Name: Mesure de la contractilité cardiaque dans des cardiomyocytes primaires humains adultes isolés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Découvrez la mesure de la contractilité cardiaque dans des cardiomyocytes primaires humains adultes isolés. Cette méthode optique non invasive avec le système MyoBLAZER permet d'évaluer les effets des médicaments en temps réel et de prédire les risques cardiaques précliniques.

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Ces travaux ont été soutenus par AnaBios Corporation et une subvention du NIH Small Business Innovation Research (SBIR) (1R44TR003162-01).

<ol><li>Abi-Gerges, N., Miller, P. E., Ghetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+heart+cardiomyocytes+in+drug+discovery+and+research%3A+new+opportunities+in+translational+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Human heart cardiomyocytes in drug discovery and research: new opportunities in translational sciences.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 21 (9), 787806(2020).</li>
<li>Cook, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+the+fate+of+AstraZeneca%27s+drug+pipeline%3A+A+five+dimensional+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five dimensional framework.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).</li>
<li>Van Meer, B. J., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+physiological+responses+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+to+drugs+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Measuring physiological responses of human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes to drugs and disease.</a> Stem Cell. 34 (8), 2008-2015 (2016).</li>
<li>Piccini, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+challenges+in+the+evaluation+of+cardiac+safety+during+drug+development%3A+translational+medicine+meets+the+critical+path+initiative%5BTitle%5D)+AND+%22American+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Current challenges in the evaluation of cardiac safety during drug development: translational medicine meets the critical path initiative.</a> American Heart Journal. 158 (3), 317-326 (2009).</li>
<li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Workshop+report%3A+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li>
<li>Page, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ex-vivo+action+potential+model+for+pro-arrhythmia+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Human ex-vivo action potential model for pro-arrhythmia risk assessment.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 183-195 (2016).</li>
<li>Britton, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+effects+of+dofetilide%2C+sotalol%2C+quinidine%2C+and+verapamil+between+human+ex+vivo+trabeculae+and+in+silico+ventricular+models+incorporating+inter-individual+action+potential+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of effects of dofetilide, sotalol, quinidine, and verapamil between human ex vivo trabeculae and in silico ventricular models incorporating inter-individual action potential variability.</a> Frontiers in Physiology. 8, 597(2017).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+recording+and+pro-arrhythmia+risk+analysis+in+human+ventricular+trabeculae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1109(2017).</li>
<li>Trovato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Purkinje+in+silico+model+enables+mechanistic+investigations+into+automaticity+and+pro-arrhythmic+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Human Purkinje in silico model enables mechanistic investigations into automaticity and pro-arrhythmic abnormalities.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 142, 24-38 (2020).</li>
<li>Otsomaa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+ORM-11372%2C+a+novel+inhibitor+of+the+sodium-calcium+exchanger+with+positive+inotropic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of ORM-11372, a novel inhibitor of the sodium-calcium exchanger with positive inotropic activity.</a> British Journal of Pharmacology. 177 (24), 5534-5554 (2020).</li>
<li>Nguyen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+primary+cardiomyocyte-based+model+for+the+simultaneous+prediction+of+drug-induced+inotropic+and+pro-arrhythmia+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adult human primary cardiomyocyte-based model for the simultaneous prediction of drug-induced inotropic and pro-arrhythmia risk.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1073(2017).</li>
<li>Abi-Gerges, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+mechanistic+profiling+of+inotropic+drugs+in+adult+human+primary+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiparametric mechanistic profiling of inotropic drugs in adult human primary cardiomyocytes.</a> Scientific Reports. 10, 7692(2020).</li>
<li>Jordaan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiotoxic+potential+of+hydroxychloroquine%2C+chloroquine+and+azithromycin+in+adult+human+primary+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cardiotoxic potential of hydroxychloroquine, chloroquine and azithromycin in adult human primary cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 180 (2), 356-368 (2021).</li>
<li>Ton, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrhythmogenic+and+antiarrhythmic+actions+of+late+sustained+sodium+current+in+the+adult+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Arrhythmogenic and antiarrhythmic actions of late sustained sodium current in the adult human heart.</a> Scientific Reports. 11, 12014(2021).</li>
<li>Schmid, C., Abi-Gerges, N., Leither, M. G., Zellner, D., Rast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+expression+and+electrophysiology+of+singular+human+%28primary+and+induced+pluripotent+stem+cell-derived%29+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Ion channel expression and electrophysiology of singular human (primary and induced pluripotent stem cell-derived) cardiomyocytes.</a> Cells. 10 (12), 3370(2021).</li>
<li>Guha, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+exploring+structure+activity+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">On exploring structure activity relationships.</a> Methods in Molecular Biology. 993, 81-94 (2013).</li>
<li>Tannenbaum, J., Bennett, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Russell+and+Burch%27s+3Ra+then+and+now%3A+The+need+for+clarity+in+definition+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Russell and Burch's 3Ra then and now: The need for clarity in definition and purpose.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).</li>
<li>Ruiz-Meana, M., Martinson, E. A., Garcia-Dorado, D., Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+ethics+in+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Animal ethics in cardiovascular research.</a> Cardiovascular Research. 93 (1), 1-3 (2012).</li>
<li>Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial extracellular matrix.</a> Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).</li>
<li>Zaglia, T., Mongillo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+innervation%2C+from+a+different+point+of+%28re%29view%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic innervation, from a different point of (re)view.</a> Journal of Physiology. 595 (12), 3919-3930 (2017).</li>
</ol>

Tous les auteurs sont des employés d’AnaBios Corporation et ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour le système optique basé sur la contractilité des cardiomyocytes humains adultes pour une méthode simplifiée à débit moyen qui permet de tester l’efficacité aiguë et la cardiotoxicité de nouveaux composés. Ce système d’enregistrement optique de la contractilité est facile à utiliser, permet des enregistrements de plusieurs cellules en parallèle, permet l’évaluation simultanée de la santé, de la physiologie et de la pharmacologie des cellules, est livré avec une analyse automatisée et rapide des données (une série de plusieurs cellules est analysée en 5 s) et permet une collecte rapide des données (courbe concentration-réponse toutes les 30 min/composé/dispositif). En tenant compte de ces attributs, le système d’enregistrement peut être utilisé non seulement pour détecter les effets des médicaments sur la contractilité des cardiomyocytes, mais aussi pour fournir des données sur les relations structure-activité afin de soutenir les efforts de chimie médicinale au cours des premières phases de la découverte de médicaments16. Étant donné que des dizaines de millions de cellules peuvent être obtenues à partir d’un protocole d’isolement des cardiomyocytes, l’application du système d’enregistrement optique de la contractilité et de la plate-forme cardiomyocytaire est actuellement à l’étude pour obtenir une capacité de test accrue (avec l’utilisation de plaques bien ancrées) à moindre coût. De plus, l’évaluation des effets des médicaments sur les paramètres systoliques et de relaxation mesurés avec le système d’enregistrement peut fournir un profilage mécanistique multiparamétrique des médicaments inotropes12. De plus, les données sur la contractilité des cardiomyocytes peuvent être utilisées pour classer les nouveaux médicaments du plus au moins cardiotoxique (p. ex., marge de sécurité) et du moins efficace au plus efficace (p. ex., marge de puissance). Des études de suivi de la contractilité des cardiomyocytes peuvent également être menées pour soutenir les programmes de développement qui ont été associés à une diminution clinique de la contractilité myocardique12.
Un autre avantage significatif de l’utilisation du système d’enregistrement optique de la contractilité des cardiomyocytes humains est son alignement avec le concept des 3R (remplacement, réduction et raffinement)17 puisqu’il peut être considéré comme une méthode alternative qui évite ou remplace l’utilisation d’animaux pour la génération de données dans l’industrie pharmaceutique. Cet avantage des 3R peut également être étendu à la recherche universitaire en cardiologie. L’ensemble des connaissances actuelles sur la physiologie et la pharmacologie des cardiomyocytes provient d’études de recherche universitaire menées sur des cellules isolées de cœurs d’animaux18. Ainsi, le modèle de contractilité optique des cardiomyocytes humains ouvre la possibilité de réaliser des études translationnelles critiques. Pour réaliser ces études, des protocoles de conservation et d’expédition des cardiomyocytes adultes humains doivent être développés (actuellement en cours d’évaluation dans le laboratoire d’AnaBios), et le système de contractilité doit avoir la capacité d’enregistrer les changements de longueur des sarcomères des cardiomyocytes non humains (c’est le cas du système d’enregistrement de la contractilité optique puisque les sarcomères sont bien conservés parmi les espèces).
Le système de contractilité des cardiomyocytes humains peut émuler plusieurs conditions physiologiques (p. ex., couplage électromécanique, fréquence de stimulation imitant la fréquence cardiaque, température corporelle, intégration de toutes les cibles cardiaques humaines) et a démontré sa valeur translationnelle en tant qu’élément clé dans la découverte de médicaments11,12,13,14, bien qu’il ne puisse pas imiter les changements de charge mécanique et de contrainte de cisaillement observés au cours du cycle contractile cardiaque. La structure et la fonction des matrices extracellulaires cardiaques sont maintenant mieux comprises19, le développement de telles matrices peut potentiellement aider à surmonter la limitation de la charge mécanique, et des matrices avec différentes rigidités cardiaques sont actuellement en cours d’évaluation dans le laboratoire d’AnaBios. Une autre limite du système de contractilité optique des cardiomyocytes humains est l’absence du réseau de nerfs qui alimente le cœur (par exemple, les fibres sympathiques et parasympathiques)20. Ce contact neuro-cardiaque peut être rétabli par l’application conjointe de neurotransmetteurs (par exemple, l’isoprotérénol, un agoniste des récepteurs β-adrénergiques ; l’acétylcholine, un agoniste des récepteurs muscariniques M2), le composé étant évalué pour ses effets potentiels sur la contractilité des cardiomyocytes. De plus, les transitoires de contractilité sont enregistrés sans mesures simultanées des potentiels d’action et des transitoires Ca 2+, qui sont également essentiels pour évaluer les effets du médicament sur l’électrocardiogramme et la manipulation du Ca2+. Bien que cette omission puisse être considérée comme une limitation du système, elle n’est pas trop critique car les enregistrements des signaux de potentiel d’action (avec la méthode de la pince de courant ou des colorants sensibles à la tension) et des transitoires de Ca 2+ (avec des indicateurs/colorants de Ca2+) peuvent être associés à la cytotoxicité. De tels effets cytotoxiques peuvent avoir un impact sur l’évaluation de nouveaux médicaments pour moduler la contractilité cardiaque. Au contraire, l’utilisation d’une méthode optique non invasive qui préserve la santé, la physiologie et la pharmacologie des cardiomyocytes, comme le système d’enregistrement décrit dans ce protocole, permettrait non seulement d’obtenir des données de contractilité de la plus haute qualité, mais aussi de bien prédire les effets contractiles des nouveaux médicaments chez l’homme.

La contractilité myocardique (inotropie), qui représente la capacité naturelle du muscle cardiaque à se contracter, est une propriété clé de la fonction cardiaque et dépend de la dynamique du couplage électromécanique. Les modifications de la contractilité myocardique induites par les médicaments sont souhaitées pour traiter les maladies cardiaques (p. ex., insuffisance cardiaque) et non recherchées dans le contexte de la cardiotoxicité (p. ex., réduction de la fraction d’éjection ventriculaire gauche). Par conséquent, les modèles de contractilité préclinique doivent être associés à une prédictivité précise pour s’assurer que les nouveaux médicaments peuvent réussir pendant le développement clinique. Cependant, les stratégies précliniques actuelles, qui reposent sur des modèles cellulaires artificiels réductionnistes (par exemple, des lignées cellulaires immortalisées génétiquement modifiées qui surexpriment des cibles cardiaques d’intérêt spécifiques) et des modèles animaux non humains, ont montré des limites importantes et se sont avérées associées à des taux élevés d’attrition des médicaments (c’est-à-dire un taux élevé de faux signaux)1,2,3,4 . Par conséquent, il est impératif d’établir de nouveaux modèles fiables de contractilité cardiaque cellulaire humaine associés à une puissance élevée (c’est-à-dire un taux élevé de signaux vrais) pour prédire les résultats des médicaments chez l’homme et, par conséquent, aider à accélérer le lancement de nouvelles thérapies5.
Les méthodes révolutionnaires récemment mises au point pour la récupération de cœurs de donneurs humains pour la recherche 6,7,8,9,10 et dans les techniques d’isolement des cardiomyocytes 11,12,13,14,15 ont fourni une occasion unique de mener des études sur l’homme au cours du développement préclinique. À cette fin, les cardiomyocytes primaires humains adultes ont déjà montré leur utilité dans l’évaluation des changements induits par les médicaments dans la contractilité cardiaque humaine11,12,13,14. Le présent article détaille le protocole d’étude des effets de contractilité de nouveaux composés dans les cardiomyocytes humains adultes.

<table><tbody><tr><td>100&ndash ; 1000 et micro ; L Filtrée, à large orifice, pointes stériles</td><td>Pipette</td><td>UF-1000W</td><td></td></tr><tr><td>100 mL, pression Duran plus flacons</td><td>DWK Life Sciences</td><td>218102406</td><td></td></tr><tr><td>1 L, 0,22 & micro ; m Système de filtre</td><td>sous vide VWR</td><td>567-0020</td><td></td></tr><tr><td>290 mmol/kg Osmolarité Standard</td><td>Wescor</td><td>OA-029</td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre de paillasse</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>https://www.mt.com/us/en/home/products/Laboratory_Analytics_Browse/pH-meter/pH-meters.html</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Caméra&nbsp ;</td><td>Optronis GmbH</td><td>Cyclone-25-150-M</td><td>https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/</td></tr> <tr><td>Corning 25 mm x25 mm Carré #1 Verre de couverture</td><td>Corning</td><td>2845-25</td><td></td></tr><tr><td>Cyclone-25-150</td><td>Optronis</td><td></td><td>https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/</td></tr> <tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Minuterie/Chronomètre numérique</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>Sulfoxyde de diméthyle (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture stérile rectangulaire en polystyrène à huit puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>73521-426</td><td>Système de</td></tr><tr><td>chambre de microscope FHD</td> https://us.vwr.com/store/product/4679368/nunclontm-delta-rectangular-dishes-polystyrene-sterile-thermo-scientific <td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow EZ, Régulateur de débit modulaire basé sur la pression avec un programme piloté par ordinateur version 1.1.0.0.</td><td>Fluigent OxyGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles sous vide à usage intensif</td><td>VWR</td><td>16211-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Laminine recombinante humaine 521</td><td>BioLamina</td><td>LM521-05</td><td></td></tr><tr><td>Tube de chromatographie IDEX, FEP naturel, 1/16 » OD x 0,030 » ID</td><td>Cole-Palmer</td><td>1520L</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-(-)-malique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112577</td><td></td></tr><tr><td>Acide lactobionique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-glutamique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49449</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Contrôle de la température Réchauffeur de platine</td><td>AmScope</td><td>TCS-100</td><td></td></tr><tr><td>MyoPacer Stimulateur de champ</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc Plats rectangulaires</td><td>Thermo Scientific</td><td>267062</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX83P1ZF Ixplore Microscope standard</td><td>Olympus</td><td></td><td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/inverted/ixplore-standard/?campaignid=657680540&adgroupid =116963199831& Mot-clé=IX73%20 microscope& gclid=EAIaIQobChMIl qjyiMWP-AIVVx-tBh2JoQ85EAA YASAAEgLp3fD_BwE</td></tr><tr><td>pH 4,01, 7,00 et 10,01 Étalons</td><td>Oakton</td><td>WD-05942-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td>Hydroxyde <td>de 746436</td><td></td>de potassium <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>(KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4494</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>Prism Software</td><td>Logiciel GraphPad - Dotmatics</td><td></td><td>https://www.graphpad.com/</td></tr> <tr><td>RBS 25 Détergent liquide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83460</td><td></td></tr><tr><td>Sharps Container</td><td>Uline</td><td>S-15307</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse SigmaPlot</td><td>Systat Software Inc.</td><td></td><td>https://systatsoftware.com/</td></tr> <tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Student Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Boîtier de contrôle de température</td><td>Warner Insturments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Osmomètre à pression de vapeur</td><td>ELITechGroup</td><td>Modèle 5600</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Flacons de 20 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>225288</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de la contractilité cardiaque dans des cardiomyocytes primaires humains adultes isolés

Measurement of Heart Contractility in Isolated Adult Human Primary Cardiomyocytes

L’évaluation des changements dans la contractilité cardiaque est essentielle au cours du développement préclinique de nouveaux composés cardiaques et non cardiaques. Cet article décrit un protocole d’évaluation des changements de contractilité dans les cardiomyocytes ventriculaires primaires humains adultes à l’aide du MyoBLAZER, une méthode optique non invasive qui préserve la physiologie et la pharmacologie normales des cellules. Cette méthode d’enregistrement optique mesure en continu les transitoires de contractilité de plusieurs cellules en parallèle, fournissant à la fois un débit moyen et des informations précieuses pour chaque cellule individuelle dans le champ de vision, permettant le suivi en temps réel des effets des médicaments. Les contractions des cardiomyocytes sont induites par une stimulation de champ électrique rythmée, et les images acquises en fond clair sont transmises à un logiciel de traitement d’images qui mesure le raccourcissement du sarcomère à travers plusieurs cardiomyocytes. Cette méthode génère rapidement différents paramètres liés à la cinétique des phases de contraction et de relaxation, et les données résultantes peuvent ensuite être interprétées par rapport aux différentes concentrations d’un article d’essai. Cette méthode est également utilisée dans les derniers stades du développement préclinique pour effectuer des études mécanistiques de suivi afin de soutenir les études cliniques en cours. Ainsi, le modèle basé sur les cardiomyocytes primaires humains adultes combiné au système optique pour la surveillance continue de la contractilité a le potentiel de contribuer à une nouvelle ère de traduisibilité des données cardiaques in vitro dans le développement de thérapies médicales précliniques.

Ce protocole décrit une procédure permettant de mesurer la contractilité dans des cardiomyocytes primaires humains adultes isolés provenant de donneurs d’organes et d’évaluer les changements aigus des paramètres de contractilité induits par un composé d’essai. La mesure du transitoire de contractilité est réalisée à l’aide d’un système de géométrie cellulaire basé sur la vidéo, le MyoBLAZER, qui mesure la dynamique du sarcomère, et l’état cardiaque de l’adulte est émulé en induisant la contractilité avec une stimulation électrique à la fréquence de stimulation physiologique (1 Hz). La viabilité fonctionnelle des cardiomyocytes est confirmée par l’évaluation de leur couplage excitation-contraction (c’est-à-dire le traitement cellulaire liant l’excitation électrique [le potentiel d’action sarcoliemme] à la contraction). Il n’y a pas de transitoires de contractilité spontanée dans les cardiomyocytes humains, et les cardiomyocytes répondent à la stimulation électrique externe avec des cycles de contractilité/relaxation (Figure 2C, E), ainsi qu’à l’isoprotérénol, un agoniste β-adrénergique (Figure 2F, G). L’isoprotérénol provoque une augmentation de la contractilité en fonction de la concentration (Figure 2G), et ses effets sur la cinétique de la contractilité transitoire peuvent également être caractérisés (Figure 2D)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64394/64394fig01.jpg"> Figure 1 : Montage expérimental du système d’enregistrement de la contractilité optique. Les enregistrements de contractilité en fond clair sont effectués à partir de cardiomyocytes primaires humains adultes, comme décrit précédemment11,12,13,14. L’installation comprend un boîtier de contrôle de la température (A), un stimulateur de champ (B), un système de perfusion sous pression (C, D), un programme informatique basé sur la pression, des bouteilles à pression plus (F), un logiciel d’acquisition (G), une sélection des retours sur investissement avec un logiciel d’acquisition, (I) un affichage des transitoires de contractilité avec un logiciel d’acquisition, un microscope inversé (J), une chambre de microscope K et ( L) appareil photo. Toutes les caractéristiques de l’équipement sont données dans le tableau des matériaux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64394/64394fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64394/64394fig02.jpg"> Figure 2 : Validation de la mesure de la contractilité des cardiomyocytes humains et effet de la stimulation β-adrénergique. (A) Image de microscopie à contraste de phase d’un cardiomyocyte primaire humain adulte représentatif, (B) régions d’intérêt (ROI) définies par l’utilisateur placées sur les images de cardiomyocytes sains et parallèles à l’axe de contraction, (C) affichage des transitoires de contractilité obtenus à partir des mêmes ROI dans (B) avec le logiciel d’acquisition, (D) paramètres liés au transitoire de contractilité mesuré avec le logiciel d’acquisition : amplitude de contractilité, temps jusqu’au pic, Decay 30, Decay 90, TR90. D’autres paramètres peuvent également être mesurés : la longueur du sarcomère de base, le temps jusqu’au pic de 50 %, la hauteur du pic, la longueur du sarcomère au pic de contractilité, la vitesse de contraction maximale et la vitesse de relaxation maximale. (E) Transitoires de contractilité typiques enregistrés à partir d’un myocyte ventriculaire primaire humain adulte à une fréquence de stimulation de 1 Hz en présence d’un véhicule témoin (F) et après exposition à 30 nM d’isoprotérénol, un agoniste β-adrénergique non sélectif. Les transitoires de contractilité démontrés dans les panels E et F ont été prélevés sur le même cardiomyocyte. L’isoprotérénol provenant de cardiomyocytes humains stimulés à une fréquence de stimulation de 1 Hz a été utilisé pour générer l’information sur la puissance. (G) Courbe concentration-réponse cumulative typique générée par la mesure de la contractilité des cardiomyocytes humains avec l’isoprotérénol (n = 8 cellules). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64394/64394fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Séquence de perfusion</td>
			<td>Solution pour véhicule</td>
			<td>Concentration 1 (μM)</td>
			<td>Concentration 2 (μM)</td>
			<td>Concentration 3 (μM)</td>
			<td>Concentration 4 (μM)</td>
			<td>Laver</td>
		</tr><tr><td>Temps de traitement</td>
			<td>120 s</td>
			<td>300 s</td>
			<td>300 s</td>
			<td>300 s</td>
			<td>300 s</td>
			<td>300 s</td>
		</tr><tr><td>Fréquence de stimulation</td>
			<td>1 Hz</td>
			<td>1 Hz</td>
			<td>1 Hz</td>
			<td>1 Hz</td>
			<td>1 Hz</td>
			<td>1 Hz</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Protocole de stimulation et séquence d’application du composé d’essai. La stabilité des transitoires de contractilité est évaluée par un enregistrement continu pendant 120 s dans la solution C, établissant le contrôle du véhicule (généralement dans du DMSO à 0,1 %). Par la suite, la concentration de l’objet d’essai est appliquée pendant au moins 300 s ou jusqu’à ce qu’un effet d’équilibre soit atteint. Quatre concentrations croissantes de l’objet d’essai sont utilisées, ce qui permet d’obtenir des courbes concentration cumulative-effet (C-E). À la fin des ajouts cumulés de l’article d’essai, une période de lavage de 300 s peut être mise en œuvre.

Ce protocole décrit comment mesurer la contractilité dans les cardiomyocytes primaires humains adultes provenant de cœurs de donneurs avec le système MyoBLAZER, une plate-forme fiable pour évaluer les changements de contractilité induits par les médicaments au cours du développement préclinique.

Mesure de la contractilité cardiaque dans des cardiomyocytes primaires humains adultes isolés

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This ...

Notre protocole décrit un système fiable de mesure de la contractilité dans les cardiomyocytes primaires humains adultes. Notre système est une méthode d’enregistrement optique non invasive à débit moyen qui mesure en continu la contractilité de plusieurs cellules en parallèle et permet un suivi en temps réel des effets des médicaments. Nos méthodes soutiennent la découverte de nouvelles molécules ayant le profil le plus recherché pour la correction de l’insuffisance cardiaque.Il fournit également une approche préclinique pour prédire les risques de contractilité induite par les médicaments. Pour commencer, placez un seul couvercle en verre dans chaque puits d’une plaque de culture à huit puits. Préparez cinq microgrammes par millilitre de laminine en ajoutant 800 microlitres de laminine recombinante humaine 521 à 7,2 millilitres de solution B et mélangez bien.Ajouter 200 microlitres de la solution de laminine diluée au centre de la lamelle. Couvrez l’assiette et empilez-la dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Diluer le diméthylsulfoxyde ou le DMSO 1000 fois dans la solution C pour obtenir une solution de véhicule à 0,1 % de DMSO.Pour tester le composé à une, 10, 100 et 1000 fois de son exposition thérapeutique de 0,001 micromolaire, dissoudre le composé dans du DMSO à une concentration millimolaire. Diluer la solution de composé d’essai de DMSO en série avec du DMSO pour produire trois autres bouillons. Enfin, diluer chaque composé d’essai 1000 dans 50 millilitres de solution C pour obtenir les concentrations d’essai finales.Ajouter la solution pour véhicule et les solutions des concentrations micromolaires finales du composé dans des seringues de 50 millilitres. Connectez les seringues au système d’écoulement par gravité, puis amorcez le système d’écoulement par gravité. Sortez du réfrigérateur une plaque à huit puits contenant une lamelle de couvercle recouverte de pellicule et placez une plaque de couverture dans une chambre d’enregistrement propre.Remettez l’assiette au réfrigérateur jusqu’au prochain dressage. Aspirer la solution B du flacon ascensionné pour atteindre le plus petit volume sans perdre de cellules. Versez ensuite 200 microlitres de la solution cellulaire dans la chambre du microscope enregistreur montée sur la platine d’un microscope inversé et laissez les cellules se déposer sur la lamelle pendant cinq minutes.Ensuite, ouvrez le champ de vision du microscope et déterminez si la densité cellulaire est adéquate pour le début de l’essai. Une fois le placage terminé, équilibrez les cellules pendant cinq minutes en les perfusant continuellement avec la solution C à l’aide du système de perfusion par gravité. Ajustez correctement l’aspiration, allumez le boîtier de contrôle de la température et une plaque chauffante et réglez-les pour qu’ils fournissent 35 degrés Celsius.Ensuite, sur un stimulateur de champ avec une paire de fils de platine placés sur les côtés opposés de la chambre, stimulez les cellules avec une tension supraseuil à une fréquence de stimulation d’un hertz. Réglez l’amplitude de l’impulsion stimulante à un volt et augmentez-la jusqu’à ce que les cardiomyocytes commencent à générer des cycles de contraction-relaxation. Sélectionnez des cellules saines avec une morphologie en forme de bâtonnet et des stries claires, puis ajustez le champ de vision et concentrez-vous sur le fait de mettre en évidence autant de cellules en contraction que possible.Ensuite, les images numérisées des cellules sont affichées dans le logiciel d’acquisition du système d’enregistrement de la contractilité optique. Lors de la sélection de la région d’intérêt ou des ROI, évitez les zones floues et les zones proches du bord des cellules. Lancez l’expérience pour évaluer les effets du composé.Le logiciel d’acquisition gérera l’acquisition des données. Affichage et étiquetage automatique des concentrations d’essai et du temps de traitement. Appliquer des concentrations d’essai si la contraction reste à une amplitude stable pendant toute la durée de la période de référence du véhicule.Disqualifiez les cellules affichant un point d’arrêt ou un point d’arrêt. Effectuez une analyse hors ligne à l’aide du logiciel d’analyse et d’une macro personnalisée pour faire la moyenne des données. Le logiciel calcule et rapporte diverses mesures à partir des données de dynamique du sarcomère produites par le logiciel d’acquisition.Quantifier les effets du composé d’essai sur l’amplitude moyenne de la contractilité par rapport à la condition de contrôle de base spécifique du véhicule de chaque cardiomyocyte. Exprimez les résultats moyens sous la forme d’une moyenne de plus/moins MEB et produisez un graphique représentant l’effet de la concentration du composé d’essai sur l’amplitude de la contractilité. Ajustez ensuite la courbe de réponse de la concentration à l’équation de Hill pour en déduire les valeurs IC50 et EC50.Ensuite, identifiez la post-contraction comme un transitoire de contraction secondaire spontanée du cardiomyocyte qui se produit avant la prochaine contraction régulière et produit une contraction anormale et non synchronisée. Identifiez l’échec de la contraction comme l’incapacité du stimulus électrique à induire une contraction. Visualisez la variabilité à court terme, ou VUT, et les alternans dans les diagrammes de Poincaré de la variabilité de l’amplitude de contraction.Calculer le VUT avec les 20 derniers transitoires de chaque témoin et de la période de concentration de l’objet d’essai. Identifiez ensuite les alternants comme des transitoires répétitifs, alternant des transitoires d’amplitude de contractilité courte et longue. Pour calculer les incidences de la pro-arythmie, normalisez les valeurs STV à la valeur de contrôle du véhicule de chaque cellule, tracez la postcontraction, l’échec de contraction, le STV et les alternants et exprimez-les en pourcentage de l’incidence des cellules présentant chacun des signaux.Complétez le profilage mécanistique multiparamétrique avec le calcul du temps jusqu’au pic, de la décroissance à 30 % puis de la relaxation à 90 %, du temps à la relaxation à 90 %, de la longueur du sarcomère de base, du temps jusqu’au pic de 50 %, de la hauteur du pic, de la longueur du sarcomère à la contractilité maximale, de la vitesse de contraction maximale et de la vitesse de relaxation maximale. Exprimez ensuite ces paramètres par rapport à la condition de contrôle de base spécifique de chaque cardiomyocyte et représentez-les graphiquement dans des diagrammes de réponse à la concentration. Cette étude montre la validation de la mesure de la contractilité des cardiomyocytes humains et l’effet de la stimulation bêta-adrénergique.Il n’y avait pas de transitoires de contractilité spontanée dans les cardiomyocytes humains, et les cardiomyocytes répondent à la stimulation électrique externe avec des cycles de contractilité-relaxation, ainsi qu’à l’isoprotérénol, un agoniste bêta-adrénergique. L’isoprotérénol produit une augmentation de la contractilité dépendante de la concentration, et ses effets sur la cinétique de la contractilité transitoire ont également été caractérisés. Suite à la mesure de la contractilité, nous pouvons effectuer la mesure du transitoire calcique à l’aide d’un indicateur fluorescent.De telles données aident à déterminer si un changement de contractilité nécessite un changement dans la dynamique du calcium. Notre méthode ouvre la voie aux chercheurs en cardiologie pour développer une meilleure compréhension de la physiologie et de la pharmacologie des cardiomyocytes humains, établir la structure, l’activité et les relations de nouveaux médicaments et explorer leur mécanisme d’action.

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Ici, une méthode établie est décrite pour effectuer des mesures de contractilité et de calcium dans des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme à l’aide d’une plate-forme optique. Cette plateforme permet aux chercheurs d’étudier l’effet des mutations et la réponse à divers stimuli de manière rapide et reproductible.

Mesures en temps réel des paramètres de calcium et de contractilité dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Découvrez la mesure de la contractilité cardiaque dans des cardiomyocytes primaires humains adultes isolés. Cette méthode optique non invasive avec le système MyoBLAZER permet d'évaluer les effets des médicaments en temps réel et de prédire les risques cardiaques précliniques.

Mesure de la contractilité cardiaque dans des cardiomyocytes primaires humains adultes isolés

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