Name: Manipulation génétique médiée par phage du spirochète de la maladie de Lyme Borrelia burgdorferi (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Découvrez la transduction d'ADN médiée par le phage φBB-1 chez Borrelia burgdorferi, une alternative efficace à l'électroporation pour la manipulation génétique de ce spirochète responsable de la maladie de Lyme.

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L’auteur tient à remercier Shawna Reed, D. Scott Samuels et Patrick Secor pour leur discussion utile, ainsi que Vareeon (Pam) Chonweerawong pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par le Département des sciences biomédicales et des subventions de recherche du corps professoral à Christian H. Eggers de l’École des sciences de la santé de l’Université Quinnipiac.

L’auteur n’a rien à divulguer.

L’utilisation de la transduction pourrait représenter une méthode pour surmonter au moins certaines des barrières biologiques et techniques associées à l’électrotransformation de B. burgdorferi 1,4,13,37. Dans de nombreux systèmes, le bactériophage peut déplacer l’ADN de l’hôte (non prophage) entre les cellules bactériennes par transduction généralisée ou spécialisée 22,23,24,49,50.<su...

Le développement d’outils pour la manipulation génétique de la bactérie spirochétale Borrelia burgdorferi a ajouté une valeur incommensurable à la compréhension de la nature de la maladie de Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi possède un génome exceptionnellement complexe composé d’un petit chromosome linéaire et de plasmides linéaires et circulaires 5,6. La perte plasmidique spontanée, le réarrangement intragénique (mouvement des gènes d’un plasmide à un autre au sein d’un même organisme) et le transfert horizontal de gènes (HGT, le mouvement de l’ADN entre deux organismes) ont donné lieu à une hétérogénéité génétique vertigineuse chez B. burgdorferi (pour un exemple, voir Schutzer et al.7). Les génotypes (ou « souches ») qui en résultent sont tous membres de la même espèce, mais présentent des différences génétiques qui influencent leur capacité à transmettre et à infecter différents mammifères hôtes 8,9,10,11. Dans le présent rapport, le terme « souche » sera utilisé pour désigner B. burgdorferi ayant un bagage génétique naturel particulier; Le terme « clone » sera utilisé pour désigner une souche qui a été génétiquement modifiée dans un but particulier ou à la suite d’une manipulation expérimentale.
La boîte à outils moléculaire disponible pour une utilisation chez B. burgdorferi comprend des marqueurs sélectionnables, des rapporteurs de gènes, des vecteurs navettes, une mutagénèse par transposon, des promoteurs inductibles et des marqueurs contre-sélectionnables (pour une revue, voir Drektrah et Samuels12). L’utilisation efficace de ces méthodologies nécessite l’introduction artificielle d’ADN hétérologue (étranger) dans une souche d’intérêt de B. burgdorferi. Chez B. burgdorferi, l’introduction de l’ADN hétérologue est réalisée presque exclusivement par électroporation, une méthode qui utilise une impulsion électrique pour rendre une membrane bactérienne transitoirement perméable à de petits morceaux d’ADN introduits dans le milieu1. La majorité des cellules (estimées à ≥99,5%) sont tuées par le pouls, mais les cellules restantes ont une fréquence élevée de rétention de l’ADN hétérologue13. Bien que considérée comme l’une des méthodes les plus efficaces pour introduire de l’ADN dans les bactéries, la fréquence d’électroporation dans B. burgdorferi est très faible (allant de 1 transformant sur 5 × 104 à 5 × 106 cellules)13. Les obstacles à l’obtention de fréquences de transformation plus élevées semblent être à la fois techniques et biologiques. Les obstacles techniques à une électroporation réussie de B. burgdorferi comprennent à la fois la quantité d’ADN (>10 μg) nécessaire et l’exigence que les spirochètes soient exactement dans la phase de croissance correcte (log moyen, entre 2 × 10 7 cellules·mL−1 et 7 × 107 cellules·mL−1) lors de la préparation de cellules électrocompétentes12,13. Ces obstacles techniques, cependant, peuvent être plus faciles à surmonter que les obstacles biologiques.
Les chercheurs sur la maladie de Lyme reconnaissent que les clones de B. burgdorferi peuvent être divisés en deux grandes catégories en ce qui concerne leur capacité à être manipulés génétiquement13,14. Les isolats à passage élevé adaptés au laboratoire sont souvent facilement transformés, mais ont généralement perdu les plasmides essentiels à l’infectiosité, se comportent de manière physiologiquement aberrante et ne sont pas capables d’infecter un hôte mammifère ou de persister dans un vecteurde tiques 12,13. Bien que ces clones aient été utiles pour disséquer la biologie moléculaire du spirochète en laboratoire, ils sont de peu de valeur pour étudier le spirochète dans le contexte biologique du cycle enzootique. Les isolats infectieux à faible passage, en revanche, se comportent d’une manière physiologique reflétant un état infectieux et peuvent compléter le cycle infectieux, mais sont généralement récalcitrants à l’introduction d’ADN hétérologue et sont, par conséquent, difficiles à manipuler pour l’étude12,13. La difficulté de transformer les isolats à faible passage est liée à au moins deux facteurs différents : (i) les isolats à faible passage s’agglutinent souvent étroitement, en particulier dans les conditions de haute densité requises pour l’électroporation, empêchant ainsi de nombreuses cellules d’appliquer pleinement la charge électrique ou d’accéder à l’ADN dans le milieu13,15; et ii) B. burgdorferi code pour au moins deux systèmes différents de restriction-modification (R-M) transmis par plasmide qui peuvent être perdus dans les isolats à passage élevé14,16. Les systèmes R-M ont évolué pour permettre aux bactéries de reconnaître et d’éliminer l’ADN étranger17. En effet, plusieurs études sur B. burgdorferi ont démontré que l’efficacité de la transformation augmente lorsque la source de l’ADN est B. burgdorferi plutôt qu’Escherichia coli13,16. Malheureusement, l’acquisition de la concentration élevée requise d’ADN pour l’électroporation de B. burgdorferi est une perspective coûteuse et chronophage. Une autre préoccupation potentielle lors de l’électroporation et de la sélection d’isolats à faible passage est que le processus semble favoriser les transformants qui ont perdu le plasmide critique associé à la virulence, lp2514,18,19; ainsi, l’acte même de manipuler génétiquement des isolats de B. burgdorferi à faible passage par électroporation peut sélectionner des clones qui ne conviennent pas à une analyse biologiquement pertinente dans le cycle enzootique20. Compte tenu de ces problèmes, un système dans lequel l’ADN hétérologue pourrait être électrotransformé en clones de B. burgdorferi à passage élevé, puis transféré dans des isolats infectieux à faible passage par une méthode autre que l’électroporation pourrait être un ajout bienvenu à la collection croissante d’outils moléculaires disponibles pour une utilisation dans le spirochète de la maladie de Lyme.
En plus de la transformation (l’absorption de l’ADN nu), il existe deux autres mécanismes par lesquels les bactéries absorbent régulièrement l’ADN hétérologue : la conjugaison, qui est l’échange d’ADN entre bactéries en contact physique direct les unes avec les autres, et la transduction, qui est l’échange d’ADN médié par un bactériophage21. En effet, la capacité du bactériophage à médier HGT a été utilisée comme outil expérimental pour disséquer les processus moléculaires dans un certain nombre de systèmes bactériens22,23,24. B. burgdorferi n’est pas naturellement compétent pour l’absorption de l’ADN nu, et il y a peu de preuves que B. burgdorferi code l’appareil nécessaire pour favoriser une conjugaison réussie. Des rapports antérieurs ont décrit, cependant, l’identification et la caractérisation préliminaire de φBB-1, un bactériophage tempéré de B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 regroupe une famille de plasmides de 30 kb trouvés dans B. burgdorferi25; Les membres de cette famille ont été désignés CP32. Conformément au rôle de φBB-1 dans la participation au HGT parmi les souches de B. burgdorferi, Stevenson et al. ont rapporté un cp32 identique trouvé dans deux souches avec des cp32 autrement disparates, suggérant un partage récent de ce cp32 entre ces deux souches, probablement par transduction29. Il existe également des preuves d’une recombinaison significative via HGT parmi les cp32 dans un génome 30,31,32,33 par ailleurs relativement stable. Enfin, la capacité de φBB-1 à transduire à la fois cp32s et l’ADN vectoriel navette hétérologue entre cellules de la même souche et entre cellules de deux souches différentes a été démontrée précédemment27,28. Compte tenu de ces résultats, φBB-1 a été proposé comme un autre outil à développer pour la dissection de la biologie moléculaire de B. burgdorferi.
L’objectif de ce rapport est de détailler une méthode pour induire et purifier le phage φBB-1 de B. burgdorferi, ainsi que de fournir un protocole pour effectuer un test de transduction entre clones de B. burgdorferi et sélectionner et cribler des transducteurs potentiels.

<table><tbody><tr><td>Unités de filtration de 1 L (PES, 0,22 & micro ; taille des pores)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>tube de 12 mm x 75 mm (capuchon à double position) (polypropylène)</td><td>USA Scientific</td><td>1450-0810</td><td>contient 4 mL avec un faible volume de vide (pour l’induction)</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger coniques de 15 mL (polypropylène)</td><td>USA Scientific</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>1-méthyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>ATTENTION : cancérogène potentiel ; n’est plus facilement disponible, n’a pas testé proposé des</td></tr><tr><td>pipettes Pasteur de remplacement de 5,75 po (bouchées en coton/verre borosilicaté/non stériles)</td><td>Autoclave Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td>avant utilisation</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger coniques de 50 mL (polypropylène)</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td></td><td></td><td></td>absolu</tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Dot Scientific inc.</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Neopeptone</td><td>Gibco</td><td>DF0119-17-9</td><td></td></tr><tr><td>Bacto TC Yeastolate</td><td>Gibco</td><td>255772</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (grade de remplacement sérique)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>700-104P</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme (pour la biologie moléculaire)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>ATTENTION : organique volatil ; à utiliser uniquement dans une hotte chimique</td></tr><tr><td>CMRL-1066 w/o L-Glutamine (poudre)</td><td>US Biological</td><td>C5900-01</td><td>qualité de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Erythromycin</td><td>Research Products International Corp</td><td>E57000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>Solution réactive de gentamicine</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Glucose (dextrose anhydre)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP350-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS (0,22 & micro ; M taille des pores)</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGSM33SS</td><td>pour filtrer stériliser les antibiotiques et autres solutions de petit volume</td></tr><tr><td>Mitomycine C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP25312</td><td>ATTENTION : cancérogène potentiel ; à utiliser uniquement dans une hotte chimique</td></tr><tr><td>N-acétyl-D-glucosamine</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>100068</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotides (amorces pour PCR)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OmniPrep (kit d’extraction génomique totale)</td><td>G Biosciences</td><td>786-136</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (100 mm & fois ; 15 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage Petroff-Hausser</td><td>Hausser scientific</td><td>HS-3900</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage Petroff-Hausser verre de couverture Hausser</td><td>scientific</td><td>HS-5051</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol 8000 (PEG)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de lapin non stérile à l’état de traces hémolysées jeunes (NRS)</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>31119-3</td><td>inactivé par la chaleur selon les instructions du fabricant</td></tr><tr><td>Semi-micro UV transparentes Cuvettes transparentes</td><td>USA Scientific</td><td>9750-9150</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8674-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectronic Genesys 5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution de sulfate de streptomycine</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6501-50G</td><td></td></tr><tr><td>Citrate trisodique dihydraté</td><td>Millipore Sigma</td><td>S1804-500G</td><td>Citrate de sodium pour BSK</td></tr></tbody></table>

manipulation génétique médiée par phage du spirochète de la maladie de lyme borrelia burgdorferi

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

L’introduction d’ADN étranger dans le spirochète Borrelia burgdorferi a été presque exclusivement réalisée par transformation par électroporation. Ce processus a une efficacité nettement inférieure dans le spirochète de la maladie de Lyme par rapport à d’autres bactéries à Gram négatif mieux caractérisées. Le taux de réussite de la transformation dépend fortement de la concentration de quantités d’ADN de haute qualité provenant de milieux spécifiques et est sujet à une variabilité importante d’une souche à l’autre. D’autres moyens d’introduire de l’ADN étranger (c.-à-d. vecteurs navettes, rapporteurs fluorescents et marqueurs de résistance aux antibiotiques) dans B. burgdorferi pourraient constituer un ajout important à l’arsenal d’outils utiles pour la manipulation génétique du spirochète de la maladie de Lyme. Les bactériophages ont été bien reconnus comme des mécanismes naturels pour le mouvement de l’ADN entre les bactéries dans un processus appelé transduction. Dans cette étude, une méthode a été développée pour utiliser le phage borrélial omniprésent φBB-1 pour transduire l’ADN entre les cellules de B. burgdorferi de même fond génétique et de milieux génétiques différents. L’ADN transduit comprend à la fois de l’ADN borrélial et de l’ADN hétérologue sous forme de petits vecteurs navette. Cette démonstration suggère une utilisation potentielle de la transduction médiée par les phages comme complément à l’électroporation pour la manipulation génétique du spirochète de la maladie de Lyme. Ce rapport décrit les méthodes d’induction et de purification du phage φBB-1 de B. burgdorferi, l’utilisation de ce phage dans les essais de transduction, ainsi que la sélection et le criblage de transductants potentiels.

L’utilisation de bactériophages pour déplacer l’ADN entre des souches ou des clones de B. burgdorferi plus facilement transformables qui sont récalcitrants à l’électrotransformation représente un autre outil pour l’étude moléculaire continue des déterminants de la maladie de Lyme. Le test de transduction décrit ici peut être modifié au besoin pour faciliter le mouvement de l’ADN entre les clones d’intérêt en utilisant un ou deux antibiotiques pour la sélection de transducteurs potentiels. La transduction de l’AD...

La capacité du bactériophage à déplacer l’ADN entre les cellules bactériennes en fait des outils efficaces pour la manipulation génétique de leurs hôtes bactériens. Présenté ici est une méthodologie pour induire, récupérer et utiliser φBB-1, un bactériophage de Borrelia burgdorferi, pour transduire l’ADN hétérologue entre différentes souches du spirochète de la maladie de Lyme.

Manipulation génétique médiée par phage du spirochète de la maladie de Lyme Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Ce protocole est important car il décrit un autre outil important pour disséquer la biologie moléculaire de l’agent de la maladie de Lyme Borrelia burgdorferi. Le principal avantage de cette technique est qu’en utilisant la transduction de phage, elle fournit une méthode alternative pour introduire l’ADN dans le Borrelia burgdorferi sans nécessiter l’application d’une impulsion électrique, comme dans l’électroporation. Cette méthode pourrait être utilisée pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires utilisés par Borrelia burgdorferi pour persister dans son cycle enzootique et finalement causer la maladie de Lyme chez l’homme.Pour commencer, inoculez 150 microlitres du clone approprié de Borrelia burgdorferi dans 15 millilitres de BSK dans des tubes centrifugeuses coniques stériles étroitement coiffés pour le protocole de transduction. Ensuite, complétez le milieu avec la concentration appropriée d’antibiotiques ou une combinaison d’antibiotiques pour la sélection et le maintien de l’ADN hétérologue dans le clone de Borrelia burgdorferi et incuber l’échantillon à 33 degrés Celsius. Une fois la culture développée, centrifuger le volume approprié de culture à 6 000 G pendant 10 minutes.Après avoir décanté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans quatre millilitres à BSK frais et transférer l’échantillon dans le plus petit tube stérile disponible pour contenir l’échantillon avec un minimum d’espace pour la tête. Ensuite, ajoutez la quantité appropriée d’agent inducteur à la concentration recommandée en fonction d’un volume de culture de quatre millilitres pour induire la production de phages, bouchez hermétiquement le tube et mélangez bien. Incuber l’échantillon à 33 degrés Celsius pendant deux à quatre heures.Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Centrifuger l’échantillon à 6 000 G pendant 10 minutes. Après avoir décanté le surnageant, remettre en suspension la pastille de cellule dans 15 millilitres de BSK.Compléter la culture préparée avec la concentration d’antibiotique appropriée décrite dans le manuscrit, tout en incubant l’échantillon à 33 degrés Celsius pendant 72 à 96 heures. Pour préparer des solutions pour la précipitation du PEG, préparez 500 millilitres de chlorure de sodium à cinq molaires, 500 millilitres de PEG à 40% et 100 millilitres de milieu de suspension comme décrit dans le manuscrit. Pour stériliser, autoclaver la solution, refroidir avant utilisation et conserver la température ambiante ou quatre degrés Celsius.Pour la précipitation PEG du phage du clone donneur de Borrelia burgdorferi, après 72 à 96 heures d’incubation, centrifuger les échantillons à 8 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Décanter le surnageant dans un tube conique propre de 50 millilitres et jeter la pastille de cellule. Ajouter le chlorure de sodium à cinq molaires à une concentration finale d’une molaire.Après avoir bien mélangé, bercer doucement à température ambiante pendant une heure. Centrifuger les échantillons à 8 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir décanté le surnageant dans un tube conique propre de 50 millilitres comme démontré précédemment, ajouter une solution de 40% PEG-8000 au surnageant jusqu’à une concentration finale de 10%Bien mélanger et mettre sur la glace pendant plus d’une heure, jusqu’à toute la nuit.Centrifuger vers les échantillons à 8 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, comme démontré précédemment. Jetez le surnageant et retirez autant de liquide en excès que possible sans perdre aucune pastille, qui contient les particules de phage. Remettez la pastille en suspension dans un volume minimal de milieu de suspension en utilisant le milieu de suspension pour laver le côté de la bouteille et recueillir toutes les particules de phage potentielles.Traiter l’échantillon de phage récupéré avec un volume égal de chloroforme en fonction du volume de remise en suspension. Bien mélanger l’échantillon et centrifuger à 8 000 G pendant 10 minutes. Ensuite, retirez la couche aqueuse dans un tube propre, en évitant les couches d’interface épaisses.Après avoir déterminé le volume récupéré, après le premier traitement au chloroforme, traiter à nouveau l’échantillon avec une quantité de chloroforme égale à 10 % de ce volume. Transférer la couche aqueuse dans un tube propre tout en prenant soin d’éviter les couches d’interface ou organiques. Utilisez le phage immédiatement ou conservez-le à quatre degrés Celsius.Après avoir préparé des cultures de Borrelia burgdorferi à utiliser comme receveur dans les essais de transduction comme démontré précédemment, centrifuger le volume de culture à 6 000 G pendant 10 minutes. Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 14,5 millilitres de BSK frais. Ajouter moins de 500 microlitres d’échantillon de phage précipité par PEG à la culture du clone receveur.Après avoir bien mélangé, incuber à 33 degrés Celsius pendant 72 à 96 heures. Effectuer la sélection des transducteurs par placage en phase solide après mélange avec un phage précipité de PEG comme décrit dans le manuscrit. En fonction des antécédents du clone receveur, vérifier que les colonies apparaissent dans l’agarose sur les plaques de sélection après 10 à 21 jours d’incubation.Choisissez au moins 5 à 10 colonies qui poussent dans l’assiette en présence des deux antibiotiques à l’aide d’une pipette borosilicatée stérilisée de 5,75 pouces bouchée en coton et inoculez-les dans 1,5 millilitre de BSK avec l’antibiotique approprié. L’amplification par PCR des gènes a été réalisée sur 10 des clones codant pour la résistance à la kanamycine et à la gentamycine. Le gène de résistance à la kanamycine pourrait être amplifié à partir du donneur c1673 et des transductants potentiels, mais pas du receveur c1706.De même, le gène de résistance à la gentamycine pourrait être amplifié à partir du receveur c1706 et des transductants potentiels, mais pas du donneur, représentant des événements de transduction. Démontrer que la cassette de résistance à la kanamycine a été transduite par 5BB1 du donneur au receveur. Le bruit de fond des transductants a été déterminé à l’aide de marqueurs spécifiques à la souche.Le clone c1673 et l’arrière-plan CA-112A codent des amplicons spécifiques quatre, cinq et six, alors que c1706, qui a un arrière-plan B31 à passage élevé, ne le fait pas. De même, les transducteurs un et deux manquaient d’amplicons quatre, cinq et six, démontrant que les clones ont le fond c1706 et ont acquis le gène de résistance à la kanamycine à partir de c1673. Pour la précipitation du phage en PEG, effectuer toutes les étapes avec soin pour maximiser le rendement du phage et traiter soigneusement le phage remis en suspension avec du chloroforme afin d’éliminer autant de contaminants de PEG et de milieux de culture que possible avant l’utilisation et l’entreposage du phage.Une fois que le test de transduction a été effectué avec succès et que le transducteur a été vérifié, ces clones sont alors disponibles pour répondre aux questions qui nécessitent Borrelia burgdorferi génétiquement modifié. Le développement de cette technique permettra, espérons-le, aux chercheurs de manipuler génétiquement les souches de Borrelia burgdorferi pour lesquelles l’introduction de l’ADN par électroporation est actuellement difficile.

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