Name: Isolement de petits follicules préantraux de l’ovaire bovin à l’aide d’une combinaison de fragmentation, d’homogénéisation et de filtration en série (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Découvrez une méthode mécanique efficace pour isoler les follicules préantraux de l'ovaire bovin. Cette technique améliore la viabilité des échantillons et ouvre de nouvelles perspectives pour la recherche en folliculogenèse et la préservation de la fertilité.

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Ce projet a été partiellement financé par le projet multi-états W4112 de l’USDA et le prix UC Davis Jastro Shields à SM.
Les auteurs aimeraient remercier Central Valley Meat, Inc. d’avoir fourni les ovaires bovins utilisés dans toutes les expériences. Les auteurs remercient également Olivia Silvera pour son aide au traitement des ovaires et à l’isolement des follicules.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le présent protocole détaille une méthode reproductible pour récupérer les follicules préantraux à un stade précoce, en particulier aux stades primaire et secondaire précoce, de l’ovaire bovin. Ce protocole s’appuie sur les rapports précédents 20,25,30,34,35,36 et fournit des optimisations qui permettent d’isoler un nombre significatif de follicules d’un ovaire individuel.<sup class=...

Les follicules ovariens sont les unités fonctionnelles de l’ovaire, responsables de la production du gamète (ovocyte) ainsi que des hormones essentielles à la fonction de reproduction et à la santé globale. Les follicules primordiaux se forment dans l’ovaire au cours du développement fœtal ou dans la période néonatale selon les espèces1, et ils constituent la réserve ovarienne d’une femelle. La croissance folliculaire commence par l’activation des follicules primordiaux qui quittent la piscine de repos et entrent dans la phase de croissance. La folliculogenèse préantrale, englobant tous les stades folliculaires avant le développement de l’antre, est un processus hautement dynamique qui nécessite des changements morphologiques et métaboliques synchrones dans l’ovocyte et les cellules granulosa environnantes, entraînés par une communication étroite entre ces deux types de cellules 2,3. Les follicules préantraux constituent la majorité des unités folliculaires présentes dans l’ovaire à un moment donné4. On estime que le développement par les stades préantraux de la folliculogenèse est de plusieurs semaines plus long que le développement antral 5,6, et ce temps est nécessaire pour que les cellules ovocytaires et somatiques acquièrent une maturité suffisante pour entrer dans la phase finale de développement (c’est-à-dire le stade antral) et se préparer à l’ovulation, à la fécondation et au développement embryonnaire 7,8,9.
Une grande partie des connaissances actuelles sur la follicululogenèse préantrale ovarienne provient des modèles murins10,11,12,13, en partie en raison de la facilité de récupération d’un grand nombre de ces follicules à partir d’un ovaire plus petit et moins fibreux. Bien que les rapports d’isolement d’un grand nombre de follicules préantraux à partir d’ovaires bovins remontent à environ 30 ans14, une compréhension plus complète des processus régulant le développement de ces follicules à un stade précoce n’a pas été réalisée, en grande partie en raison du manque de méthodes optimisées, efficaces et reproductibles pour récupérer un nombre suffisant de follicules préantraux viables, en particulier aux premiers stades de développement. Avec l’intérêt croissant pour la préservation de la réserve ovarienne pour une utilisation future dans la procréation assistée chez l’homme, les vaches deviennent un modèle attrayant en raison de leur structure ovarienne plus similaire15. Cependant, l’ovaire bovin est nettement plus riche en collagène que l’ovaire de souris16, ce qui rend l’isolement mécanique à l’aide de méthodes décrites pour la souris très inefficace. Les efforts visant à étendre les techniques de préservation de la fertilité comprennent la croissance in vitro complète des follicules préantraux jusqu’au stade antral, suivie de la maturation in vitro (MIV) des ovocytes fermés, de la fécondation in vitro (FIV) et de la production et du transfert d’embryons17. Jusqu’à présent, tout ce processus n’a été réalisé que chez la souris18. Chez les bovins, les progrès vers la croissance des follicules in vitro se limitent à quelques rapports avec des stades folliculaires variables au début de la culture, ainsi qu’une durée variable de culture entre les protocoles17,19.
Les méthodes décrites dans la littérature pour la récolte des follicules préantraux de l’ovaire bovin ont principalement utilisé des techniques mécaniques et enzymatiques, isolées ou en combinaison 2,14,17,20. Le premier rapport d’un protocole d’isolement du follicule préantral bovin utilisait un homogénéisateur tissulaire et une filtration en série pour traiter les ovaires entiers20. Cette étude a été suivie de rapports combinant des procédures mécaniques et enzymatiques utilisant la collagénase14. Un thème récurrent lors de l’utilisation de la collagénase pour digérer le tissu ovarien est le risque potentiel de dommages à la membrane basale folliculaire, ce qui peut compromettre la viabilité du follicule 14,21,22,23. Par conséquent, différentes combinaisons de méthodes mécaniques ont été employées, telles que l’utilisation d’un hachoir à tissus et de pipetage répété ou d’un hachoir à tissus combiné à l’homogénéisation20,24,25,26. Une autre technique mécanique qui a été décrite utilise des aiguilles pour disséquer les follicules préantraux directement à partir du tissu ovarien, ce qui est particulièrement utile pour isoler des follicules secondaires plus grands (>200 μm). Cependant, ce processus prend du temps, est inefficace pour isoler les petits follicules préantraux et dépend des compétences lorsqu’il est tenté dans les ovaires bovins 19,27,28.
Tirant parti des différentes techniques décrites dans la littérature, ce protocole visait à optimiser l’isolement des follicules préantraux à partir d’ovaires monobovins d’une manière simple, cohérente et efficace qui évite l’incubation dans des solutions enzymatiques. L’amélioration des méthodes d’isolement des follicules préantraux permettra de mieux comprendre cette étape de la folliculogenèse et de permettre le développement de systèmes de culture efficaces pour développer les follicules préantraux jusqu’au stade antral. Les procédures détaillées décrites ici pour l’isolement des follicules préantraux d’un grand mammifère tel que l’espèce bovine seront vitales pour les chercheurs qui souhaitent étudier la folliculogenèse précoce chez une espèce non murine qui est transposable à l’homme.

<table><tbody><tr><td>5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>63A54</td><td>Pipette Pasteur qui peut être utilisée pour déloger les follicules des débris lors de la recherche dans la boîte de Pétri 16</td></tr> % <tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td>Dilué à 4 %; fixation des follicules pour l’immunocoloration</td></tr><tr><td>20 mL Seringue Luer-lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z116882-100EA</td><td>Seringue utilisée avec l’aiguille 18 G pour déloger les follicules de la 40 &mu ; Filtre à cellules m</td></tr><tr><td>#21 Lame de scalpel stérile</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-365-023</td><td>Utilisé pour couper les ovaires et enlever la médule</td></tr><tr><td>40 &mu ; m Passoire à cellules</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>22-363-547</td><td>Utilisé pour filtrer le filtrat du 300 &mu ; Filtre à cellules m</td></tr><tr><td>104 mm Entonnoir en plastique</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-348C</td><td>La taille peut varier, mais assurez-vous que l’étamine est coupée de manière appropriée et que l’homogénat ovarien ne débordera pas sur</td></tr><tr><td>300 &mu ; m Crépine de cellules</td><td>pluriSelect&nbsp ;</td><td>43-50300-03</td><td>Utilisé pour filtrer le filtrat de l’étamine&nbsp ;</td></tr><tr><td>Fiole Erlenmeyer de 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB500500</td><td>Entonnoir et fiole utilisés pour récupérer le filtrat de l’étamine.</td></tr><tr><td>Aiguilles stériles Air-Tite 18 g</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-817-151</td><td>18 g offre une pression suffisante pour déloger les follicules du 40 &mu ; Filtre à cellules m</td></tr><tr><td>Air-Tite Aiguilles stériles 27 G 13 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-171</td><td>Aiguilles pouvant être utilisées pour manipuler tout débris dans lequel les follicules sont coincés</td></tr><tr><td>BD Hoechst 33342 Solution Fisher</td><td>Scientific</td><td>BDB561908</td><td>Coloration fluorescente de l’ADN</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G&nbsp ;</td><td>Composant du milieu de lavage des follicules</td></tr><tr><td>Cheese Cloth</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71748-00</td><td>Première étape de filtrage de l’homogénat ovarien destinée à éliminer les gros débris tissulaires Lames</td></tr> de <tr><td>rasoir de sécurité classiques à double tranchant</td><td>Wilkinson Sword</td><td>N/A</td><td>Lames de rasoir qui s’adaptent le mieux au hachoir à tissus McIlwain et ne s’émoussent pas rapidement</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire Donkey-Anti-Rabbit, Alexa Fluor 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td>Anticorps secondaire pour l’immunocoloration</td></tr><tr><td>Eisco Latex Pipette Bulbes Fisher</td><td></td><td>Scientific S29388</td><td>Poire en caoutchouc à utiliser avec les pipettes Pasteur</td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Composant du milieu de lavage des follicules</td></tr><tr><td>Homogénéisateur</td><td>VWR</td><td>10032-336</td><td>Homogénéiser le tissu ovarien pour libérer les follicules&nbsp ;</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v2.3.1</td><td>Logiciel utilisé pour l’analyse de l’immunolocalisation par fluorescence</td></tr><tr><td>McIlwain</td><td>Tissue Chopper Ted Pella</td><td>10184</td><td>Utilisé pour couper le tissu ovarien suffisamment petit pour l’homogénéisation</td></tr><tr><td>Microscope - Stéréoscope</td><td>Olympus</td><td>SZX2-ILLT</td><td>Microscope de dissection utilisé pour la recherche et le prélèvement des follicules du filtrat</td></tr><tr><td>Microscope - Inversé</td><td>Nikon</td><td>Diaphot 300</td><td>Microscope inversé utilisé pour la visualisation en fond clair à fort grossissement de follicules isolés</td></tr><tr><td>Microscope - Inversé</td><td>ECHO</td><td>Revolve R4</td><td>Microscope inversé utilisé pour la visualisation en fond clair et par épifluorescence de follicules isolés</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td>Huile pour couvrir les gouttes de fluide de lavage des follicules afin d’éviter l’évaporation pendant la recherche</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Composant du milieu de lavage des follicules Sérum d’âne</td></tr><tr><td>normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-001</td><td>Réactif pour tampon de blocage de l’immunocoloration</td></tr><tr><td>Nunc Plats à 4 puits pour FIV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>144444</td><td>Plats à 4 puits pour l’isolement et le lavage des follicules Solution</td></tr> de <tr><td>pénicilline-streptomycine 100x</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>Composant du milieu de lavage des follicules</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 60 mm OD x 13,7 mm</td><td>Ted Pella</td><td>10184-04</td><td>Boîte de Pétri qui s’adapte le mieux à la McIlwain Tissue Chopper</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td>Tampon de lavage pour ovaires et follicules</td></tr><tr><td>Planche à découper en plastique</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>Planche à découper de taille suffisante pour couper en toute sécurité ovaires</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone (PVP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-100</td><td>L’ajout de PVP (0,1 % p/v) au PBS empêche les follicules de coller à la plaque ou les uns aux autres&nbsp ;</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Milieu de montage pour cellules ou tissus marqués par fluorescence</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Kit de nettoyage de colonne d’ARN</td></tr><tr><td>R</td><td>The R Foundation</td><td>v4.1.2</td><td>Logiciel d’analyse statistique</td></tr><tr><td>Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Anticorps polyclonal</td><td>Abcam</td><td>ab181701</td><td>Cx37 Anticorps primaire pour l’immunocoloration</td></tr><tr><td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td>Kit de synthèse d’ADNc</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio, PBC</td><td>v2021.09.2</td><td>Logiciel d’analyse statistique</td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde de sodium (1N/Certified)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td>Utilisé pour augmenter le pH du milieu à 7,6-7,8</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium (NaPyr)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Composant du moyen de lavage des follicules Boîte de</td></tr><tr><td>Pétri carrée 100 mm x 15 mm&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60872-310</td><td>Les boîtes de Pétri grillagées permettent une identification plus efficace des follicules.</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1725271</td><td>Mastermix pour réaction PCR</td></tr><tr><td>Filtre fileté Steritop Filtre fileté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2GPT02RE</td><td>Utilisé pour stériliser le milieu de lavage des follicules</td></tr><tr><td>Coloration de gel d’ADN sans danger pour SYBR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td>Coloration des produits PCR visuels sur gel d’agarose</td></tr><tr><td>TCM199 avec Hank' s Sels</td><td>Gibco</td><td>12-350-039</td><td>Composant du milieu de lavage des follicules</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Détergent pour tampon de perméabilisation d’immunocoloration</td></tr><tr><td>Réactif de trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>réactif d’isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td>Utilisé pour tester la viabilité des follicules isolés</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td></td><td></td><td>Détergent pour tampon de lavage immuno-colorant</td></tr><tr><td>Plaque chauffante Universel</td><td>WTA</td><td>20931</td><td>Plaque chaude pour maintenir les follicules à 38,5 &deg ; C lors de la recherche au microscope</td></tr><tr><td>Wiretrol II Micropipettes calibrées</td><td>Drummond</td><td>50002-005</td><td>Micropipettes en verre pour manipuler les follicules</td></tr></tbody></table>

isolement de petits follicules préantraux de l’ovaire bovin à l’aide d’une combinaison de fragmentation, d’homogénéisation et de filtration en série

Isolation of Small Preantral Follicles from the Bovine Ovary Using a Combination of Fragmentation, Homogenization, and Serial Filtration

Comprendre le processus complet de la folliculogenèse des mammifères est crucial pour améliorer les technologies de procréation assistée chez le bétail, les humains et les espèces en voie de disparition. La recherche s’est principalement limitée aux follicules antraux et aux grands follicules préantraux en raison de la difficulté d’isoler les follicules préantraux plus petits, en particulier chez les grands mammifères tels que les espèces bovines. Ce travail présente une approche efficace pour récupérer un grand nombre de petits follicules préantraux d’un seul ovaire bovin. Le cortex des ovaires bovins individuels a été tranché en cubes de 500 μm à l’aide d’un hachoir à tissus et homogénéisé pendant 6 minutes à 9 000-11 000 tr/min à l’aide d’une sonde de 10 mm. Les gros débris ont été séparés de l’homogénat à l’aide d’un tissu à fromage, suivi d’une filtration en série à travers des crépines cellulaires de 300 μm et 40 μm. Le contenu retenu dans la passoire de 40 μm a été rincé dans un plat de recherche, où les follicules ont été identifiés et recueillis dans une goutte de milieu. La viabilité des follicules collectés a été testée par coloration bleue de trypan. Cette méthode permet d’isoler un grand nombre de petits follicules préantraux viables d’un seul ovaire bovin en 90 minutes environ. Fait important, cette méthode est entièrement mécanique et évite l’utilisation d’enzymes pour dissocier le tissu, ce qui peut endommager les follicules. Les follicules obtenus à l’aide de ce protocole peuvent être utilisés pour des applications en aval telles que l’isolement de l’ARN pour la RT-qPCR, l’immunolocalisation de protéines spécifiques et la culture in vitro .

Vue d’ensemble et étapes critiques Grâce à ce protocole, les petits follicules préantraux bovins peuvent être isolés de manière fiable à partir d’ovaires simples en nombre pertinent expérimentalement. Sur un total de 30 répétitions, une moyenne de 41 follicules a été obtenue par répétition, avec une plage de 11 à 135 follicules (Figure 4A). Dans 14 réplications, les follicules ont été caractérisés pour le stade de développement décrit précédemment26</sup...

Faire progresser l’étude de la folliculogenèse préantrale nécessite des méthodes efficaces d’isolement des follicules à partir d’ovaires simples. Un protocole mécanique simplifié pour l’isolement des follicules des ovaires bovins à l’aide d’un hachoir et d’un homogénéisateur de tissus est présenté ici. Cette méthode permet de prélever un grand nombre de follicules préantraux viables à partir d’un seul ovaire.

Isolement de petits follicules préantraux de l’ovaire bovin à l’aide d’une combinaison de fragmentation, d’homogénéisation et de filtration en série

Understanding the full process of mammalian folliculogenesis is crucial for improving assisted reproductive technologies in livestock, humans, and ...

Ce protocole permet l’isolement efficace et reproductible des follicules pré-antraux à un stade précoce d’un seul ovaire bovin et crée de nouvelles opportunités pour l’étude de la folliculogenèse ovarienne chez une espèce non bovine. En utilisant un plus grand nombre de follicules d’un seul ovaire, cette technique permet des traitements in vivo avant la récolte des ovaires, ou l’obtention de plusieurs échantillons au fil du temps à partir du même animal par biopsie ovarienne. L’isolement et la cryoconservation des follicules pré-antraux à un stade précoce peuvent être une option précieuse pour la préservation de la fertilité chez les jeunes femmes subissant un traitement gonadotoxique tel que la chimiothérapie, ainsi que la préservation du germoplasme d’espèces menacées.Stephanie McDonnell, Amanda Morton et Juliana Candelaria, doctorantes de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, transférez les ovaires en laboratoire dans un PBS chaud et stérile contenant Pen-Strep et sélectionnez des ovaires avec de nombreux petits follicules antraux et aucun corps lutécium proéminent. Enlevez tout excès de tissu conjonctif et de graisse des ovaires à l’aide de ciseaux.Transférer un ovaire sur la planche à découper sur le papier de paillasse. À l’aide d’un scalpel, couper l’ovaire en deux longitudinalement d’un site de fixation ligamentaire au site de fixation opposé. Gardez une moitié de l’ovaire sur la planche à découper à traiter et replacez l’autre moitié de l’ovaire dans du PBS chaud contenant Pen-Strep.Pour enlever la moelle, tranchez le long de la courbure de l’ovaire à environ 2 millimètres de la surface sans couper à travers le cortex avec la moelle exposée tournée vers le haut. Trancher à travers la coupe pour enlever la majorité de la moelle. Retournez l’ovaire à moitié de sorte que l’épithélium soit tourné vers le haut et utilisez le scalpel pour finir de couper la moelle du cortex et couper tout tissu conjonctif blanc restant autour du bord de la pièce ovarienne qui était reliée aux ligaments.Une fois que la majorité de la moelle est enlevée, utilisez le scalpel pour couper le cortex à environ 1 millimètre d’épaisseur tout en manipulant le scalpel avec de petits mouvements de va-et-vient pour raser le reste de la moelle, puis couper chaque cortex ovarien en deux morceaux. Gardez les morceaux de cortex dans du PBS chaud contenant Pen-Strep jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être hachés. Transférer un seul morceau du cortex dans la boîte de Petri sur le hachoir à tissus et mouiller le tissu avec trois ou quatre gouttes de PBS chaud contenant Pen-Strep.Tout en maintenant le morceau de tissu stable avec une paire de pinces, appuyez une fois sur le bouton de réinitialisation pour démarrer le hacheur de tissu. Une fois que tout le morceau du cortex a été coupé en bandes, utilisez le bouton du porte-lame pour soulever la lame de la boîte de Petri et les pinces pour enlever tout tissu de la lame. Après avoir fait pivoter le support de plaque de 90 degrés, appuyez à nouveau sur le bouton de réinitialisation et passez entièrement la lame à travers les bandes de tissu.Utilisez le bouton du porte-lame pour soulever la lame de la boîte de Petri et la pince pour enlever tout tissu de la lame, comme démontré précédemment. À l’aide d’une pipette de transfert et d’un PBS chaud contenant du Pen-Strep, laver le tissu haché dans un tube conique préchauffé de 50 millilitres. Remettez le tube conique dans l’eau ou le bain de perles pour garder le tissu haché au chaud tout en répétant la procédure de hachage avec les trois autres moitiés de l’ovaire.Pour de meilleurs résultats de coupe, utilisez le pilote d’écrou pour retirer l’écrou du bras de découpe et retirez la rondelle et le fermoir de la lame. À l’aide d’une pince, retirez la lame du bras de coupe. Retournez de sorte que le bord inutilisé soit face à la boîte de Petri et replacez-le sur le bras de hachage.Après vous être assuré que l’homogénéisateur est branché et que la vitesse est réglée sur la deuxième barre, insérez la sonde du générateur de 10 millimètres dans l’unité conformément aux spécifications du fabricant. Ensuite, réglez une minuterie pendant 1 minute et insérez la sonde dans le tube conique de 50 millilitres contenant le tissu cortex haché d’un ovaire et suffisamment de PBS contenant Pen-Strep pour remplir le tube à la ligne de 25 millilitres. La profondeur à laquelle la sonde est insérée doit être égale à 1/3 de la hauteur du liquide mesurée à partir du fond de la chambre.Une fois la minuterie démarrée, allumez l’homogénéisateur, en veillant à ce que le bas de la sonde ne touche pas le tube et maintenez le tube immobile pendant que l’homogénéisateur est allumé. Après 1 minute d’homogénéisation, retirez la sonde du tube, puis retirez tout tissu conjonctif obstruant les trous de ventilation dans l’espace entre le couteau rotor et le tube du rotor ou les morceaux de cortex coincés dans la sonde à l’aide d’une pince et replacez-les dans le tube. Verser le tissu dispersé dans l’entonnoir recouvert d’étamine, inséré dans l’erlenmeyer et rincer le contenu du tube dans l’entonnoir à l’aide de PBS chaud.Enfin, rincez l’étamine avec du PBS chaud. Forcez le liquide en petits fragments à passer à travers les trous du tissu en tordant l’étamine autour des fragments de tissu vers le bas et en pressant jusqu’à ce que tout excès de liquide et de tissu soit retiré de l’étamine. Après avoir rouvert l’étamine sur l’entonnoir, rincez l’étamine avec du PBS contenant Pen-Strep à l’aide d’une pipette de transfert et, encore une fois, pressez tous les fragments de tissu résiduels à travers le chiffon.À l’aide d’un hémostatique, tenir la crépine cellulaire de 300 micromètres au-dessus d’un bécher de 200 millilitres et verser le filtrat dans l’erlenmeyer à travers la crépine cellulaire. Si la crépine cellulaire est obstruée par du tissu, tapotez-la doucement contre le bécher, puis retournez la passoire et tapotez les gros débris de tissu sur le papier de banc. Rincer le contenu de la fiole à l’aide de PBS chaud contenant du Pen-Strep jusqu’à ce qu’il ne reste plus aucun fragment de tissu et verser dans la passoire cellulaire.Ensuite, tout en tenant la passoire cellulaire de 40 micromètres avec un hémostatique sur un deuxième bécher de 200 millilitres, versez tout le filtrat initial présent dans le premier bécher de 200 millilitres à travers la passoire, puis rincez le contenu du bécher à l’aide de PBS chaud contenant du Pen-Strep jusqu’à ce qu’il ne reste plus de fragments de tissu et versez-le dans la passoire cellulaire. Après avoir ajusté l’aiguille de calibre 18 à la seringue de 20 millilitres, remplissez la seringue avec du produit de lavage de follicule. Avec un hémostatique, tenez la passoire cellulaire de 40 micromètres à l’envers sur une boîte de Petri carrée et utilisez la seringue pour laver le contenu de la passoire cellulaire dans la boîte.Transférer la boîte de Petri carrée dans un stéréoscope avec une scène chaude réglée à 38,5 degrés Celsius avec un grossissement réglé entre 1,25 et 3,2x. Après avoir identifié les follicules de la boîte de Petri carrée, transférer le follicule pour laver les gouttes de milieu à l’aide de la micropipette. Le nombre total de follicules pré-antraux isolés par répétition en utilisant l’homogénéisation tissulaire de 6 minutes montre une moyenne de 41 follicules par réplication, allant de 11 à 135 follicules.L’évaluation du stade de développement de 476 follicules isolés a montré que la majorité d’entre eux étaient au stade primaire de développement, mesurant de 40 à 79 micromètres contenant une couche de cellules cuboïdes de granulosa. L’homogénéisation du cortex ovarien pendant 6 minutes a donné un plus grand nombre de follicules pré-antraux par rapport à 5 minutes d’homogénéisation à la même vitesse. L’expression du marqueur cellulaire de la granulosa FSH et du marqueur germinale DAZL dans les follicules a été évaluée à l’aide de la PCR quantitative de transcription inverse démontrant que les follicules primaires et secondaires précoces exprimaient le récepteur FSH et les transcrits DAZL.La localisation immunofluorescente du CX37 dans des follicules pré-antraux isolés aux stades primaire et secondaire précoce montre que le CX37 était localisé dans le plasme O, étant absent du noyau du site O et de la membrane des cellules de la granulosa. D’après notre expérience, la dissection appropriée d’une fine couche de tissu cortical, le hachage du tissu à la bonne taille et l’homogénéisation appropriée sont des étapes essentielles pour assurer la libération de follicules viables du tissu. Les follicules pré-antraux isolés peuvent être utilisés pour répondre à des questions telles que la régulation de la croissance du follicule pré-antral et la nature des interactions entre les cellules de la granulosa et l’ovocyte, facilitant ainsi le développement de conditions de culture plus efficaces.

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Biology

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Une nouvelle méthode pour l'encapsulation dans un follicule ovarien 3D fibrine alginate réseau interpénétré est décrite. Ce système combine un soutien structurel à la dégradation protéolytique de soutenir le développement des follicules immatures pour produire des ovocytes matures. Cette méthode peut être appliquée à des agrégats de cellules de culture pour maintenir des contacts cellule-cellule, sans limiter l'expansion.

Une méthode pour l&#39;encapsulation follicule ovarien et de la Culture dans un protéolytiquement dégradable 3 Système dimensionnelle

Cette vidéo décrit l’isolement d’ovocytes antraux à partir d’ovaires de souris fraîchement récoltés. Ces ovocytes antraux peuvent être utilisés pour d’autres études de caractérisation et de développement.

Isolement d’ovocytes antraux de souris : une méthode pour isoler des ovocytes antraux à partir d’ovaires de souris fraîchement récoltés

Cette vidéo décrit la technique d’isolement du complexe cumulus-ovocytes ou COC des ovaires porcins. Le COC intact isolé peut être utilisé pour effectuer la fécondation in vitro - la technique de procréation assistée pour développer des traitements de fertilité.

Isolement du complexe ovocytaire du cumulus porcin : une technique pour isoler le complexe ovocytaire du follicule ovarien porcin pour la fécondation in vitro

Présenté ici sont deux protocoles pour l’encapsulation des ovocytes porcins dans les conditions de culture 3D. Dans le premier, les complexes cumulus-oocytes (COC) sont encapsulés dans des perles de fibrine-alginate. Dans la seconde, ils sont enfermés avec des particules de poudre d’éthylène fluoré (microbioréacteurs). Les deux systèmes assurent des conditions optimales pour maintenir leur organisation 3D.

Hydrogels d’Alginate et microbioréacteurs hydrophobes protéolytically dégradés pour l’encapsulation des oocytes porcins

Nous décrivons les procédures d’isolement des ovocytes croissants des follicules ovariens aux premiers stades de développement, ainsi que la configuration d’un système de culture in vitro qui peut soutenir la croissance et la différenciation jusqu’au stade adulte.

Stratégie de culture in vitro pour les ovocytes du follicule antral précoce chez les bovins

Ici, nous présentons une méthode simple pour séparer les cellules folliculaires et les ovocytes dans les follicules ovariens de poisson zèbre, qui facilitera des investigations du développement ovarien dans le poisson zèbre.

Séparation des cellules folliculaires et des ovocytes dans les follicules ovariens du poisson zèbre

Ici, nous présentons des protocoles pour l’identification et la purification des cellules ovariennes des follicules antraux. Nous développons des méthodes de traitement des ovaires entiers pour la cryoconservation des bandes corticales tout en récoltant des follicules antraux intacts qui sont traités enzymatiquement pour libérer plusieurs types de cellules résidentes du follicule, y compris la granulosa, la thèque, les cellules endothéliales, hématopoïétiques et stromales.

Extraction, marquage et purification de cellules spécifiques à la lignée à partir de follicules antraux humains

Ici, nous décrivons un protocole décrivant comment isoler les follicules ovariens humains du tissu cortical gelé-décongelé pour effectuer des analyses d’expression génique.

Analyses de l’expression génique dans les follicules humains

Ici, nous décrivons un protocole pour séparer les cellules vitellines, les cellules de la granulosa et les cellules thèques dans les follicules préovulatoires aviaires. Cette manipulation de précision permet des études critiques sur le rôle de ces couches dans la fonction reproductive, aidant à la compréhension du développement folliculaire, de la régulation hormonale et de la recherche sur les maladies pour améliorer le rendement agricole et les connaissances biomédicales.

Séparation des couches de granulosa du follicule préovulatoire aviaire et de cellules thèques pour les applications en aval

Ce protocole décrit un nouveau modèle de culture tridimensionnel (3D) utilisant un hydrogel d’hyaluronane lié à la tyramine pour encapsuler et cultiver des follicules préantraux à partir de l’ovaire de souris. Nous détaillons également deux approches de la cryoconservation des follicules ovariens par vitrification.

Application d’un nouvel hydrogel d’hyaluronane pour la culture tridimensionnelle de follicules et méthodologie pour la cryoconservation de follicules ovariens de souris

Cet article présente un modèle de co-culture de cellules de thèque bovine et de cellules de granulosa. Cette méthode a le potentiel de servir de base fiable pour des analyses axées sur l’étude de la communication paracrine et du transport du substrat entre les cellules somatiques à l’intérieur du follicule.

Un système de co-culture modifié pour comprendre les interactions entre les cellules de la granulosa-thèque dans l’ovaire bovin

Découvrez une méthode mécanique efficace pour isoler les follicules préantraux de l'ovaire bovin. Cette technique améliore la viabilité des échantillons et ouvre de nouvelles perspectives pour la recherche en folliculogenèse et la préservation de la fertilité.

Isolement de petits follicules préantraux de l’ovaire bovin à l’aide d’une combinaison de fragmentation, d’homogénéisation et de filtration en série (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement de petits follicules préantraux de l’ovaire bovin à l’aide d’une combinaison de fragmentation, d’homogénéisation et de filtration en série

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