Imagerie de la cochlée vieillissante avec la microscopie à fluorescence à feuille de lumière

Nous avons développé un microscope à feuille de lumière qui peut numériser toute la cochlée. Ce microscope a des objectifs montés sur air avec une longue distance de travail qui peuvent imager de petites cochlées de souris jusqu’à un grand os temporal humain. Il coupe en série la cochlée avec un faisceau laser sans causer de destruction mécanique.

Notre méthode d’imagerie peut être utilisée pour évaluer les changements pathologiques dans la cochlée, tels que la perte de cellules ciliées et de neurones ganglionnaires en spirale due au vieillissement. Après avoir euthanasié et décapité une souris, faites une incision dorso-ventrale à travers le cerveau pour hémisecter le crâne. Retirez le cerveau et identifiez la bulle ronde dans la partie basoventrale du crâne.

Ouvrez la bulle avec des rongeurs. Ensuite, visualisez et retirez la cochlée. Sous un microscope à dissection à un grossissement cinq fois, percer la fenêtre ovale et retirer les étriers avec un pic tranchant.

Ensuite, insérez un pic dans la fenêtre ronde pour percer la membrane. Pour effectuer la fixation, couvrez la fenêtre ronde ouverte avec l’embout coupé d’un kit de perfusion qui est attaché à une seringue d’un millilitre remplie de deux millilitres de formol. Infuser lentement le formol à travers les espaces périlymphatiques d’une cochlée sur une période de deux minutes, en s’assurant que le formol sort de la cochlée par la fenêtre ovale ouverte.

Coupez l’excès de tissu de la cochlée. Plongez-le dans une bouteille contenant 10% de formol et placez-le sur un rotateur pendant la nuit. Pour la décalcification, rincer la cochlée dans PBS trois fois pendant cinq minutes chacune.

Tremper dans un flacon contenant une solution à 10% d’EDTA. Incuber pendant quatre jours avec rotation, en changeant la solution quotidiennement. Ensuite, perfuser la cochlée avec du PBS trois fois et immerger pendant 15 minutes entre les changements pour éliminer tout l’EDTA.

Après le lavage, déshydrater la cochlée avec des concentrations croissantes d’éthanol pendant 30 minutes à chaque concentration. Colorer toute la cochlée par immersion dans une solution de rhodamine B pendant une nuit avec rotation. Retirer l’excès de colorant de la cochlée avec deux changements d’éthanol à 100% avec incubation pendant cinq minutes pour chaque changement.

Transférer la cochlée colorée dans deux changements de solution Spalteholz pendant 30 minutes à chaque changement. Laisser toute la nuit dans la solution de compensation avec rotation. Fixez la cochlée à une tige d’échantillon à l’extrémité ovale et ronde de la membrane de la fenêtre.

Assurez-vous que la solution de compensation reste dans la cochlée et que des bulles ne se forment pas. Fixez les extrémités ovales et rondes de la cochlée humide à la tige sèche de l’échantillon à l’aide de colle activatrice UV. Faites durcir la colle UV pendant 10 secondes en vous déplaçant autour de la cochlée avec une lumière UV.

Suspendre la cochlée dans la chambre d’imagerie dans une cellule de fluoromètre à quartz optiquement transparente remplie de solution Spalteholz avec la tige d’échantillon fixée à un support rotatif qui est également fixé à l’étage de translation X/Z. Ensuite, utilisez un programme conçu sur mesure pour déplacer l’échantillon à travers la feuille de lumière dans les étapes de l’axe X et de l’axe Z et créez une pile d’images 2D dans toute la cochlée. Pour traiter l’image, transférez la pile d’images sur un autre ordinateur et chargez-la dans un programme de rendu 3D pour la reconstruction et la quantification 3D.

Le rendu direct du volume d’une cochlée de souris a montré les fenêtres ovales et rondes, l’organe de Corti avec les cellules ciliées, le canal de Rosenthal a été segmenté et le volume rendu, et a montré des neurones ganglionnaires en spirale, ou SGN, le long de sa longueur. À l’aide de TSLIM, la cochlée d’une jeune souris de trois mois et d’une souris de 23 mois ont été imagées et comptées pour les SGN. Le nombre de cellules SGN en fonction de la distance du canal de Rosenthal représenté dans un graphique linéaire a montré des SGN plus importants chez le jeune animal aux extrémités médianes et apicales de la cochlée par rapport à l’animal plus âgé.

Cette perte apparente de SGN a été visualisée à l’aide d’un logiciel d’analyse de cluster et de rendu 3D. Les différences de densité SGN ont été représentées sur une échelle de couleurs où les grappes à haute densité sont jaunes et le bleu représente les régions de densité inférieure. L’analyse en grappes a clairement décrit les régions de densité cellulaire plus faible le long du canal de Rosenthal.

La microscopie à feuille de lumière est conçue pour produire une pile d’images bien alignée à partir de laquelle des rendus de volume 3D de structures peuvent être produits. Les programmes de rendu 3D permettent l’évaluation quantitative des structures et des relations anatomiques entre différentes structures. Cependant, étant donné que les programmes de rendu 3D offrent de nombreux paramètres utilisateur différents, il existe une courbe d’apprentissage importante pour utiliser efficacement ces programmes.