Name: Marquage de proximité basé sur AirID pour l’interaction protéine-protéine chez les plantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Découvrez le marquage de proximité basé sur AirID pour étudier les interactions protéine-protéine chez Cucumis sativus. Cette méthode améliore la précision et réduit la toxicité dans les analyses de biologie végétale.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 32000197 à X.H.), la subvention financière spéciale de la Fondation chinoise pour les sciences postdoctorales (subvention n° 2019T120467 à X.H.)

1. Préparation du matériel végétal
<ol><li>Cucumis sativus (Concombre) est utilisé pour l’analyse expérimentale. Mettez les graines dans l’eau, incubez-les à 50 °C pendant 20 min, puis placez-les sur du papier filtre sur une plaque de Pétri pendant 12 à 16 h.</li>
	<li>Ensuite, transférez les graines dans des pots contenant de la terre (achetés dans le commerce) et cultivez-les dans une chambre climatique à une température de 23 °C et à une photopériode de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité.</li>
	<li>Maintenez les plantes dans la chambre climatique pendant 3-4 semaines jusqu’à ce que les plantes atteignent 3 ou 4 stades foliaires pour une agro-infiltration réussie.</li>
</ol>2. Construire AirID
<ol><li>Utiliser APRR2 comme protéine cible et construire APRR2-AirID sous le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (p35S : APRR2-AirID). Introduisez-le dans le vecteur binaire compatible avec Gateway pEarleyGate1006 (fourni par le Dr Kathrin Schrick, Université d’État du Kansas), et synthétisez l’enzyme PL directement selon la séquence fournie dans le fichier supplémentaire 1.</li>
</ol>3. Préparation des cellules compétentes
<ol><li>Préparation de cellules compétentes pour la DH5α<ol><li>Inoculer les 2 mL de LB (10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure et 10 g/L de NaCl ; pH = 7,0.) avec des cellules E.Coli DH5α (directement à partir du bouillon congelé sans décongélation) et cultiver pendant la nuit (O/N) à 37 °C.</li>
		<li>Inoculez fraîchement 0,1 % à 0,5 % d’inoculum de la culture O/N dans 100 mL de milieu LB et faites croître les cellules jusqu’à ce que OD600 atteigne entre 0,4 et 0,6, puis incubez la culture à 4 °C pendant 30 min.</li>
		<li>Placer la culture dans deux tubes à centrifuger de 50 ml et essorer à 2500 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
		<li>Jeter le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 10 mL de CaCl2 glacé à 0,1 M et laisser reposer sur de la glace pendant 15 minutes. Arroser les cellules avec un essorage de 2500 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
		<li>Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de 0,1 M CaCl2 + 20 % de glycérol, aliquote 100 μL dans chaque tube de 1,5 mL, et les conserver immédiatement à -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation des cellules compétentes GV3101<ol><li>Inoculer 2 mL de LB (contenant 50 μg/mL de gentamycine et 25 μg/mL de rifampicine) avec une seule colonie de GV3101. Incuber la culture O/N à 28 °C en agitant à 250 tr/min.</li>
		<li>Inoculez 200 mL de LB avec 1 mL d’une culture saturée pendant la nuit. Agiter la culture à 250 tr/min tout en l’incubant à 28 °C jusqu’à ce que le diamètre extérieur600 soit égal à 0,5.</li>
		<li>Transférez la culture dans quatre tubes à centrifuger stériles de 50 ml pré-réfrigérés et mettez-la sur de la glace pendant 30 minutes.</li>
		<li>Pelleter les alvéoles à 2500 x g pendant 10 min à 4 °C. Jetez le surnageant et placez les granulés sur de la glace.</li>
		<li>Remettre les cellules en suspension dans 10 mL de solution glacée de CaCl2 à 0,1 M. Regroupez les cellules dans un tube Oakridge de 50 ml pré-réfrigéré.</li>
		<li>Pelleter les cellules à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 10 mL de solution glacée de CaCl2 . Laisser reposer sur de la glace pendant 30 min.</li>
		<li>Pelleter les cellules à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de solution glacée de CaCl2 à 0,1 M.</li>
		<li>Distribuer les cellules dans une aliquote de 50 μL dans des tubes stériles en polypropylène pré-réfrigérés. Conservez les cellules à -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Agro-infiltration
<ol><li>Tout d’abord, transférez le plasmide à l’agrobactérie<ol><li>Transférer 2,5 μL du plasmide généré à l’étape 2.1 aux cellules compétentes de la souche GV3101 d’agrobacterium tumefaciens et incuber sur glace pendant 30 min.</li>
		<li>Transférer le tube contenant le plasmide et les cellules compétentes dans de l’azote liquide pendant 3 min.</li>
		<li>Choc thermique à 37 °C pendant 5 min dans un incubateur, puis mettre le tube sur de la glace pendant 2 min.</li>
		<li>Ajouter 1 000 μL de milieu LB (10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure et 10 g/L de NaCl ; pH = 7,0) à l’agrobactérie et incuber à 30 °C et 118 tr/min pendant 1 h.</li>
		<li>Centrifuger à 3 000 x g pendant 2 min à 4 °C.</li>
		<li>Jeter les 800 μL supérieurs de la solution et mélanger le reste de la solution. Ensuite, posez-le sur LB (comme mentionné à l’étape 4.1.4 ajouté avec de la gélose et 50 μg/mL de kanamycine pour le plasmide et 50 μg/mL de gentamycine et 25 μg/mL de rifampicine pour les cellules compétentes GV3010). Incuber les plaques à 30 °C pendant 48 h. REMARQUE : Il est préférable de prélever des colonies et d’effectuer une PCR pour confirmer le gène d’intérêt7.</li>
	</ol></li>
	<li>Prélevez quelques colonies bactériennes sur les plaques et mettez-les dans un milieu LB avec des antibiotiques appropriés (voir l’étape 4.1.6). Incuber à 30 °C et 218 tr/min pendant 36-48 h.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 3 000 x g pendant 2 minat 4 °C. Remettre les cellules en suspension à OD600 = 1,0 dans un tampon d’agro-infiltration (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5,6, 250 μM acétosyringone).</li>
	<li>Infiltrer l’inoculum (généré à partir de l’étape 4.3) dans l’épiderme (abaxial) à l’aide d’une seringue sans aiguille de 1 mL. REMARQUE : Il est préférable d’infiltrer toute la feuille et de choisir de répliquer. Pour 4-5 plantes, utilisez une construction. Pour chaque feuille, 1,5 mL d’agrobactéries remises en suspension suffisent.</li>
	<li>Maintenir les plantes pendant 36 h dans l’enceinte climatique avec une lumière de 16 h (environ 75 μmol·m-2·s-1) et une photopériode sombre de 8 h à 23 °C.</li>
	<li>Après 36 h d’infiltration de la construction, infiltrer 1 mL de biotine à 5 μM (dans une solution de MgCl2 à 10 mM) dans les feuilles déjà filtrées de la construction.</li>
	<li>Maintenez les plantes traitées pendant 4 à 12 heures supplémentaires avant de récolter le tissu foliaire. REMARQUE : Selon l’étude précédente, la protéine cible culmine à 36 h, choisissez donc des infiltrations de biotine 36 hpi 4,6. La durée d’incubation de la biotine dépend de l’étude cible, mais selon l’expérience actuelle, une période d’incubation de 8 h est plus appropriée pour le marquage des protéines.</li>
</ol>5. Prélèvement d’échantillons
REMARQUE : Tous les matériaux pour le prélèvement d’échantillons doivent être stériles pour éviter la contamination par la kératine, et toutes les étapes du protocole doivent être effectuées dans un environnement exempt de contamination.
<ol><li>Coupez les feuilles infiltrées et transférez-les rapidement à l’azote liquide pour éviter la dégradation des protéines.</li>
	<li>Effectuer la pré-détection des protéines par immunoblotd’analyses 6 ; ceci est fortement recommandé avant la co-immunoprécipitation (Co-IP).</li>
</ol>6. Extraction des protéines totales de la feuille
<ol><li>Broyez les feuilles à l’aide d’un pilon et d’un mortier, ajoutez rapidement 2 mL de 1x PBS-BSA PH 7,4 et broyez lentement.</li>
	<li>Prenez un tube conique de 15 ml, placez un filtre à matériau de filtration rapide sur le tube conique, transférez le mélange d’échantillons dans le tube à travers le filtre à matériau de filtration rapide et gardez-le sur de la glace.</li>
	<li>Transférez les échantillons dans un tube de 2 ml et ajoutez un cocktail d’inhibiteurs de protéines à 1 %.</li>
	<li>Mélangez le contenu en tournant 7 à 8 fois vers le haut et vers le bas et centrifugez à 1 000 x g pendant 2 min à 4 °C.</li>
	<li>Transférez le solvant supérieur des échantillons dans de nouveaux tubes de 2 ml, ajoutez 10 % de β-D-maltoside (β-D.M) et placez-le sur de la glace pendant 5 minutes. Centrifuger à 20 000 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
</ol>7. Équilibrer la colonne de dessalage
<ol><li>Centrifuger la colonne à 1 000 x g pendant 1 min à 4 °C. REMARQUE : Marquez un côté de la colonne et assurez-vous que le côté marqué est orienté vers l’extérieur pendant tous les processus de centrifugation.</li>
	<li>Retirez les couvercles supérieur et inférieur de la colonne et centrifugez à 1 000 x g pendant 2 min à 4 °C.</li>
	<li>Jetez la solution liquide du tube de collecte de la colonne et ajoutez 5 mL de tampon PBS 1x pour le lavage.</li>
	<li>Centrifuger la colonne à 1 000 x g pendant 2 min à 4 °C.</li>
	<li>Répétez les étapes 7.3 et 7.4 au moins cinq fois.</li>
</ol>8. Lavage des perles magnétiques
<ol><li>Prenez un tube de 1,5 mL et ajoutez 50 μL de billes magnétiques conjuguées streptavidine-C1.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de 1x PBS-BSA pour le lavage, bien mélanger et placer sur le support magnétique pendant 3 min. Jeter le surnageant.</li>
	<li>Répétez l’étape 8.2 au moins trois fois.</li>
	<li>Après chaque lavage, placez le tube sur la grille magnétique pour adsorber les billes vers un côté du tube afin d’éliminer le tampon de lavage.</li>
</ol>9. Enrichissement des protéines biotinylées
<ol><li>Ajouter 2 mL d’échantillons dans la colonne et centrifuger à 1 000 x g pendant 8 min à 4 °C.</li>
	<li>Ajouter 1 mL d’extrait protéique dessalé à 50 μL de billes magnétiques conjuguées streptavidine-C1 pour les équilibrer.</li>
	<li>Placez le tube sur le rotateur à vitesse normale pour que la solution se mélange bien et incube à température ambiante (RT) pendant 30 minutes.</li>
	<li>Placez les billes sur la grille magnétique pendant 3 min à RT, ou jusqu’à ce qu’elles se rassemblent d’un côté du tube, pour retirer délicatement le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de lavage I (2 % SDS dans l’eau), faire tourner à RT pendant 2 min sur un rotateur et répéter l’étape 9.4.</li>
	<li>Placez le tube sur le rotateur à RT pendant 2 min après avoir ajouté 1 mL de tampon de lavage II (50 mM HEPES : pH = 7,5, 500 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA, 0,1 % d’acide désoxycholique [p/v] et 1 % de Triton X-100). Répétez l’étape 9.4.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de lavage III (10 mM Tris-HCl : pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1 % d’acide désoxycholique [p/v], 1 % NP40 [v/v]) et faire tourner à l’aide d’un agitateur pendant 2 min à RT. Ensuite, répétez l’étape 9.4.</li>
	<li>Pour éliminer le détergent, ajoutez 1,7 mL de Tris-HCl 50 mM (pH = 7,5) et répétez l’étape 9.4. Répétez cette étape une fois de plus.</li>
	<li>Lavez les billes six fois pendant 2 minutes chacune dans 1 mL de tampon bicarbonate d’ammonium à 50 mM à RT et répétez l’étape 9.4.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de l’extrait protéique contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 12 % (p/v) de saccharose (Suc), 2 % (p/v) de laurylsulfate de lithium et 1,5 % (p/v) de dithiothréitol aux billes, effectuer un choc thermique dans l’incubateur à 100 °C pendant 5 min et suivre l’étape 9.4. Stocker le surnageant à -80 °C pour l’analyse LC-MS/MS.</li>
</ol>

<ol><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+novel+protein-protein+interactions+in+liver+that+affect+glucagon+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity.</a> PloS One. 10 (6), 0129226(2015).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+identification+of+host+proteins+interacting+with+Theileria+annulata+cysteine+proteinase+%28TaCP%29+by+yeast-two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system.</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 536(2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+agrobacterium-mediated+method+for+transient+gene+expression+and+functional+studies+in+multiple+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Communications%22%5BJournal%5D)">A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species.</a> Plant Communications. 1 (5), 100028(2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TurboID-based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e60728(2020).</li>
<li>Kido, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AirID%2C+a+novel+proximity+biotinylation+enzyme%2C+for+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions.</a> eLife. 9, 54983(2020).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressing+7-hydroxymethyl+chlorophyll+a+reductase+alleviates+non-programmed+cell+death+during+dark-induced+senescence+in+intact+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants.</a> Biomolecules. 11 (8), 1143(2021).</li>
<li>Ammiraju, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oryza+bacterial+artificial+chromosome+library+resource%3A+construction+and+analysis+of+12+deep-coverage+large-insert+BAC+libraries+that+represent+the+10+genome+types+of+the+genus+Oryza%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza.</a> Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albino+Leaf+2+is+involved+in+the+splicing+of+chloroplast+group+I+and+II+introns+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
<li>Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+evolutionary+track+of+a+highly+specific+l-Arginine+oxidase+by+reconstruction+and+biochemical+analysis+of+ancestral+and+native+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459(2019).</li>
<li>Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+know+the+neighborhood%3A+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li>
<li>Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMO-specific+isopeptidase+SENP2+is+targeted+to+intracellular+membranes+via+a+predicted+N-terminal+amphipathic+%CE%B1-helix%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).</li>
<li>Motani, K., Kosako, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+stimulator+of+interferon+genes+%28STING%29+induces+ADAM17-mediated+shedding+of+the+immune+semaphorin+SEMA4D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont déclaré aucun conflit d’intérêts.

Dans l’expérience actuelle, AirID a été utilisé pour le marquage de proximité, que Kido et al. ont développé grâce à un algorithme de reconstruction enzymatique ancestrale utilisant un grand ensemble de données génomiques et cinq enzymes BirA conventionnelles5. Les mutations aléatoires ont été utilisées dans l’ingénierie évolutive traditionnelle des protéines pour améliorer l’activité 9,10 car les mutations aléatoires ne peuvent pas produi...

Diverses protéines cellulaires fonctionnent dans le cadre du système de régulation biologique, et les interactions protéine-protéine (IPP) font partie de ce système et sont à la base de nombreux processus cellulaires. Outre les IPP, la fonction des protéines naturelles est favorisée post-traductionnellement par diverses modifications telles que la formation de complexes, l’ubiquitination et la phosphorylation. Par conséquent, l’étude des IPP est importante pour comprendre la fonction possible des protéines cibles. Les IPP ont été réalisés à l’aide de diverses technologies telles que l’analyse par spectrométrie de masse après immunoprécipitation (analyse IP-MS)1, le système à deux hybrides de levure (Y2H)2, ainsi que les puces acellulaires3. Ces méthodes ont permis d’explorer diverses découvertes vitales dans le domaine de la recherche. Cependant, ces méthodes présentent certains inconvénients ; par exemple, l’an 202 est une stratégie longue et coûteuse qui nécessite la création de la bibliothèque Y2H de l’espèce cible.
De plus, la technique Y2H utilise de la levure, un organisme eucaryote unicellulaire hétérologue, qui ne pourrait pas refléter avec précision l’état cellulaire des cellules eucaryotes supérieures. L’IP-MS n’est pas adaptée aux protéines à forte hydrophobicité et montre une faible efficacité dans la capture des IPP faibles. Diverses protéines essentielles dans les plantes, telles que le domaine de liaison aux nucléotides et les protéines contenant des répétitions riches en leucine (NLR) et les kinases de type récepteur (RLK), sont exprimées à un faible niveau et interagissent principalement avec d’autres protéines de manière transitoire ; L’utilisation de ces méthodes est donc insuffisante pour comprendre les mécanismes sous-jacents à la régulation de ces protéines3.
Une nouvelle technique appelée biotinylation de proximité (PB) aide les chercheurs à identifier les IPP. La PB dépend des enzymes PL, qui se fixent à la protéine d’intérêt (POI), et lorsque la protéine partenaire s’approche du POI, la PL attache une étiquette chimique de biotine à la protéine partenaire. De plus, la protéine marquée peut être identifiée et peut rapidement savoir quelle protéine partenaire se fixe à la protéine cible5. Des études antérieures ont prouvé que BioID et TurboID sont des outils efficaces pour les IPP, en particulier chez les plantes, mais qu’ils présentent certaines limites4. BioID a besoin d’un niveau élevé de biotine pour marquer les protéines partenaires, ce qui prend plus de 16 h. Par rapport au BioID, le TurboID est plus avantageux car il marque les protéines en 10 minutes et peut marquer la protéine partenaire à température ambiante (RT). Il est également toxique pour les cellules dans certaines conditions et marque les protéines qui ne montrent pas d’interaction avec la protéine d’intérêt.
Pour surmonter ces problèmes, AirID, développé par Kido et al., est plus efficace que le reste des enzymes de marquage, bien que la similitude de séquence soit de 82% entre BioID et AirID5. Pour vérifier l’efficacité d’AirID, nous avons mené une expérience en utilisant un POI avec des associés connus. Cette expérience a confirmé qu’AirID pouvait sans aucun doute marquer les protéines associées dans les cellules végétales. AirID est une enzyme précieuse pour l’analyse des IPP in vitro et dans les cellules. Il crée moins de toxicité et est moins erroné dans les processus qui prennent du temps que TurboID pour marquer les non-partenaires, conduisant à la mort de la cellule. Il démontre qu’AirID est plus compétitif que d’autres enzymes de marquage pour la biotinylation de proximité. Il est plus précis, a plus de potentiel dans les processus qui prennent du temps et moins toxique in vitro et dans les cellules vivantes. Le protocole actuel décrit l’identification des protéines en interaction d’APRR2 à l’aide d’AirID en tant qu’enzyme PL ; De plus, la méthode peut être appliquée à d’autres protéines pour étudier les IPP chez les espèces végétales.

<table><tbody><tr><td>Acétosyringone</td><td>Beijing solaribo science et technologie Co.Ltd</td><td>S1519</td><td></td></tr><tr><td>Acryl/Bis 30 % solution</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>1510KA4528</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioFroxx GmbH</td><td>D64683</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>tsingke (Shanghai) Co.Ltd</td><td>TSJ001</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td></td><td></td>G313BA0018</tr><tr><td>Biotine</td><td>BBI sciences de la vie</td><td>G908BA0012</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>BBI sciences de la vie</td><td>E209BA0008</td><td></td></tr><tr><td>Cellules compétentes GV3101</td><td>Réalisé dans l’expérience</td><td></td><td></td>actuelle</tr><tr><td>Colonne de dessalage</td><td>Thermo scientific</td><td>WC321753</td><td></td></tr><tr><td>Acide désoxycholique</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td></td><td></td>G818BA0029</tr><tr><td>cellules compétentes DH5&alpha ;</td><td>Réalisé dans l’expérience</td><td></td> actuelle <td>E.coli DH5&alpha ;</td></tr><tr><td>&beta ;-D-maltoside</td><td>Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd</td><td>S818</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>E104BA0029</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>161BA0031</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Beijing solaribo science and technology Co.Ltd</td><td>H8090</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>H209BA0003</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Beijing solaribo science et technologie Co.Ltd</td><td>M8019</td><td></td></tr><tr><td>MiraCloth</td><td>EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay</td><td>3429963</td><td>Filtre à matériau de filtration rapide</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Beijing solaribo science and technology Co.Ltd</td><td>20200819</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>H324BA0003</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>N8030</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de protéines</td><td>Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd</td><td>S3450</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr> 5820172 <tr><td>SDS</td><td>Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd</td><td>S1015</td><td></td></tr><tr><td>Silwet</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Perles magnétiques conjuguées à la streptavidine-C1</td><td>Enriching Biotechnology</td><td>7E511E1</td><td>Perles magnétiques</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Servicebio</td><td>G2056</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd GB03BA007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>F828BA0020</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Thermo scientific</td><td>LP0042</td><td></td></tr></tbody></table>

marquage de proximité basé sur airid pour l’interaction protéine-protéine chez les plantes

AirID-Based Proximity Labeling for Protein-Protein Interaction in Plants

Dans les cellules et les plantes de mammifères, les approches de marquage de proximité (PL) utilisant l’ascorbate peroxydase modifiée (APEX) ou la biotine ligase BirA d’Escherichia coli (connue sous le nom de BioID) se sont avérées efficaces pour identifier les interactions protéine-protéine (IPP). APEX, BioID et TurboID, une version révisée de BioID, ont certaines restrictions en plus d’être des technologies précieuses. L’AirID, une nouvelle version de BioID récemment développée pour l’identification de proximité dans les interactions protéine-protéine, a permis de surmonter ces restrictions. Auparavant, AirID a été utilisé dans des modèles animaux, tandis que l’étude actuelle démontre l’utilisation d’AirID dans les plantes, et les résultats ont confirmé qu’AirID fonctionne mieux dans les systèmes végétaux par rapport à d’autres enzymes PL telles que BioID et TurboID pour le marquage des protéines qui sont proches des protéines cibles. Voici un protocole étape par étape pour identifier les partenaires d’interaction protéique en utilisant la protéine AT4G18020 (APRR2) comme modèle. Les méthodes décrivent la construction du vecteur, la transformation de la construction par agroinfiltration, la transformation de la biotine, l’extraction des protéines et l’enrichissement des protéines marquées à la biotine par une technique de purification par affinité. Les résultats concluent qu’AirID est une enzyme nouvelle et idéale pour analyser les IPP chez les plantes. La méthode peut être appliquée à l’étude d’autres protéines dans les plantes.

Selon des recherches antérieures, le gène du concombre APRR2 est le gène candidat qui contrôle la couleur blanche des fruits immatures8. Ici, un protocole a été développé en utilisant AirID comme enzyme de marquage de proximité pour trouver la protéine partenaire d’interaction d’APRR2 dans le concombre. La construction a été transférée sur les feuilles de concombre, et après 36 h après l’infiltration, la biotine a été transférée. Après 48 h, les échantillons ont été prélevés pour...

Nous présentons ici un protocole étape par étape pour réaliser l’expérience de marquage de proximité (PL) chez le concombre (Cucumis sativus L.) en utilisant la protéine AT4G18020 (APRR2)-AirID comme modèle. La méthode décrit la construction d’un vecteur, la transformation d’une construction par agroinfiltration, l’infiltration de biotine, l’extraction de protéines et la purification de protéines marquées à la biotine par une technique de purification par affinité.

Marquage de proximité basé sur AirID pour l’interaction protéine-protéine chez les plantes

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA ...

AirID est une enzyme précieuse pour l’interaction protéine-protéine, et il crée moins de toxicité et moins d’erreurs dans les processus chronométrés que d’autres enzymes de marquage de proximité. Un protocole étape par étape est présenté pour réaliser l’expérience de marquage de proximité chez le concombre ou Cucumis sativus en utilisant AT4G18020 protéine APRR2-AirID comme modèle. Ahmad Zada, Imran Khan, Yuting Cheng et Min Zhang de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure.Commencez par transférer les graines de Cucumis sativus ou de concombre dans l’eau, incubez-les à 50 degrés Celsius pendant 20 minutes, puis placez les graines sur le papier filtre sur une plaque de Pétri pendant 12 à 16 heures. Plus tard, transférez les graines dans des pots contenant de la terre et cultivez-les dans une chambre climatique à 23 degrés Celsius en 16 heures de lumière et 18 heures d’obscurité pendant trois à quatre semaines. Transférer 2,5 microlitres du plasmide EarleyGate 100 aux cellules compétentes de la souche GV3101 d’agrobacterium tumefaciens.Incubez le tube sur de la glace pendant 30 minutes avant de le transférer à l’azote liquide pendant trois minutes. Pour donner le choc thermique, transférez le tube dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Placez ensuite le tube sur de la glace pendant deux minutes.Ajouter 1 000 microlitres de Luria Bertani ou de milieu LB aux cellules d’agrobactéries choquées par la chaleur. Après avoir incubé les cellules à 30 degrés Celsius et 118 tr/min pendant une heure, centrifugez-les à 3000 G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Jetez ensuite le surnageant de 800 microlitres et mélangez le reste de la solution.Posez-le sur le milieu LB complété par 50 microgrammes par millilitre de kanamycine et de gentamycine chacun et 25 microgrammes par millilitre de rifampicine. Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant 48 heures. Ramassez quelques colonies bactériennes dans les assiettes.Mettez-les dans un milieu liquide LB, complété par des antibiotiques appropriés et incubez le LB liquide à 30 degrés Celsius et 218 tr/min pendant 36 à 48 heures. Après deux minutes de centrifugation à 3 000 G à quatre degrés Celsius, remettre la pastille en suspension dans un tampon d’agro-infiltration pour ajuster la densité optique à une à la longueur d’onde de 600 nanomètres. À l’aide d’une seringue sans aiguille d’un millilitre, infiltrer tout l’épiderme de la surface abaxiale avec 1,5 millilitre d’inoculum agrobactérien remis en suspension.Maintenez les plantes dans la chambre climatique à 23 degrés Celsius avec 75 micromoles par mètre carré par seconde de lumière pendant 16 heures dans des conditions d’obscurité pendant huit heures Après 36 heures, infiltrez un millilitre de cinq microgrammes de biotine dans les feuilles déjà filtrées. Après quatre à 12 heures d’infiltration de biotine, coupez les feuilles et transférez-les rapidement à l’azote liquide pour éviter la dégradation des protéines. Broyez les feuilles à l’aide d’un pilon et d’un mortier et ajoutez rapidement deux millilitres de PBS BSA de pH 7,4, suivi d’un broyage lent.Transférez le mélange d’échantillons dans un tube conique de 15 millilitres à travers un filtre à matériau de filtration rapide placé sur le dessus et gardez le tube sur de la glace. Transférez les échantillons dans un tube de deux millilitres. Ajoutez un cocktail d’inhibiteurs de protéines à 1 % et mélangez le contenu en tournant le tube de haut en bas sept à huit fois avant de le centrifuger.Une fois cela fait, transférez le surnageant dans un nouveau tube de deux millilitres et ajoutez 10% de bêta-D-maltoside. Placez le tube sur de la glace pendant cinq minutes avant de centrifuger à 20 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pour équilibrer la colonne de dessalage, marquez un côté de la colonne et centrifugez-la avec le côté marqué vers l’extérieur.Retirez les couvercles supérieur et inférieur de la colonne et centrifugez à nouveau à 1 000 G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Jetez la solution liquide du tube de collecte de la colonne et lavez le tube avec cinq millilitres de tampon PBS avec centrifugation comme démontré précédemment, au moins cinq fois. Ajoutez un millilitre de PBS BSA à 50 microlitres de billes magnétiques conjuguées streptavidine-C1 dans un tube de 1,5 millilitre et mélangez bien.Placez le tube sur un support magnétique pendant trois minutes pour absorber les billes vers un côté du tube. Jetez le surnageant de l’autre côté et répétez ce lavage PBS BSA trois fois. Pour enrichir la protéine biotinylée, ajoutez deux millilitres d’échantillons dans la colonne.Après centrifugation de la colonne à 1000 G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius, ajoutez un millilitre d’extrait de protéine dessalée à 50 microlitres de billes magnétiques conjuguées à la streptavidine-C1. Mélangez bien la solution en plaçant le tube contenant les billes magnétiques sur le rotateur à vitesse normale et à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, placez les billes sur la grille magnétique pendant trois minutes à température ambiante ou jusqu’à ce qu’elles se rassemblent d’un côté du tube.Retirez délicatement le surnageant et ajoutez un millilitre de tampon de lavage. Faites tourner le tube pendant deux minutes sur un rotateur et répétez l’étape effectuée sur la grille magnétique pour retirer le surnageant. De même, effectuez les lavages avec un millilitre de tampons de lavage deux et trois comme démontré précédemment.Ensuite, retirez le détergent dans les tampons de lavage en ajoutant 1,7 millilitre de chlorhydrate de tris à 50 millimolaires et en répétant l’étape effectuée sur la grille magnétique. Donnez six lavages de deux minutes chacun en utilisant un millilitre de tampon de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires. Une fois cela fait, ajoutez 50 microlitres d’extrait protéique contenant 50 millimolaires de chlorhydrate de tris, 12 % de saccharose, 2 % de laurylsulfate de lithium et 1,5 % de dithiothréitol aux billes, et placez le tube dans l’incubateur à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes pour donner un choc thermique.Après avoir répété l’étape sur une grille magnétique, stockez le surnageant à moins 80 degrés Celsius pour l’analyse LCMS/MS. L’analyse par transfert Western des protéines extraites a montré une expression protéique et une biotinylation réussies dans les feuilles de concombre infiltrées. Le niveau d’expression plus élevé des protéines marquées et des bandes supplémentaires par rapport au témoin a confirmé le marquage réussi des protéines cibles du gène d’intérêt par AirID.Les résultats ont été confirmés à l’aide d’anticorps anti-drapeau et anti-masse montrant la bande cible avec un anticorps anti-drapeau dans tous les échantillons transformés. Après avoir enrichi des protéines biotinylées avec des billes magnétiques conjuguées à la streptavidine-C1, plusieurs protéines de tailles différentes ont été observées. De tous les résultats, il a été conclu qu’AirID est une enzyme nouvelle et idéale pour analyser les interactions protéine-protéine chez les plantes.Lors de l’expérience de marquage de proximité, il est important de se rappeler que la biotine à cinq micromolaires et la durée HR sont idéales. Le protocole décrit la configuration étape par étape du marquage de proximité basé sur AirID dans la plante, y compris la préparation de l’échantillon de feuilles, l’élimination de la pré-biotine, la quantification des protéines d’extrait et l’enrichissement des protéines biotinylées. AirID devrait améliorer la précision de la biotinylation indépendante de l’IPP en combinaison.Il est conclu qu’AirID est idéal pour l’analyse des IPP dans les plantes.

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Biologie

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