Name: Une plateforme à haut débit pour la culture et l’imagerie 3D d’organoïdes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Découvrez une plateforme à haut débit pour la culture et l'imagerie 3D d'organoïdes utilisant des boîtes de culture microtexturées. Cette méthode permet de générer des centaines d'organoïdes compatibles avec l'imagerie longitudinale pour la recherche biomédicale.

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La recherche est soutenue par le projet CALIPSO soutenu par la National Research Foundation, Cabinet du Premier ministre, Singapour, dans le cadre de son programme Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. remercie l’investigateur NRF-NRFI2018-07, le MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, le financement de démarrage MBI et ANR ADGastrulo. A.B. et G.G. reconnaissent le soutien du financement de base de MBI. A.B. remercie Andor Technologies pour le prêt du microscope BC43.

<ol><li>Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+materials+for+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+past+learning+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li>
<li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72(2020).</li>
<li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274(2020).</li>
<li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li>
<li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+organoids%3A+a+bright+future+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li>
</ol>

Une demande internationale de brevet a été publiée sous le numéro de publication WO 2021/167535 A1.

La procédure de fabrication de la boîte de culture de micropuits, qui permet la culture organoïde à haute densité et la différenciation, a été décrite dans cet article. En raison de la géométrie et de la disposition des microcavités, des milliers de sphéroïdes peuvent être cultivés et colorés dans une seule plaque pendant de longues périodes (plusieurs semaines ou plus) sans perte de matière. À titre de comparaison, une zone de 4 mm x 2 mm sur la plaque de culture cellulaire peut contenir autant de sphéroïdes qu’une seul...

Dans les cultures de cellules organotypiques 3D, ci-après appelées organoïdes, les cellules souches se différencient et s’auto-organisent en structures spatiales qui partagent de fortes similitudes morphologiques et fonctionnelles avec des organes réels. Les organoïdes offrent des modèles précieux pour étudier la biologie humaine et le développement en dehors du corps 1,2,3. Un nombre croissant de modèles imitant le foie, le cerveau, les reins, les poumons et de nombreux autres organessont en cours de développement 2,4,5. La différenciation dans les organoïdes est dirigée par l’ajout de facteurs de croissance solubles et d’une matrice extracellulaire dans une séquence temporelle précise. Cependant, contrairement aux organes, le développement des organoïdes est assez hétérogène.
Au-delà des nombreux défis biologiques6,7, les cultures organoïdes posent également des défis technologiques en termes de méthodes de culture cellulaire, de caractérisation de la transcriptomique et d’imagerie. Le développement in vivo des organes se produit dans un environnement biologique qui se traduit par une auto-organisation hautement stéréotypée des arrangements cellulaires. Toute altération phénotypique peut être utilisée comme proxy pour diagnostiquer un état malade. En revanche, les organoïdes se développent in vitro dans des microenvironnements peu contrôlés compatibles avec les conditions de culture cellulaire, ce qui entraîne une grande variabilité dans la voie de développement et la formation de la forme pour chaque organoïde individuel.
Une étude récente8 a démontré que l’imagerie quantitative de la forme organoïde (descripteurs de phénotype) couplée à l’évaluation de quelques marqueurs génétiques permet de définir des paysages de développement phénotypiques. On peut soutenir que la capacité de relier la diversité de l’expression génomique chez les organoïdes à leur comportement phénotypique est une étape majeure vers la libération du plein potentiel des cultures organotypiques. Ainsi, il demande le développement d’approches d’imagerie dédiées et à haut contenu permettant la caractérisation des caractéristiques organoïdes aux échelles sous-cellulaires, multicellulaires et organoïdes entières en 3D 9,10.
Nous avons développé une plateforme polyvalente de criblage à haut contenu (HCS) permettant une culture organoïde rationalisée (à partir de cellules souches embryonnaires humaines isolées [CSEh], de cellules souches pluripotentes induites par l’homme [CSIPh] ou de cellules primaires à des organoïdes 3D, multicellulaires et différenciés) et une imagerie 3D rapide et non invasive. Il intègre un dispositif de culture cellulaire 3D miniaturisé de nouvelle génération, appelé puce JeWells (la puce ci-après), qui contient des milliers de micropuits bien disposés flanqués de miroirs à 45° qui permettent une imagerie 3D rapide et haute résolution par microscopie à feuille de lumièreà objectif unique 11. Compatible avec n’importe quel microscope inversé standard commercial, ce système permet l’imagerie de 300 organoïdes en 3D avec une résolution subcellulaire en <1 h.
La microfabrication du dispositif de culture cellulaire part d’un moule microstructuré existant, qui contient des centaines de micropyramides (Figure 1A) avec une base carrée et des parois latérales à 45° par rapport à la base. La figure 1C montre des images au microscope électronique (EM) de telles structures. Le moule lui-même est en poly(diméthylsiloxane) (PDMS) et peut être fabriqué comme une réplique moulée d’un moule primaire (non montré ici) avec les caractéristiques correspondantes (comme des cavités) en utilisant des procédures lithographiques douces standard. Le moule primaire peut être produit par différentes procédures. Celui utilisé pour ce protocole a été fabriqué à l’aide de gravure humide au silicium, comme indiqué dans Galland et al. 11; La procédure de fabrication du moule primaire n’est pas critique pour ce protocole. Les pyramides sont disposées en un réseau carré, avec le même pas pour les directions X et Y (dans ce cas, le pas est de 350 μm).
À titre d’illustration, des expériences de preuve de concept12 ont été publiées pour démontrer que la puce permet des protocoles de culture à long terme (mois) et de différenciation tout en définissant précisément le nombre de cellules initiales dans les puits. Le développement individuel d’un grand nombre d’organoïdes peut être automatiquement surveillé en direct à l’aide de microscopes à fluorescence à feuille de lumière 3D standard à fond clair. De plus, les organoïdes peuvent être récupérés pour effectuer d’autres recherches biologiques (par exemple, analyse transcriptomique). Cet article décrit les protocoles détaillés pour la fabrication des lamelles de couverture de culture cellulaire, la procédure d’ensemencement et de coloration pour la microscopie à fluorescence, ainsi que la récupération des organoïdes.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>AA19397K7</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>AA19392K7</td><td></td></tr><tr><td>BC43 Microscope confocal de paillasse Andor</td><td>Technology</td><td></td><td>Microscope confocal à disque rotatif</td></tr><tr><td>Sérum bovin albumine&nbsp ;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>Solution de gravure à l’oxyde tamponné</td><td>Merck</td><td>901621-1L</td><td></td></tr><tr><td>CEE Spin Coater</td><td>Brewer Science</td><td>200X</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Développeur AZ400K</td><td>Merck</td><td>18441223164</td><td></td></tr><tr><td>DI Milliq water Millipore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre</td><td>Marienfled</td><td>117650</td><td>1.5H, rond 25 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Imaris logiciel</td><td>d’analyse d’images BitPlane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique à transmission inversée</td><td>Nikon</td><td>TSF100-F</td><td></td></tr><tr><td>Labsonic M</td><td>Sartorius Stedium Biotech</td><td></td><td>Homogénéisateur à ultrasons</td></tr><tr><td>Lipidure</td><td>NOF America</td><td>CM5206</td><td>copolymère bio-mimétique</td></tr><tr><td>NOA73</td><td>Norland Products</td><td>17-345</td><td>Adhésif durcissable aux UV</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Thermofisher scientific&nbsp ;</td><td>A12379</td><td>Alexa Fluor</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution</td><td>Thermofisher</td><td>scientific 10010023</td><td></td></tr><tr><td>Photo Resist AZ5214E</td><td>Merck</td><td>14744719710</td><td></td></tr><tr><td>Pico Outil plasma</td><td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td><td>Pico Plasma</td><td>Pour le traitement au plasma O2</td></tr><tr><td>RapiClear 1.52</td><td>Sunjin lab</td><td>RC 152001</td><td>agent nettoyant soluble dans l’eau</td></tr><tr><td>RCT Plaque chauffante/Agitateur</td><td>IKA (MY)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Outil de gravure ionique réactive</td><td>Samco Inc. (JPN)</td><td>RIE-10NR</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td> Milieu <td>de</td> culture <td>11875093 Invitrogen</td><td>pour cellules HCT116</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>Polydiméthylsiloxane ou en abrégé, PDMS</td></tr><tr><td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>tensioactif</td></tr><tr><td>Trypsine EDTA</td><td>Thermofisher scientifique</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur à ultrasons</td><td>Bransonic</td><td>CPX2800</td><td></td></tr><tr><td>UV-KUB 2</td><td>KLOE</td><td></td><td>Source lumineuse UV-LED, longueur d’onde 365 nm, 35 mW/cm2</td></tr><tr><td>masque UV à densité de puissance aligneur</td><td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td><td>MJB4</td><td></td></tr></tbody></table>

une plateforme à haut débit pour la culture et l’imagerie 3d d’organoïdes

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

La caractérisation d’un grand nombre de cultures organotypiques tridimensionnelles (3D) (organoïdes) à différentes échelles de résolution est actuellement limitée par les approches d’imagerie standard. Ce protocole décrit un moyen de préparer des puces de culture organoïde microfabriquées, qui permettent une imagerie 3D en direct multi-échelle sur un instrument convivial nécessitant un minimum de manipulations et capable d’atteindre un débit d’imagerie allant jusqu’à 300 organoïdes / h. Ces puces de culture sont compatibles avec les objectifs d’air et d’immersion (air, eau, huile et silicone) et une large gamme de microscopes courants (par exemple, disque rotatif, scanner de point confocale, grand champ et fond clair). De plus, ils peuvent être utilisés avec des modalités de feuille de lumière telles que la technologie de microscopie à objectif unique et à plan unique (SPIM) (soSPIM). 
Le protocole décrit ici donne des étapes détaillées pour la préparation des copeaux de culture microfabriqués et la culture et la coloration des organoïdes. Il ne faut que peu de temps pour se familiariser avec et les consommables et l’équipement peuvent être facilement trouvés dans les laboratoires biologiques normaux. Ici, les capacités d’imagerie 3D ne seront démontrées qu’avec des microscopes standard commerciaux (par exemple, disque rotatif pour la reconstruction 3D et microscopie à grand champ pour la surveillance de routine).

La figure 8F montre l’aspect typique d’une feuille de couverture de culture cellulaire après une fabrication réussie. La couche adhésive durcissable aux UV semble plate et adhère bien à la lamelle de couverture. Le transfert de la couche adhésive sur la lamelle de couverture peut échouer si la couche sur la lamelle de couverture est surdurcie ou si le retrait du substrat PDMS plat est effectué de manière incorrecte (comme illustré à la figure 8G,H</stron...

Cet article présente un protocole de fabrication pour un nouveau type de substrat de culture avec des centaines de microconteneurs par mm2, dans lequel les organoïdes peuvent être cultivés et observés à l’aide de la microscopie à haute résolution. Les protocoles d’ensemencement cellulaire et d’immunomarquage sont également détaillés.

Une plateforme à haut débit pour la culture et l’imagerie 3D d’organoïdes

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Ce protocole démontre une boîte de culture cellulaire à microtexture conçue pour la croissance de centaines d’organoïdes ayant une connaissance du matériel et entièrement compatible avec la microscopie. Notre technique permet efficacement de générer des milliers d’organoïdes, entièrement compatibles avec l’imagerie à long terme et la culture cellulaire à long terme. Ce protocole présente un grand intérêt pour les applications biomédicales telles que le pipeline de dépistage de médicaments et les domaines de recherche sur le cancer.La technique présentée dans ce protocole est facile à maîtriser après quelques tentatives par toute personne ayant de l’expérience avec les procédures de laboratoire et la microscopie optique. Pour commencer, coupez de petites portions du moule PDMS à la dimension requise pour le dispositif final. Coupez-les parallèlement aux directions XY du tableau.Placez l’un des dés PDMS préparés face vers le bas sur la section PDMS plate. Ensuite, à l’aide d’une pipette, ajoutez environ 0,1 à 0,2 millilitre d’adhésif durcissable aux UV sur un côté du moule. Suivez la progression du liquide à l’intérieur de la cavité à l’aide d’un microscope optique inversé à un gross

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Toute la structure 3D et la teneur cellulaire des organoïdes, ainsi que leur ressemblance phénotypique avec le tissu d’origine peuvent être capturés à l’aide du protocole d’imagerie 3D à résolution unicellulaire décrit ici. Ce protocole peut être appliqué à un large éventail d’organoïdes variant dans l’origine, la taille et la forme.

Imagerie tridimensionnelle à résolution unicellulaire des Organoïdes intacts

Ce protocole démontre des méthodes pour permettre la culture in vitro étendue des xénogreffes patient-dérivées (PDX). Une étape améliore la viabilité globale des cultures multicellulaires en grappes hydrogels 3D, grâce à l’élimination directe de cellules uniques non viables. Une étape secondaire démontre les meilleures pratiques pour la culture PDX dans une plate-forme microfluidique perfusée.

Viabilité améliorée pour les cultures Hydrogel 3D Ex vivo de xénogreffes dérivées du patient dans une plate-forme microfluidique perfusée

Ici, nous fournissons des protocoles détaillés, robustes et complémentaires pour effectuer la coloration et l’imagerie de résolution subcellulaire de modèles de culture cellulaire tridimensionnelle fixes allant de 100 μm à plusieurs millimètres, permettant ainsi la visualisation de leur morphologie, de leur composition de type cellulaire et de leurs interactions.

Coloration et imagerie haute résolution de modèles organoïdes et sphéroïdes tridimensionnels

Un protocole détaillé est présenté ici pour décrire un modèle organoïde in vitro à partir de cellules épithéliales nasales humaines. Le protocole propose des options pour les mesures nécessitant un équipement de laboratoire standard, avec des possibilités supplémentaires pour l’équipement et les logiciels spécialisés.

Culture et imagerie des organoïdes épithéliaux nasaux humains

Ce protocole décrit une méthode semi-automatisée pour les criblages de médicaments organoïdes à débit moyen à élevé et un logiciel d’analyse d’images automatisé indépendant du microscope pour quantifier et visualiser les réponses multiparamétriques et mono-organoïdes aux médicaments afin de capturer l’hétérogénéité intratumorale.

Criblage multiparamétrique de médicaments organoïdes tumoraux à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes à grand champ pour l’analyse en vrac et mono-organoïde

La présente étude décrit des méthodologies pour la culture, la congélation, la décongélation, le traitement, la coloration, l’étiquetage et l’examen de sphéroïdes et d’organoïdes entiers sous divers microscopes, alors qu’ils restent intacts dans un hydrogel dans un dispositif polyvalent.

Culture, congélation, traitement et imagerie d’organoïdes et de sphéroïdes entiers alors qu’ils sont encore dans un hydrogel

Ce protocole documente la fabrication et l’assemblage de SPOT, une plate-forme de culture à haut débit basée sur un échafaudage, dans des formats à 96 et 384 puits. Il détaille également le processus d’ensemencement de SPOT, à la fois manuel et à l’aide d’un manipulateur de liquide disponible dans le commerce.

Fabrication reproductible de SPOT en tant que plate-forme de culture à haut débit basée sur un échafaudage

Nous présentons un protocole étape par étape pour l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution, sans marquage et des organoïdes à l’aide de l’holotomographie à faible cohérence. Ce protocole détaille la préparation de la culture d’organoïdes, l’acquisition d’images et l’analyse d’images informatiques, permettant de visualiser en temps réel la dynamique structurelle et les réponses aux médicaments dans les organoïdes vivants.

Imagerie 3D haute résolution sans marquage et analyse par apprentissage automatique d’organoïdes intestinaux par holotomographie à faible cohérence

Nous décrivons les pipelines d’imagerie confocale et de suivi appliqués à deux stratégies de rapporteurs : les organoïdes mosaïques pour résoudre le comportement cellulaire individuel et les organoïdes rapporteurs du destin pour la surveillance des transitions de type cellulaire chez les organoïdes intestinaux humains et murins.

Imagerie cellulaire vivante et suivi unicellulaire pour surveiller la dynamique clonale et les transitions de destin chez les organoïdes intestinaux humains et murines

Nous avons développé une nouvelle plateforme multi-compartiments microsystème neurone de co-culture in vitro du système nerveux central de recherche interactions axone-glie. La plateforme est capable de conduire jusqu'à six expériences indépendantes en parallèle et a été fabriqué en utilisant un tout nouveau micro / macro méthode de fabrication hybride.

Un compartiment Multi-SNC neurone-glie co-culture de la plate-forme microfluidique

Découvrez une plateforme à haut débit pour la culture et l'imagerie 3D d'organoïdes utilisant des boîtes de culture microtexturées. Cette méthode permet de générer des centaines d'organoïdes compatibles avec l'imagerie longitudinale pour la recherche biomédicale.

Une plateforme à haut débit pour la culture et l’imagerie 3D d’organoïdes

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