Évaluation de la fonction biventriculaire murine ex vivo dans un modèle de Langendorff

Avec le protocole décrit, nous pouvons comparer le cœur du donneur, le ventricule gauche et la fonction du ventricule après la conservation, et nous pouvons examiner la différence de biologie de préservation dans les deux ventricules au cours de ces processus de conservation. Cette technique utilise un système de perfusion ex vivo pour examiner les fonctions cardiaques après la conservation. Il fournit des outils robustes et fiables pour dépister de nouveaux traitements afin d’améliorer les fonctions cardiaques des donneurs après conservation.

Commencez par la préparation de la pâte comme décrit dans le texte et façonnez un petit morceau de pâte en une forme ovale pour obtenir la tête. Attachez-le à l’extrémité d’un brin de spaghetti sec. Trempez la tête dans la solution de sucre déjà préparée et retirez-la lentement une fois qu’elle est bien enrobée d’une fine pellicule de solution.

Ensuite, suspendez le brin de spaghetti sur un bloc de mousse de polystyrène ou d’autres supports pour permettre la formation d’une couverture uniforme et brillante sur la tête et séchez-le toute la nuit. Le lendemain, trempez le moule dans de l’élastomère de silicone dispersé dans du xylène et replacez le brin de spaghetti dans le bloc de mousse de polystyrène à 37 degrés Celsius pendant deux heures ou jusqu’à ce qu’il soit sec. Répétez cette étape une fois de plus.

Ensuite, placez le moule dans l’eau pour séparer et recueillir le ballon. Conservez le ballon dans de l’azoture de sodium à 0,02 %. Maintenant, coupez une pointe à deux extrémités émoussées dans une aiguille de calibre 22 et montez une extrémité émoussée sur le ballon en silicone tandis que l’autre extrémité émoussée sur un tube en PE.

Utilisez une suture en soie 4-0 pour attacher le ballon en place sur l’aiguille. Prenez la souris C57Black/6 et injectez par voie intrapéritonéale 200 unités d’héparine dans l’abdomen de l’animal pour l’anticoaguler. Après avoir confirmé l’anesthésie appropriée avec un pincement de l’orteil, faites une incision juste en dessous du sternum.

Et à l’aide de ciseaux, ouvrez la poitrine en coupant le diaphragme dans les côtes. Ensuite, pliez la paroi thoracique antérieure pour exposer complètement la poitrine avant de faire une incision au niveau de l’aorte descendante près de l’arc de l’aorte. Maintenant, transférez le cœur, les poumons et le thymus de la souris dans un tampon glacé histidine-tryptophane-cétoglutarate, ou tampon HTK, pour isoler les organes.

Exposez l’aorte en enlevant tout tissu conjonctif. Connectez l’extrémité de l’aorte à une aiguille de calibre 22 et attachez-la avec une suture en soie 6-0. Assurez-vous que la canule est au-dessus de la racine aortique, afin de ne pas interférer avec la valve aortique.

Perfuser l’aorte pendant environ 10 minutes avec 10 millilitres de tampon HTK, pré-refroidi à quatre degrés Celsius. Selon le type d’expérience, conservez le cœur dans un tube de 50 millilitres avec du HTK glacé pendant huit heures ou effectuez immédiatement la profusion. Pour effectuer une profusion, connectez le cœur monté sur l’aiguille à la canule dans l’appareil Langendorff et attachez-le avec une suture en soie.

Commencez la profusion en mode de débit constant à trois millilitres par minute, puis après être passé à un mode de pression constante à 70 à 80 millimètres de mercure, ajustez le débit de perfusion à environ six millilitres par minute. Ensuite, connectez un ballon en silicone rempli d’eau dégonflé à un transducteur de pression et à une seringue remplie d’eau à l’aide d’un robinet à trois voies. Après 15 à 20 minutes d’une période d’équilibration suivant la perfusion précédente, coupez l’oreillette droite, ou PR, et insérez le ballonnet dans le ventricule droit, ou RV, à travers la PR. Utilisez du ruban adhésif pour maintenir le ballonnet à l’intérieur du VR et minimisez la zone ouverte de la PR pour aider à contraindre le ballonnet dans le ventricule.

Après 20 minutes de collecte de données fonctionnelles pour le VR, coupez l’oreillette gauche, ou LA, et insérez un ballon gonflé à l’eau dégonflé dans le ventricule gauche, ou LV, à travers le LA. Utilisez du ruban adhésif pour maintenir le ballon à l’intérieur du LV.To calibrez le transducteur de pression, remplissez d’abord une seringue de 10 millilitres avec du sérum physiologique chaud et connectez la seringue au dôme par un robinet à trois voies. Ouvrez le robinet et remplissez lentement le dôme de solution saline avant de fermer tous les robinets et de retirer la seringue. Ensuite, fixez le dôme rempli au transducteur en connectant le manomètre à la troisième extrémité du robinet à trois voies.

Dans le logiciel d’enregistrement, dans le menu déroulant du canal se connectant au transducteur, sélectionnez l’option Bridge Amp. Cliquez sur 0 avant de démarrer l’enregistrement pour régler la lecture du transducteur à zéro millimètre de mercure. Après plusieurs secondes d’enregistrement, poussez lentement la seringue et augmentez la pression à 100.

Cliquez sur Arrêter pour mettre fin à l’enregistrement. Dans la boîte de dialogue Conversion d’unités, sélectionnez la zone d’enregistrement de zéro millimètre de mercure et cliquez sur la flèche à 1 avant de taper zéro millimètre de mercure. De même, sélectionnez la zone d’enregistrement pour 100 millimètres de mercure.

Cliquez sur la flèche jusqu’à 2 et tapez 100 millimètres de mercure. Maintenant, cliquez sur OK pour calibrer le transducteur. Une fois l’étalonnage effectué, renommez le canal correspondant au transducteur de pression avec le ballonnet en Pression ventriculaire ou Pression BT, et commencez à enregistrer lorsque le cœur est connecté au système.

Après avoir inséré le ballonnet dans le ventricule, ajustez le volume d’eau dans le ballonnet à l’aide d’une seringue micrométrique à travers le robinet à trois voies pour maintenir la pression diastolique finale à cinq à 10 millimètres de mercure. Ensuite, renommez un canal vide en dP/dt et conservez le canal source dérivé en tant que pression ventriculaire. Ce canal enregistre le rapport de changement de pression dans la cavité ventriculaire pendant la contraction.

Sélectionnez la période de mesure stable avant de passer au réglage dans le module de pression artérielle. Ensuite, sélectionnez la pression BT comme canal d’entrée et cliquez sur la sélection avant d’appuyer sur OK. Maintenant, cliquez sur Affichage du classificateur pour supprimer tout cycle cardiaque aberrant, et sur Affichage de la table pour générer les tableaux de la moyenne des dP/dt maximum et des dP/dt minimum pour la période sélectionnée. Lorsque le cœur de la souris a été stocké dans un tampon HTK pendant zéro heure avant la perfusion, une pression systolique plus élevée a été enregistrée pour le VG par rapport au RV. De plus, par rapport au RV, le LV a également montré beaucoup plus de contraction musculaire, ainsi que de relaxation.

Cependant, lorsque la perfusion a été effectuée sur le cœur après l’avoir soumis à huit heures de stockage au froid, le VG et le RV ont montré une réduction fonctionnelle significative par rapport au stade zéro heure. On a observé que les diminutions étaient plus importantes dans le VG que dans le RV. La contraction et la relaxation de la LV après un stockage de huit heures étaient de 25,1 % et 30,7 % de la fonction correspondant à une pause zéro heure, tandis que le RV affichait 32,5 % et 29,1 % de fonction, par rapport à la ligne de base de zéro heure. L’indication d’un dysfonctionnement primaire du greffon du VG après un stockage prolongé était plus significative que celle du RV. La qualité de conservation dépend en grande partie de la perfusion de HTK.

Il est important de s’assurer que la perfusion est cohérente pour comparer précisément les différents traitements. Grâce à une mesure précise de la fonction de conservation du cœur d’un donneur, cette méthode peut être facilement adaptée pour cribler des médicaments susceptibles d’améliorer la fonction cardiaque du donneur, puis valider davantage à l’aide d’un modèle de greffe hétérotopique.