Stérilisation par rayonnement gamma à faible dose pour les greffes trachéales décellularisées

Ce protocole prévoit un processus complet de stérilisation pour tout organe non stérile sans affecter ses caractéristiques. L’objectif principal de cette technique comprend la possibilité de stériliser un organe sans affecter ses propriétés. Bien que cette technique se soit concentrée sur les trachées, elle a démontré que des doses plus faibles de rayonnement gamma peuvent stériliser efficacement les matériaux biologiques.

Un individu peut faire face au problème en définissant la dose efficace la plus faible pour les différents types d’organes. Ensuite, il est recommandé de commencer avec une dose plus faible et de les augmenter jusqu’à ce que la stérilisation soit réalisée. Commencez par diviser la trachée disséquée de lapins blancs néo-zélandais euthanasiés, ou Oryctolagus cuniculus, en morceaux de deux centimètres.

Avec des ciseaux, retirez le tissu conjonctif environnant et la couche muqueuse interne. Immergez les échantillons dans 12 millilitres de solution de PBS contenant des SDS, 5% de pénicilline streptomycine et 5% d’amphotéricine. Soumettre les trachées à une agitation constante à l’aide d’un agitateur magnétique à 400 tr/min pendant cinq semaines à température ambiante.

Chaque semaine, donnez deux heures de choc osmotique en immergeant les trachées dans de l’eau distillée avant de changer le milieu. Après cinq semaines, cryogéniser les échantillons de trachée en utilisant un mélange de 12 millilitres de 80% FBS et 20% de DMSO dans un récipient de congélation à moins 80 degrés Celsius. Après 13 à 15 jours, décongelez les trachées au bain-marie à 37 degrés Celsius.

Ensuite, lavez-les avec du PBS. Pour irradier l’échantillon, placer quatre morceaux trachéaux dans 20 millilitres de PBS dans des flacons de culture de méthacrylate T25, tout en empêchant la formation de bulles. Effectuer l’irradiation à l’aide d’un accélérateur linéaire avec des photons d’une énergie nominale de 10 mégavolts aplatissant les faisceaux sans filtre.

Appliquez un débit de dose de 2 400 unités de surveillance par minute et définissez d’autres paramètres comme décrit dans le manuscrit. Une fois cela fait, cultivez l’échantillon dans 30 millilitres de DMEM complété avec 10% de FBS inactivé sans antibiotiques ni antifongiques. Incuber la culture dans un incubateur de tissus standard à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant deux semaines et inspectez-la toutes les 24 heures pour détecter les paramètres de contamination tels que les changements de pH moyen, de couleur et de turbidité.

Effectuer des essais de traction sur une machine d’essai universelle de bureau de traction, ou un contrôle de déplacement UTM, équipée de capteurs de force et de position et d’un ordinateur avec un logiciel spécialement conçu. Enregistrez des données toutes les 0,4 seconde et exportez-les vers une feuille de calcul. Construire des mâchoires de traction adaptées au calibre moyen des trachées de lapin à partir de chlorure de polyvinyle cristallin monocouche pur non toxique ou de tubes creux en PVC.

Divisez les conduites en segments de trois centimètres de long. Pour effectuer la suture termino-terminale sans biais, percez 12 trous préformés à deux millimètres du bord des mâchoires, séparés par 2,5 millimètres. Ensuite, fixez les tubes de verre en PVC à la trachée de lapin par anastomose termino-terminale avec une suture monofilament continue en nylon 6-0 à travers des trous de cinq millimètres exécutés en alternance présents à deux millimètres du bord de la trachée.

Étirez toutes les pièces à un taux de déplacement de 5,0 millimètres par minute. Ensuite, notez les variables, telles que le stress et la déformation maximum, l’énergie stockée par unité de volume de trachée et le module de Young. Effectuez des tests de compression radiale sur un UTM de bureau de compression équipé d’un capteur de pesage de 15 newtons pour obtenir des données de force, de position et de temps.

Enregistrez les données et exportez-les vers des feuilles de calcul à intervalles de 0,5 seconde. Placez les trachées avec la zone membraneuse reposant sur la plaque inférieure avant la montée progressive de la plaque vers la plaque supérieure à une vitesse constante de cinq millimètres par minute. Calculez chaque variable par unité de longueur de l’échantillon, de rigidité et d’énergie par unité de surface nécessaire pour obstruer complètement la trachée.

Placez un stent en PVC intraluminal stérile de taille 14, en assurant une marge de trois à quatre millimètres à chaque extrémité. Fixez l’endoprothèse avec un seul point de monofilament en nylon 6-0 à travers l’espace intercartilagineux du premier cartilage. Dans des conditions aseptiques et avec du matériel stérile, pratiquer une incision thoracique centrale longitudinale de trois centimètres et prélever des lambeaux pédiculaires bilatéraux composés d’un fascia pectoral et d’un composant musculaire.

Enveloppez les trachées avec le lambeau chez quatre lapins, une trachée sur chaque hémathorax. Une fois la chirurgie terminée, inversez l’anesthésie en interrompant l’administration d’isoflurane. Sur les huit pièces exposées à 0,5 kilogray de rayonnement, deux présentaient un changement de couleur des médias en une semaine.

Cependant, aucune des pièces irradiées à un ou deux kilogris n’a montré de changement de couleur du média. Par rapport au témoin, aucun changement de schéma de distribution du collagène ou des fibres élastiques n’a été détecté dans les échantillons analysés irradiés à différentes doses de rayonnement. Les données obtenues lors de l’essai de traction sur trachées irradiées sont présentées ici.

Les courbes de contrainte pour les trachées décellularisées et irradiées n’ont révélé aucun changement par rapport aux trachées non stérilisées. Les tests de compression effectués sur les trachées natives ou témoins et les trachées décellularisées, cryoconservées et irradiées sont présentés. Les graphiques correspondants ont montré que l’irradiation ne modifiait pas le pourcentage d’occlusion par rapport à la trachée native.

L’irradiation gamma a entraîné une diminution cliniquement minime mais statistiquement significative des caractéristiques radiobiomécaniques et de la force variable par unité de longueur. L’examen histologique a montré le tissu conjonctif hautement organisé sous la forme du périchondre de la trachée indigène. Le cartilage était intact et ne présentait aucun signe de nécrose.

Lors de l’implantation d’un élément radiologique chez un être vivant, la stérilité de l’implant et le processus stérile sont primordiaux pour éviter l’infection et le rejet tissulaire. Il y a un large éventail d’organes à implanter après la génération des tissus, et ils devraient être stériles. Suivre ce processus peut obtenir une stérilisation complète sans affecter les principales caractéristiques de l’organe.