Dispositif de thérapie photodynamique construit en interne et à base de diodes électroluminescentes pour améliorer la cytotoxicité des vertéporfines dans un modèle de culture cellulaire 2D

La thérapie photodynamique, PDT, offre plusieurs avantages au traitement du cancer, et son efficacité dépend d’une source lumineuse pour activer un photosensibilisant. Malgré les progrès récents dans le domaine, il y a un manque d’accès à un dispositif coûteux et reproductible pour PTD pour les modèles in vitro. Afin de répondre à cette demande, ce travail décrit un dispositif nouveau, simple et peu coûteux pour effectuer des tests PDT sur des cultures cellulaires, appelé PhotoAct.

Pour commencer la construction, scie des panneaux de fibres de densité moyenne de trois millimètres d’épaisseur, MDF, pour obtenir des pièces avec les dimensions suivantes. Construisez deux boîtes avec les dimensions suivantes. Percez l’arrière de la plus grande boîte pour installer un connecteur de prise de barillet.

Percez également le haut de la plus grande boîte, le haut et le bas de la plus petite boîte pour permettre un passage aux câbles électriques. Peignez toutes les surfaces internes avec de l’encre noire pour favoriser une incidence homogène de la lumière. Fixez en parallèle trois rubans LED avec 10 LED chacun sur la surface intérieure supérieure de la plus petite boîte.

De plus, installez un capteur de luminosité au centre de la surface intérieure inférieure de la plus petite boîte. Imprimez la structure de l’unité de commande à l’aide du fichier d’impression 3D supplémentaire. Installez tous les composants, le bouton d’alimentation, les potentiomètres, le pavé tactile de démarrage de l’heure, les LED, le capteur de luminosité, l’écran LCD, le buzzer et l’alimentation, ainsi que les pièces d’une carte contrôleur ESP-32 montée à l’intérieur de l’unité de commande.

Téléchargez le code de programmation disponible dans un fichier supplémentaire et exécutez un test pour vérifier que toutes les connexions fonctionnent. Assemblez les boîtes et fixez-les ensemble pour éviter les lacunes et, par conséquent, les interférences d’éclairage externe et la perte de lumière immédiate. Fixez l’unité de commande montée à la zone percée au sommet du prototype.

Construisez une porte d’entrée du même matériau dans les dimensions suivantes et fixez-la sur la boîte extérieure avec des charnières et des rubans Velcro pour assurer la fermeture de la chambre et des tests ininterrompus. Installez également une poignée pour manipuler la porte d’entrée avec facilité et précision. Fixez quatre repose-pieds en caoutchouc au bas du prototype pour assurer une plus grande stabilité pendant les opérations.

Cultivez la lignée cellulaire HeLa dans la lignée cellulaire Eagle modifiée de Dulbecco à faible teneur moyenne en glucose avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de gentamycine. Gardez les flacons de culture à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius. Gérer et inspecter la culture cellulaire jusqu’à atteindre 80 à 90% de confluence.

Démarrez le protocole de viabilité cellulaire avec le processus d’ensemencement. Retirer le milieu de la fiole avec culture cellulaire HeLa confluente. Laver le ballon avec une solution saline tampon phosphate, PBS, et détacher la culture avec de la trypsine en suivant les détails mis en évidence.

Compter les cellules en suspension à l’aide d’un hémocytomètre et les ensemencer dans une microplaque multipuits à une concentration de 20 000 cellules par puits. Préparez deux plaques pour les conditions sombres et claires du traitement et incuberez-les pendant 24 heures pour la fixation cellulaire. Pour procéder au traitement avec un photosensibilisant, retirez le milieu des deux plaques et traitez les cellules avec 100 microlitres de concentrations croissantes de vertéporfine.

Gardez les cellules sous traitement pendant 24 heures pour permettre l’internalisation de la vertéporfine. Après l’incubation, retirez le traitement, lavez les cellules avec du PBS et ajoutez un milieu sans médicament. Couvrez une microplaque de papier d’aluminium pour la protéger de l’exposition à la lumière et incuber pendant 24 heures.

Cette microplaque offrira des données de contrôle pour une analyse plus approfondie des résultats de la PDT. L’autre microplaque sera utilisée en condition d’exposition à la lumière au PhotoAct. Pour faire fonctionner l’équipement, branchez-le dans la prise et allumez-le en appuyant sur le bouton d’alimentation.

Placez la microplaque multipuits dans la chambre PDT et fermez l’équipement en fixant la porte frontale avec les bandes velcro latérales. Pour configurer l’équipement, utilisez les potentiomètres pour ajuster la configuration RVB de l’émission lumineuse. Appuyez sur le pavé tactile plus/moins pour ajuster la configuration de l’heure et définir la durée du test.

Vérifiez si les informations correctes sur le test sont affichées sur l’écran et effectuez les derniers ajustements si nécessaire. Appuyez sur le pavé tactile de démarrage pour lancer le test. Un signal sonore à un bip doit être entendu au début de l’expérience.

Au cours de l’expérience, des informations de progression peuvent être observées à l’écran, telles que l’irradiance et le temps restant. N’ouvrez pas la porte d’entrée et ne modifiez aucune configuration pendant le test PDT. À la fin du test, un buzzer à quatre bips doit être entendu et le système électronique éteindra toutes les LED.

Un message fini et la quantité finale d’énergie expansée pendant l’expérience peuvent être observés à l’écran. La valeur finale de fluence est calculée selon l’équation mise en surbrillance. Couvrir la microplaque qui a subi une exposition à la lumière et procéder à l’incubation de 24 heures.

Après la période d’incubation, retirer le milieu des deux plaques, laver la monocouche de cellules avec du PBS et ajouter une solution de MTT. Incuber les deux plaques dans des conditions sombres et claires pendant quatre heures pour permettre la formation de cristaux de formazan. Retirez soigneusement la solution de MTT et dissolvez les cristaux violets avec une solution de DMSO et d’éthanol.

Après dissolution complète des cristaux, effectuez la mesure de l’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques à 595 nanomètres. Le produit final consiste en une chambre sombre avec sa surface intérieure supérieure équipée d’un ensemble de 30 diodes électroluminescentes diffusées, LED, programmées pour émettre des spectres distincts de lumière visible. Une incidence homogène de la lumière est établie en raison de la faible réflectivité des surfaces intérieures et de la répartition uniforme de la configuration des LED.

L’interface de configuration est conviviale et les conditions expérimentales établies étaient reproductibles. Comme preuve de concept, le dispositif a été utilisé pour améliorer l’effet cytotoxique de la vertéporfine dans la culture cellulaire HeLa 2D après une exposition à la lumière. Comme le montre la figure, la valeur GI50 était de 3,1 micromolaires pour les conditions d’éclairage.

et 13,8 micromolaires pour l’état sombre Par conséquent, l’augmentation de plus de quatre fois de l’efficacité par rapport aux conditions confirme l’utilisation de Verteporfin comme photosensibilisant et l’applicabilité de PhotoAct sur les tests PDT. Pour valider l’utilisation du prototype décrit dans ce travail, un dispositif PDT commercial a été utilisé dans les mêmes conditions expérimentales, y compris le photosensibilisant, les cellules et la fluence, et les résultats ont été comparés. Comme le montre la figure, les deux dispositifs ont photoactivé la vertéporfine de manière égale, renforçant ainsi l’effet cytotoxique.

Enfin, la mort cellulaire médiée par ROS déclenchée par la vertéporfine après exposition à la lumière a été confirmée par cytométrie en flux à l’aide du test DCFDA. En résumé, l’appareil a été facilement construit avec des composants à faible coût disponibles dans le commerce avec un coût total inférieur à 50. Les principaux autres avantages de l’appareil comprennent la portabilité, la faible demande de maintenance, la capacité d’irradier plusieurs types de plaques de culture, l’utilisation simultanée de jusqu’à quatre unités par essai, une irradiation précise et reproductible, une interface de configuration conviviale et simple qui ne nécessite pas de connexion à des ordinateurs ou à d’autres machines.

En outre, un organigramme de décision est présenté pour fournir une approche systématique de résolution de problèmes afin de trouver et de corriger les problèmes ou les erreurs pendant l’opération. Ces résultats permettent d’étendre les avantages de PhotoAct pour faciliter la PDT à la recherche scientifique, en explorant le mécanisme d’action des photosensibilisateurs et leurs applications cliniques.