans chaque groupe et comparez les groupes par un test ANOVA unidirectionnel.</li>
</ol>7. Prélèvement d’échantillons
<ol><li>Euthanasier le poisson par immersion dans du MS-222 à 0,04 % le jour 8. REMARQUE: Prélevez également les échantillons des poissons qui meurent de réactions allergiques pendant l’essai.</li>
	<li>Fixez le poisson sur une assiette de paraffine avec des épingles.</li>
	<li>Prélever le sérum des vaisseaux de sang branchial29 des poissons immédiatement après l’euthanasie, lorsque les branchies sont encore irriguées avec du sang, à l’aide d’une seringue de 0,5 mL munie d’une aiguille de 1 cm de29 G. Conservez-le dans un tube de 1,5 mL à -20 °C jusqu’à utilisation (Film 3).</li>
	<li>Couper le poisson sagittalement avec une lame de scalpel et évaluer les lésions internes (lésions hémorragiques ou granulomes)27,30 si elles apparaissent. REMARQUE: Les lésions n’apparaissent pas nécessairement, mais doivent être enregistrées si elles le font.</li>
	<li>Prélever l’intestin (film 4) et le rein (film 5) de chaque poisson dans des tubes vides séparés de 1,5 mL, comme décrit précédemment31, et les conserver à -80 °C (figure 4C).</li>
	<li>Extraire l’ARN total des échantillons d’intestin et de rein du poisson zèbre à l’aide d’une trousse de purification de l’ARN (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Analyser l’expression des gènes liés à la réponse immunitaire telle que décrite précédemment30,32 (voir le tableau 2 pour les séquences d’amorce) chez le poisson zèbre, en effectuant une réaction en chaîne quantitative de transcription inverse-polymérase (RT-qPCR) en utilisant un mélange de transcription inverse pour RT-qPCR (voir le tableau des matériaux), conformément aux instructions du fabricant. Normaliser les valeurs cT de l’ARNm par rapport à D. rerio GAPDH et comparer entre les groupes (poissons traités avec de la salive, α-Gal et les groupes traités par PBS) à l’aide d’un test t de Student avec une variance inégale.</li>
	<li>Déterminer les titres d’anticorps IgM qui reconnaissent le α-Gal chez le poisson zèbre dans les échantillons de sérum par ELISA, comme décrit précédemment27,30. Enregistrer les titres d’anticorps sous forme de valeurs O.D.450 nm, à l’aide d’un lecteur de plaque, et comparer entre les groupes (poissons traités avec de la salive, α-Gal et les groupes traités PBS) à l’aide d’un test t de Student avec une variance inégale. REMARQUE : La détermination des titres d’anticorps IgM et l’analyse des gènes d’expression sont facultatives et ne sont effectuées que si des informations immunologiques sont requises. Le mélange RT-qPCR est un kit de synthèse d’ADNc premier brin pour l’analyse de l’expression génique à l’aide de la qPCR en temps réel.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le poisson zèbre est un modèle rentable et facile à manipuler qui a également été un outil très pratique pour l’étude des mécanismes moléculaires de la réponse immunitaire, des maladies pathogènes, des tests de nouveaux médicaments, de la vaccination et de la protection contre les infections33,34,35. L’étude sur le comportement du poisson zèbre est utile car des études antérieures ont montré que certaines espèces de poissons res...

Les tiques sont des vecteurs d’agents pathogènes qui causent des maladies et sont également la cause de réactions allergiques, affectant la santé des humains et des animaux dans le mondeentier 1,2. Lors de l’alimentation des tiques, les biomolécules contenues dans la salive des tiques, en particulier les protéines et les lipides, facilitent l’alimentation de ces ectoparasites, évitant ainsi les défenses de l’hôte3. Certaines biomolécules salivaires avec des modifications du glycane Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) entraînent la production d’anticorps IgE anti-α-Gal élevés après la piqûre de tique, seulement chez certains individus, connu sous le nom de syndrome de α-Gal (AGS)4. Il s’agit d’une maladie associée à une allergie médiée par les IgE qui peut entraîner une anaphylaxie aux piqûres de tiques, à la consommation de viande de mammifères non primates et à certains médicaments tels que le cétuximab5. Les réactions au α-Gal sont souvent graves et peuvent parfois être fatales 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Le α-Gal se trouve chez tous les mammifères, à l’exception des singes de l’Ancien Monde, des singes et des humains qui n’ont pas la capacité de synthétiser α-Gal13. Cependant, les agents pathogènes tels que les bactéries et les protozoaires expriment ce glycane à leur surface, ce qui peut induire la production de grandes quantités d’anticorps IgM/IgG anti-α-Gal et peut constituer un mécanisme de protection contre ces agents pathogènes16,17. Cependant, la production d’anticorps anti-α-Gal augmente le risque de développer des allergies aux anti-α-Gal médiées par les IgE 7,13. Les anticorps naturels anti-α-Gal produits chez l’homme, principalement des sous-types IgM/IgG, pourraient être associés à cette modification présente dans les bactéries du microbiote intestinal16. L’AGS peut être un diagnostic clinique difficile, car la principale méthode de diagnostic à l’heure actuelle est basée sur des antécédents cliniques de réactions allergiques retardées, en particulier associées à des allergies alimentaires (c.-à-d. prurit, urticaire localisé ou œdème de Quincke récurrent à l’anaphylaxie, à l’urticaire et aux symptômes gastro-intestinaux) et la mesure des taux d’anticorps IgE anti-α-Gal9. Les résultats actuels suggèrent que les piqûres de tiques constituent l’un des principaux risques liés à l’apparition d’AGS 18,19, à une augmentation de 20 fois ou plus des taux d’IgE à α-Gal après une piqûre de tique 19, à des antécédents de piqûres de tiques chez les patients atteints d’AGS20,21,22, à l’existence d’anticorps réactifs aux antigènes à tiques chez les patients atteints d’AGS 19, et que les IgE anti-α-Gal sont fortement liées aux taux d’IgE anti-tiques19,23, mais que d’autres études sont nécessaires pour évaluer quelles biomolécules sont réellement impliquées.
En outre, un autre scénario possible est celui des patients qui présentent de fortes réactions allergiques aux piqûres de tiques et des taux élevés d’anticorps anti-α-Gal IgE, mais qui sont tolérants à la consommation de viande de mammifères12. Par conséquent, l’allergie à la viande chez les mammifères pourrait être un type particulier d’allergie liée aux piqûres de tiques. Les principales espèces de tiques associées à l’AGS sont Amblyomma americanum (États-Unis), Amblyomma sculptum (Brésil), Amblyomma testudinarium et Haemaphysalis longicornis (Japon), Ixodes holocyclus (Australie) et Ixodes ricinus (principal vecteur de la borréliose de Lyme en Europe )11,24. 
Le seul modèle qui a été utilisé pour évaluer la production d’IgE liée aux piqûres de tiques est le modèle murin génétiquement modifié avec le gène de la α-1,3-galactosyltransférase assommée (α-Gal KO)25,26 parce que, comme d’autres mammifères, les souris expriment également α-Gal sur les protéines et les lipides et ne produisent pas d’IgE à α-Gal. Cependant, le poisson zèbre (Danio rerio) est un modèle utile pour la recherche biomédicale appliquée aux mammifères car il partage de nombreuses similitudes anatomiques avec les mammifères et, comme les humains, est également incapable de synthétiser α-Gal. Étant donné que le α-Gal n’est pas produit naturellement chez le poisson zèbre, il s’agit d’un modèle abordable, facile à manipuler et permettant une taille d’échantillon élevée pour l’étude des réactions allergiques liées au α-Gal.
Dans cette étude, le poisson zèbre est utilisé comme organisme modèle pour caractériser et décrire les réactions allergiques locales, les modèles comportementaux et les mécanismes moléculaires associés à la réponse à la sensibilisation percutanée à la salive des tiques26,27 et à la consommation subséquente de viande de mammifère. À cette fin, les poissons sont exposés à la salive des tiques par injection intradermique, puis sont nourris avec des aliments pour chiens, qui contiennent des produits dérivés de viande de mammifères adaptés à l’usage animal qui contiennent α-Gal27, puis les réactions allergiques connexes possibles sont évaluées. Cette méthode peut être appliquée à l’étude d’autres biomolécules liées aux processus allergiques, en particulier ceux liés à l’AGS.

<table><tbody><tr><td>Tube de 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>525-0990</td><td></td></tr><tr><td>All Prep DNA/RNA</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr><tr><td>Installations</td><td></td><td></td><td></td>aquatiques</tr><tr><td>Kit de dosage des protéines BCA&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Kit de disection</td><td>VWR</td><td>631-1279</td><td></td></tr><tr><td>Nourriture pour chiens - Rouge Classic</td><td>Acana</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques ELISA-96 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10547781</td><td></td></tr><tr><td>Gala1-3Gal-BSA 3 (&alpha ;-Gal)&nbsp ;</td><td>Dextra</td><td>NGP0203</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix</td><td>Supermix 1708840</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringues d’un microlitre</td><td>Hamilton</td><td>7638-01</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>tout</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate saline tamponnée</td><td>Sigma</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>chlorhydrate de pilocarpine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P6503</td><td></td></tr><tr><td>Pointe de pipette P10&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>613-0364</td><td></td></tr><tr><td>Pointe de pipette P1000</td><td>VWR</td><td>613-0359</td><td></td></tr><tr><td>Poisson tropical alimentaire de qualité supérieure</td><td>DAPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sponge Animal Holder&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Fabriqué à partir de mousse de rebut,</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td>, <td>n’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>thermocycleur, PCR en temps réel</td><td>, n’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>méthanesulfonate de tricaïne (MS-222)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr></tbody></table>

modèle animal de poisson zèbre pour l’étude des réactions allergiques en réponse aux biomolécules de salive des tiques

Zebrafish Animal Model for the Study of Allergic Reactions in Response to Tick Saliva Biomolecules

Les tiques sont des arthropodes vecteurs qui causent des maladies par transmission d’agents pathogènes et dont les piqûres pourraient être liées à des réactions allergiques ayant un impact sur la santé humaine dans le monde entier. Chez certaines personnes, des taux élevés d’anticorps anti-immunoglobuline E dirigés contre le glycane Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) ont été induits par des piqûres de tiques. Les réactions anaphylactiques médiées par les glycoprotéines et les glycolipides contenant le glycane α-Gal, présent dans la salive des tiques, sont liées au syndrome alpha-Gal (AGS) ou à l’allergie à la viande chez les mammifères. Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un modèle vertébré largement utilisé pour l’étude de différentes pathologies. Dans cette étude, le poisson zèbre a été utilisé comme modèle pour l’étude des réactions allergiques en réponse à la consommation de viande de α-Gal et de mammifères car, comme les humains, ils ne synthétisent pas ce glycane. À cette fin, les modèles comportementaux et les réactions allergiques hémorragiques de type anaphylactique en réponse à la salive de tiques Ixodes ricinus et à la consommation de viande de mammifère ont été évalués. Cette approche expérimentale permet d’obtenir des données valides qui soutiennent le modèle animal du poisson zèbre pour l’étude des allergies transmises par les tiques, y compris l’AGS.

Le protocole présenté ici est basé sur plusieurs aspects d’expériences précédemment publiées27,30 et de résultats réalisés dans notre laboratoire où le modèle de poisson zèbre est établi et validé pour l’étude de l’AGS et de la réponse immunitaire au α-Gal car les humains et les poissons-zèbres ne synthétisent pas cette molécule13. Ce modèle permet la caractérisation et l’évaluation d’une variété de réactions allergiques résultant de la ré...

Ici, le poisson zèbre (Danio rerio) est utilisé comme modèle pour étudier les réactions allergiques et les réponses immunitaires liées au syndrome alpha-Gal (AGS) en évaluant les réactions allergiques à la salive des tiques et à la consommation de viande de mammifère.

Modèle animal de poisson zèbre pour l’étude des réactions allergiques en réponse aux biomolécules de salive des tiques

Ticks are arthropod vectors that cause disease by pathogen transmission and whose bites could be related to allergic reactions impacting human health ...

La question est de savoir pourquoi seules certaines personnes exposées aux piqûres de tiques développent des réactions allergiques. Pour nous, l’élucidation des biomolécules dans la salive des tiques et les mécanismes immunitaires impliquant ce processus est essentielle pour répondre à cette question. Le modèle animal de poisson zèbre du syndrome alpha-Gal reproduit les modèles comportementaux humains et les réactions allergiques en réponse à la salive des tiques.Cette approche expérimentale fait progresser la compréhension de l’interaction moléculaire tique-hôte dans laquelle nous avons un conflit associé au syndrome alpha-Gal et la coopération associée à la réponse anticorps à alpha-Gal, qui protègent contre l’infection pathogène. Pour traiter le poisson avec de la salive de tique, répartissez le poisson-zèbre adulte en trois groupes équilibrés entre les sexes. Utilisez le Gala1-3Gal-BSA 3 commercial ou l’alpha-Gal comme témoin positif et le PBS comme témoin négatif.Pour l’extraction de la salive, utilisez des tiques femelles semi-engorgées, exemptes d’agents pathogènes, nourries pendant six à sept jours avec des cochons d’Inde. Traiter la tique avec cinq microlitres d’une solution à 2% de chlorhydrate de pilocarpine dans PBS à pH 7,4 dans l’hémocèle à l’aide d’une seringue de 50 microlitres avec une aiguille de 0,33 millimètre. Recueillir la salive de l’hypostome des tiques à l’aide d’un embout de 10 microlitres monté sur une micropipette.Placez la salive dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace et conservez-la à moins 80 degrés Celsius. Déterminer la concentration de protéines salivaires pour établir la quantité de protéines à injecter dans le poisson à l’aide d’une trousse d’analyse des protéines BCA, en suivant les recommandations du fabricant. Maintenir le poisson zèbre dans un système d’eau à écoulement continu à 27 degrés Celsius avec un cycle lumière-obscurité de 14 à 10 heures.Ensuite, sélectionnez 10 poissons par groupe avec un ratio similaire de femelles par rapport aux mâles et un poids similaire pour l’injection. Anesthésier brièvement le poisson par immersion dans du méthanesulfonate de tricaïne à 0,02 %. Placez soigneusement le poisson anesthésié sur sa moitié du côté à l’aide d’une pince ou des mains, sur une éponge humide, avec la nageoire caudale du côté droit pour injecter les composés dans le même sens pour contrôler les lésions.Injecter des groupes de poissons par voie intradermique dans le muscle avec une seringue de 100 microlitres munie d’une aiguille d’un centimètre de calibre 29 à cinq millimètres de la nageoire caudale et à un angle de 45 degrés par rapport au corps du poisson. Après l’injection, replacez le poisson traité dans un réservoir d’eau douce sans anesthésie pour la récupération. Nourrissez les poissons deux fois par jour à 9 h 30.et 13 h 30 avec 50 à 70 microgrammes de nourriture sèche pour poissons par poisson jusqu’au deuxième jour. Ensuite, écrasez la nourriture pour chiens avec un mortier et un pilon pour nourrir le poisson du deuxième jour après l’injection du traitement jusqu’à la fin de l’expérience le huitième jour.Pour le prélèvement d’échantillons, fixez le poisson euthanasié sur une plaque de paraffine avec des épingles. Prélever le sérum des vaisseaux sanguins branchiaux du poisson lorsque les branchies sont encore irriguées avec du sang à l’aide d’une seringue de 0,5 millilitre munie d’une aiguille d’un centimètre de calibre 29. Conservez le sérum recueilli dans un tube de 1,5 millilitre à 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation.Coupez le poisson sagittalement avec une lame de scalpel et évaluez les lésions internes. Ensuite, recueillez l’intestin et le rein de chaque poisson dans des tubes séparés de 1,5 millilitre. Extraire l’ARN total de l’intestin et des reins à l’aide d’un kit de purification de l’ARN.Analyser l’expression des gènes liés à la réponse immunitaire, en effectuant une réaction quantitative en chaîne de transcription inverse-polymérase, ou RT-qPCR en utilisant un mélange de transcription inverse pour RT-qPCR, selon les instructions du fabricant. Normaliser les valeurs cT de l’ARNm contre le GAPDH du poisson zèbre et comparer entre les groupes à l’aide d’un test t de Student avec une variance inégale. Déterminer les titres d’anticorps IgM qui reconnaissent l’alpha-Gal dans les échantillons de sérum par ELISA.Enregistrez les titres d’anticorps sous forme de valeurs de densité optique de 450 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques et comparez entre les groupes à l’aide d’un test t de Student avec une variance inégale. Ce modèle de poisson zèbre permet la caractérisation et l’évaluation de diverses réactions allergiques dues à la réponse de l’hôte à la salive des tiques et à leur implication dans le syndrome alpha-Gal, ou AGS. De plus, par rapport au poisson témoin, des altérations de comportements tels que nager lentement, s’allonger sur le fond de l’aquarium et ne pas manger, vibrer ou zigzaguer ont été observées chez les poissons traités à la salive des tiques.Une incidence significative de réactions allergiques a été observée chez les poissons traités avec de la salive de tique, montrant une désensibilisation et une tolérance rapides. Le changement de comportement était plus prononcé chez les poissons traités avec de la salive de tique qu’avec de l’alpha-Gal. Une analyse supplémentaire de l’expression des marqueurs immunitaires représentatifs a été réalisée par RT-PCR.Les résultats ont montré des différences entre les groupes de poissons-zèbres dans le rein, où les marqueurs de réponse immunitaire ont été régulés à la baisse chez les poissons traités avec de la salive et de l’alpha-Gal par rapport au groupe témoin. De plus, le poisson zèbre traité avec de la salive et de l’alpha-Gal a développé des anticorps IgM contre l’alpha-Gal qui ont montré des niveaux plus élevés que chez les poissons traités avec du PBS. L’injection du traitement, l’évaluation des réactions allergiques et du comportement, et le rapport du nombre de poissons morts de réactions allergiques sont l’aspect le plus important du protocole.L’utilisation de technologies omiques au niveau de l’ARNm, des protéines et du microbiome pour caractériser la réponse à la salive des tiques nous permet d’identifier les biomolécules clés impliquées dans ce processus.

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Cet article présente la méthodologie d’exposition de l’homme à la larve d’Ixodes scapularis pour la recherche clinique. La technique est relativement simple, tolérable par les volontaires de la recherche, et peut être modifiée en fonction des besoins expérimentaux. De telles recherches impliquant des sujets humains doivent être menées selon des protocoles d’étude clinique approuvés par les autorités réglementaires compétentes.

Un modèle d’exposition expérimentale des humains aux tiques larvaires Ixodes scapularis

Ici, nous présentons un protocole pour collecter de la salive, de l’hémolymphe, des glandes salivaires et de l’intestin moyen, après la dissection d’une tique nourrie individuellement, afin d’étudier la localisation tissulaire spécifique des agents pathogènes transmis par les tiques afin de faire progresser la compréhension de la compétence des vecteurs et des interactions pathogène-microbiome.

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Découvrez un modèle de poisson zèbre pour étudier les réactions allergiques au syndrome alpha-Gal. Cette méthode reproduit les comportements humains et les réponses immunitaires à la salive de tique.

Modèle animal de poisson zèbre pour l’étude des réactions allergiques en réponse aux biomolécules de salive des tiques

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