Méthode pour étudier la toxicité et l’agrégation de la α-synucléine à l’aide d’un modèle de levure humanisée

Il s’agit d’une méthode simple pour surveiller les phénotypes cellulaires et les caractéristiques des noyaux R-passe. Il peut également être souvent récupéré dans une étude à l’échelle du génome pour trouver les facteurs génétiques affectant la stabilité des noyaux R-pass. Comme il s’agit d’un organisme moteur bien établi, cette technique est facile et ne nécessite pas beaucoup de temps et d’efforts par rapport à l’utilisation de lignées cellulaires humaines ou de modèles animaux.

L’agrégation des noyaux R-pass est étroitement associée à la maladie de Parkinson. Les protéines ou les produits chimiques susceptibles d’affecter la stabilité des noyaux R-pass peuvent être testés dans ce modèle de levure humanisée. Pour commencer, appliquez trois colonies simples sur une plaque de gélose SD-URA pour la sélection de cellules contenant des plasmides alpha-synucléines.

Ensuite, inoculer les transformants de levure à trois patchs par souche dans 3 millilitres de SRD-URA pour la croissance sélective de levures contenant les plasmides avec 2% de raffinose pour l’inhibition de l’induction de l’alpha-synucléine sous le promoteur Gal1 et 0,1% de glucose. Incuber la culture inoculée à 30 degrés Celsius sous agitation à 200 rotations par minute. Le lendemain, inoculez les cellules cultivées pendant la nuit dans 3 millilitres de SRD-URA frais jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité optique de 0,2 à 600 nanomètres.

Ensuite, incuber la culture pendant six heures à 30 degrés Celsius sous agitation à 200 rotations par minute. Mesurer la densité optique à 600 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre. Ensuite, diluez les échantillons à une densité optique de 0,5 à 600 nanomètres avec de l’eau distillée stérile dans la voie 1 d’une plaque de 96 puits pour égaliser le nombre de cellules dans chaque culture.

Effectuez des dilutions en série 5 fois des cellules de levure en ajoutant 160 microlitres d’eau distillée stérile aux cinq voies suivantes et assurez un volume total de 40 microlitres lors de la dilution en série des cellules dans chaque voie. Utilisez une pipette multicanal pour transférer 10 microlitres de chaque puits afin de repérer les échantillons sur les plaques de gélose SD-URA pour les témoins et les plaques de gélose SG-URA pour surveiller la toxicité. Incuber les plaques tachetées à l’envers à 30 degrés Celsius pendant quatre jours.

Prenez des images des plaques toutes les 24 heures jusqu’au quatrième jour, puis analysez les données en comparant les différences de croissance entre les souches repérées à l’œil. Inoculer les trois transformants de levure patchés par souche en trois millilitres de SRD-URA et incuber à 30 degrés Celsius sous agitation à 200 rotations par minute pendant la nuit. Le lendemain, mesurez la densité optique des cellules cultivées pendant la nuit à 600 nanomètres et inoculez les cellules dans un total de 200 microlitres de SD-URA et SG-URA frais dans des plaques de 96 puits.

Ajustez le volume final, y compris les cellules, à 200 microlitres et ajustez la densité optique initiale de la cellule à 0,05 à 600 nanomètres. Ajustez les paramètres du programme dans la plaque de microtitration. Réglez la température cible à 30 degrés Celsius, l’intervalle de temps à 15 minutes, la durée de secousse à 890 secondes, l’amplitude de secousse à 5 millimètres et la mesure à 600 nanomètres.

Incuber la plaque pendant 2-3 jours pour que toutes les souches atteignent la phase stationnaire dans un lecteur de microplaques. Analysez les données en traçant la courbe de croissance. Inoculer les transformants de levure rapiécés en 3 millilitres de SRD-URA et les cultiver pendant la nuit à 30 degrés Celsius sous agitation à 200 rotations par minute.

Le lendemain, inoculer à nouveau les cellules cultivées pendant la nuit dans 3 millilitres de SRD-URA frais à une densité optique de 0,003 à 600 nanomètres, puis incuber la culture à 30 degrés Celsius sous agitation à 200 rotations par minute, jusqu’à ce que la densité optique atteigne 0,2. Ajoutez ensuite 300 microlitres de 20% de galactose, puis incuber pendant encore 6 heures à 30 degrés Celsius sous agitation à 200 rotations par minute. Prélever un millilitre de la culture cellulaire par centrifugation à 800 g pendant 5 minutes et jeter le surnageant.

Remettez délicatement en suspension la pastille cellulaire dans 30 microlitres d’eau distillée. Préparez un tampon de gel agarose sur une lame de verre. Remettez les cellules en suspension et chargez cinq microlitres de la suspension cellulaire sur la lame de verre, et couvrez les cellules à l’aide du tampon d’agarose coupé pour examen.

Pour effectuer une imagerie microscopique avec un objectif 100x, utilisez l’option de capture d’écran pour générer des images à l’aide du programme et sélectionnez le fond clair pour focaliser la cellule avec un objectif 100x à l’aide d’huile d’immersion. Passez à un filtre à fluorescence GFP et réglez le temps d’exposition de l’image entre 50 millisecondes et 300 millisecondes pour obtenir une image claire en équilibrant le rapport signal sur bruit. Ouvrez le fichier image et analysez les données en comptant les cellules en fonction du nombre de foyers dans les cellules à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.

L’expression de synucléine sous le promoteur Gal1 dans le vecteur PRS426 a montré un retard de croissance significatif sur la plaque de gélose contenant du galactose comme inducteur. La différence de croissance par expression de synucléine a également été observée dans des cultures liquides. Dans les deux conditions de culture, la synucléine de type sauvage et les variantes présentant des mutations E46K ou A53T ont montré des défauts de croissance dus à la toxicité de la synucléine.

Cependant, la variante de la synucléine A30p, qui ne forme pas d’agrégats, a montré un phénotype non toxique. Les souches présentant une cytotoxicité sévère ont montré des foyers d’agrégats de synucléine, mais dans la variante A30p, une forme moins toxique de synucléine a été diffusée dans les cellules. Pour obtenir des résultats reproductibles, il est important d’utiliser la cellule au même stade de croissance dans chaque expérience, en particulier lorsque vous surveillez les phénotypes associés à la synucléine.

Comme nous l’avons montré dans les données de microscope fluorescent, la synucléine peut former des agrégats plus importants. Par conséquent, il peut être simplement fractionné par centrifugation et peut être quantifié par Western blot à l’aide d’anticorps spécifiques de la synucléine. Cette technique est applicable au criblage à haut débit pour trouver de nouveaux facteurs génétiques et composés chimiques affectant l’agrégation de la synucléine.

Ainsi, nous espérons trouver de nouveaux candidats thérapeutiques pour la maladie de Parkinson.