Name: Ablation laser multiphotonique de centres organisateurs de microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Découvrez l'ablation laser multiphotonique des centres organisateurs de microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris. Cette technique précise permet d'étudier la méiose ovocytaire avec une phototoxicité minimale.

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Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du laboratoire Balboula pour leur aide précieuse et leurs discussions. Les auteurs remercient Melina Schuh d’avoir aimablement partagé la construction mCherry-Cep192. Cette étude a été soutenue par R35GM142537 (NIGMS, NIH) à AZB.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Université du Missouri (Animal Care Quality Assurance Réf. numéro 9695). Des souris femelles rapporteures Cep192-eGFP âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées dans la présente étude. Pour générer des souris rapporteures Cep192-eGFP , la réparation dirigée par homologie médiée par CRISPR / Cas9 a été utilisée pour intégrer le gène rapporteur EGFP dans le génome de la souris CF-1. Le rapporteur EGFP a été fusionné à l’extrémité C du Cep192 (une partie intégrante des MTOC)15. Pour maintenir la colonie de souris, des souris rapporteures homozygotes Cep192-eGfp ont été utilisées. Tous les animaux ont été maintenus dans des cages (jusqu’à quatre animaux/cage) à 21 °C et 55% d’humidité, avec un cycle lumière/obscurité de 12 h et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau.
1. Collecte d’ovocytes de souris
<ol><li>Préparer le milieu de culture (Chatot, Ziomek et Bavister, CZB19, voir le tableau des matériaux) et l’incuber à 37 °C et 5% de CO2 pendant la nuit. REMARQUE: Le support CZB peut être conservé à 4 °C pendant 1 mois (voir Fichier supplémentaire 1 pour la composition du support).</li>
	<li>Complétez le milieu CZB avec de la glutamine (1 mM) et de la milrinone (2,5 mM) (CZB + M) (voir tableau des matériaux) et placez-le dans l’incubateur. NOTE: Milrinone est un inhibiteur de la phosphodiestérase qui maintient les ovocytes arrêtés à la prophase I et empêche la reprise méiotique20.</li>
	<li>Préparer le milieu de collecte (milieu essentiel minimal sans bicarbonate, MEM) contenant 3 mg/mL de polyvinylpyrolidone (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (dossier supplémentaire 1) et milrinone (2,5 mM) (MEM/PVP + M, voir le tableau des matières).</li>
	<li>Préparer les boîtes de collecte et de culture, faire quatre microgouttes (100 μL) de milieu de collecte (MEM/PVP + M) et deux microgouttes (100 μL) de milieu de culture (CZB + M) dans des boîtes de Petri de 60 mm et 35 mm, respectivement, et les recouvrir d’huile minérale (voir Tableau des matériaux). Conserver le plat de collecte sur le chauffe-lames et mettre le plat de culture dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2.</li>
	<li>Injecter par voie intrapéritonéale 5 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG, voir le tableau des matières) à des souris femelles rapporteures Cep192-eGFP sexuellement matures (6-8 semaines) 44-48 h avant le prélèvement d’ovocytes.</li>
	<li>Sacrifier les souris par luxation cervicale, identifier et enlever les ovaires21, et les transférer dans un verre de montre contenant un milieu de collecte préchauffé (MEM/PVP + M) à 37 °C.</li>
	<li>Fixez l’ovaire en touchant une seringue de 1 mL au fond du verre de montre et en le perforant plusieurs fois (~40 fois par ovaire) à l’aide d’aiguilles à coudre regroupées ensemble pour libérer les ovocytes dans le milieu.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, transférer tout le milieu contenant les complexes cumulus-ovocytes (COC) de l’étape 1.7 dans une boîte de Petri en plastique vide de 100 mm.</li>
	<li>Sous un stéréomicroscope, recueillir les COC à l’aide d’une pipette en verre Pasteur et les transférer dans la boîte de collecte contenant MEM/PVP + M.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette étroite en verre Pasteur (environ 100 μm de diamètre), dénuder mécaniquement les ovocytes par pipetage doux et répétitif, puis les transférer et les laver en quatre microgouttes de (100 μL) MEM/PVP + M (le plat de collecte) avant leur transfert dans la boîte de culture CZB + M.</li>
	<li>Incuber les ovocytes dénudés pendant 1 h à 37 °C avec 5% de CO2 dans l’air.</li>
</ol>2. Microinjection ovocytaire
<ol><li>Placez une goutte de 250 μL de MEM/PVP + M dans un couvercle de boîte de Petri en plastique de 100 mm et recouvrez-le d’huile minérale. REMARQUE: Le couvercle de la boîte de Petri a un bord inférieur qui offre plus d’espace pour ajuster le micromanipulateur.</li>
	<li>Allumez le système de micro-injection (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Placer la boîte de micro-injection sur l’étage de réchauffement (37 °C) du microscope.</li>
	<li>Chargez l’aiguille d’injection avec 0,5 μL d’ARNc mCh-Cep192à l’aide des pointes de pipette du microchargeur (voir le tableau des matériaux) et fixez l’aiguille d’injection au micromanipulateur.</li>
	<li>Transférer les ovocytes dénudés (étape 1.11) dans la microgoutte de 250 μL (étape 2.1).</li>
	<li>Sous un objectif 20x ou 40x, ajuster la position et la mise au point des aiguilles d’injection et de maintien en fonction de la position de l’ovocyte (Figure 1).</li>
	<li>Configurez l’unité de micro-injection et réglez la pression d’injection (p i), la pression de compensation (pc) et le temps d’injection (ti) pour pouvoir injecter 5 à 10 pl d’ARNc mCh-Cep192 (pour marquer exogène les MTOC).</li>
	<li>Injectez soigneusement les ovocytes sans toucher le noyau.</li>
	<li>Une fois tous les ovocytes injectés, lavez-les en trois microgouttes de CZB + M, transférez-les dans la boîte de culture (CZB + M) et incuberez-les pendant 3 h à 37 °C pour permettre l’expression de mCh-Cep192.</li>
</ol>3. Maturation ovocytaire
<ol><li>Préparer le milieu de maturation en ajoutant de la glutamine (1 mM) au milieu CZB pré-équilibré dans un incubateur avec 5% de CO2 dans l’air à 37 °C pendant au moins 3 h.</li>
	<li>Faire deux microgouttes (100 μL) du milieu de maturation dans une boîte de Petri de 35 mm et les recouvrir d’huile minérale (boîte de maturation).</li>
	<li>Lavez les ovocytes arrêtés par la prophase I au moins trois fois dans des microgouttes CZB sans milrinone de 100 μL pour éliminer complètement la milrinone et permettre la reprise méiotique.</li>
	<li>Transférer les ovocytes dans la boîte de maturation et les incuber pendant 5 h (stade prométaphase I) dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO2 dans l’air à 37 °C.</li>
</ol>4. Préparation ovocytaire pour l’ablation et l’imagerie
<ol><li>Transférer les ovocytes de la prométaphase I (étape 3.4) dans une capsule de culture à fond de verre contenant 100 μL de milieu de maturation (étape 3.1) recouverte d’huile minérale.</li>
</ol>5. Préparation au microscope pour l’ablation
<ol><li>Au moins 30 minutes avant l’ablation, allumez le régulateur de température de l’incubateur de scène (voir Tableau des matériaux) et réglez-le à 37 °C.</li>
	<li>Allumez le contrôleur de CO 2 et réglez-le à 5% CO2.</li>
	<li>Sélectionnez un objectif apochromatique d’immersion dans l’huile 40x et appliquez une petite goutte de l’huile d’immersion.</li>
	<li>Montez le plat de culture à fond de verre avec les ovocytes sur un incubateur de scène et couvrez l’incubateur avec un couvercle de gaz.</li>
	<li>Dans le logiciel d’acquisition d’images (voir le tableau des matériaux), sélectionnez une option permettant d’enregistrer plusieurs positions de scène (par exemple, « Définir la marque et trouver l’expérience »). À l’aide de l’éclairage en fond clair transmis par la lumière, centrez sur les ovocytes individuels et enregistrez leurs positions.</li>
	<li>Dans le logiciel d’acquisition d’images, sélectionnez le mode de numérisation XYZ, définissez le format d’image sur 256 x 256 pixels, réglez le facteur de zoom sur 2,5x - 3,0x et sélectionnez une fréquence de numérisation de 600 Hz. Cela correspond à un temps de séjour des pixels d’environ 1,6 μs.</li>
	<li>Régler une raie laser d’excitation de 488 nm à environ 10 % de la puissance laser (ce qui correspond à 4,0 μW au niveau de l’échantillon) (voir le tableau des matériaux) et utiliser une largeur de bande spectrale de 500 à 550 nm pour observer le signal GFP des COMT. Pour l’observation simultanée de la fluorescence du Cep192 marqué mCherry, réglez une raie laser d’excitation de 585 nm à environ 8% de la puissance laser (ce qui correspond à 10,7 μW au niveau de l’échantillon) et utilisez un autre détecteur réglé sur une bande passante spectrale de 595-645 nm. REMARQUE: Il est utile d’utiliser le détecteur de lumière transmise (TLD) du microscope confocal pour détecter simultanément les limites ovocytaires.</li>
	<li>À l’aide d’un mode de balayage en direct et du contrôle manuel du z-drive, analysez l’ovocyte pour les MTOC.</li>
	<li>Une fois qu’un mcMTOC est détecté, dessinez une région d’intérêt carrée (ROI) autour de lui.</li>
</ol>6. Ablation des mcMTOCs
<ol><li>Réglez un laser femtoseconde sur une longueur d’onde de 740 nm. REMARQUE: La longueur d’onde du laser peut être modifiée en fonction du microscope et des conditions du laser.</li>
	<li>Utilisez le modulateur électro-optique du microscope multiphotonique (voir Tableau des matériaux) pour régler la puissance laser à 70%-80%, correspondant à une puissance de 60-70 mW au plan d’échantillonnage. REMARQUE: Si le laser est équipé d’un compensateur d’impulsion femtoseconde, utilisez-le pour corriger la dispersion de retard de groupe (GDD). La correction GDD réduit la quantité de puissance laser requise pour une ablation efficace du mcMTOC et minimise les photodommages à l’ovocyte. Le contrôle GDD est généralement intégré au logiciel d’acquisition d’images des microscopes multiphotoniques commerciaux.</li>
	<li>Utilisez le même format d’image, le même facteur de zoom et la même fréquence de numérisation qu’à l’étape 5.6. Définissez les paramètres de moyenne de ligne et d’image sur 1.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Scan dans le logiciel pour effectuer l’ablation du mcMTOC en effectuant un seul scan laser du ROI sélectionné.</li>
	<li>Utilisez les paramètres de canal de l’étape 5.7 pour examiner les résultats de l’ablation en comparant les images des structures marquées GFP prises avant et après l’exposition laser multiphotonique. Si l’ablation réussit, l’intensité de la fluorescence GFP dans le mcMTOC ciblé diminue aux niveaux observés en arrière-plan.</li>
	<li>S’il reste quelques fragments d’une structure d’étiquetage GFP, répétez l’étape 6.4 une ou plusieurs fois en vous concentrant sur différents plans z du mcMTOC.</li>
	<li>Utilisez les paramètres de canal de l’étape 5.7 pour vérifier l’efficacité d’ablation par la perte complète des signaux mCherry associés à mcMTOC (mCh-Cep192).</li>
	<li>Répétez les étapes 5.8 à 6.7 jusqu’à ce que tous les MTOCs d’un ovocyte (à différents plans focaux) soient ablés. REMARQUE: Ce protocole utilise la microinjection mCh-Cep192 comme stratégie pour confirmer la déplétion du mcMTOC après une exposition au laser multiphotonique et exclure la possibilité que la perte de fluorescence GFP soit causée par le photoblanchiment GFP. Cependant, la micro-injection de cette sonde est facultative et n’est pas requise pour la procédure d’ablation.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Différentes méthodes existent pour perturber les structures liées au cytosquelette dans les cellules22,23,24,25. Cependant, trouver des techniques efficaces pour perturber sélectivement la structure ciblée sans compromettre la viabilité de la cellule est difficile. La méthode d’ablation laser multiphotonique présentée ici est une stratégie efficace pour induire une perturbation mécanique sélective des mcMTOCs dans l’ovocyte sans altérer la viabilité de l’ovocyte.
L’ablation au laser a été largement utilisée pour comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la ségrégation chromosomique pendant la mitose et la méiose22,23,26,27. En raison de la taille relativement grande (>80 mm de diamètre) des ovocytes de mammifères par rapport aux cellules somatiques28, l’ablation de leurs structures intracellulaires représente un défi. De plus, le volume moyen de mcMTOC dans les ovocytes de métaphase I est de ~20 μm15, ce qui représente un défi supplémentaire. Une méthode efficace qui offre une pénétration tissulaire plus profonde doit être adoptée pour surmonter ces défis. Le principal avantage de l’utilisation du laser multiphotonique pour l’ablation est sa capacité à pénétrer plus profondément dans la cellule tout en minimisant les effets hors cible29.
Pour vérifier l’efficacité et l’efficience de la méthode d’ablation au laser pour épuiser la structure ciblée, il est recommandé d’utiliser une protéine marquée par fluorescence pour identifier la structure ciblée au fil du temps (avant et après l’ablation)23. Il est important de noter que l’ablation au laser épuise l’ensemble du mcMTOC en tant que structure, et bien que les petits mcMTOCs ne nécessitent qu’une seule exposition au laser pour être épuisés, les mcMTOCs plus grands peuvent nécessiter plus d’une exposition laser à différents plans focaux. Il est également recommandé de fixer et d’immunomarquer un sous-ensemble d’ovocytes témoins et ablés par le mcMTOC avec un marqueur MTOC (tel que la γ-tubuline, la péricentrine ou Cep192) pour confirmer davantage l’efficacité de l’ablation du mcMTOC. Dans les ovocytes témoins, les zones du cytoplasme juste adjacentes aux mcMTOCs mais ne se chevauchant pas avec ceux-ci seront exposées au laser.
Cette expérience nécessite plusieurs ablations mcMTOC tout en se déplaçant entre différents plans focaux dans les ovocytes. Par conséquent, il est fortement recommandé de pratiquer cette technique plusieurs fois avant d’exécuter l’expérience afin de minimiser le temps de l’expérience, augmentant ainsi la viabilité des ovocytes. De plus, il est important d’utiliser la puissance laser minimale suffisante pour épuiser les mcMTOCs sans affecter la viabilité des ovocytes.
Cette technique a quelques limites. Premièrement, les microscopes confocaux multiphotoniques sont relativement plus chers que les microscopes confocaux ordinaires. Deuxièmement, perturber tous les MCMTOCs à différents plans focaux prend plus de temps que les perturbations chimiques ou génétiques. Troisièmement, ce protocole exige des compétences techniques pour ablater tous les mcMTOCs dans les plus brefs délais. Cependant, une fois maîtrisé, l’utilisation du laser multiphotonique fournit une excellente stratégie pour perturber plusieurs structures intracellulaires dans les ovocytes de souris, y compris les mcMTOC, contribuant à la compréhension des mécanismes moléculaires régulant le positionnement du fuseau et sa migration rapide dans les ovocytes de mammifères.

Les gamètes haploïdes (spermatozoïdes et ovocytes) sont produits par la méiose, ce qui implique un cycle de réplication de l’ADN suivi de deux divisions consécutives nécessaires à la réduction du nombre de chromosomes avant la fécondation. Chez les mammifères, au début de la vie fœtale, l’ovocyte subit un long arrêt (jusqu’à la puberté) au stade diplotène de la prophase I de la première division méiotique, un stade appelé stade de vésicule germinale (GV). Après la reprise méiotique, l’ovocyte GV subit une rupture de l’enveloppe nucléaire (NEBD), et le fuseau est assemblé principalement au centre ovocytaire 1,2,3. Plus tard, entraîné par la F-actine, le fuseau migre en temps opportun du centre ovocytaire vers le cortex pour assurer une division hautement asymétrique, ce qui donne un œuf avec un minuscule corps polaire (PB)4,5,6.
Dans les cellules mitotiques, les centrosomes sont constitués d’une paire de centrioles entourés de composants matériels péricentriolaires (PMC), tels que la péricentrine, la γ-tubuline, la Cep152 et la Cep1927. Ces centrosomes contenant du centriole contribuent à la fidélité de la formation de fuseaux bipolaires8. Cependant, les centrioles sont perdues au début de l’oogenèse chez diverses espèces, y compris les rongeurs9. Par conséquent, les ovocytes de souris adoptent une voie d’assemblage de fuseau indépendante du centriole en utilisant de nombreux centres d’organisation de microtubules acentriolaires (MTOC)9,10. Lors de la reprise méiotique, les MTOC périnucléaires subissent trois étapes distinctes de recondensation, d’étirement et de fragmentation en un grand nombre de MTOCs plus petits11,12. Les MTOCs fragmentés sont ensuite regroupés et triés pour organiser une broche bipolaire10,13,14. Un autre groupe de MTOCs est situé dans le cytoplasme pendant la NEBD. Certains de ces MTOC cytoplasmiques migrent et forment des pôles fusiformes (MTOC polaires, COTPp)10,11. Récemment, un autre sous-ensemble de MTOC cytoplasmiques a été découvert, appelé MTOCs cytoplasmiques en métaphase (MCMTOC), qui ne contribuent pas à la formation des pôles fusiformes mais restent dans le cytoplasme ovocytaire pendant la métaphase I (Met I)15. L’épuisement des MCMtoc par ablation laser multiphotonique ou l’augmentation anormale de leur nombre par inhibition de l’autophagie perturbe le positionnement et la migration du fuseau et augmente l’incidence de l’aneuploïdie dans les ovocytes de métaphase II15.
Il est intéressant de noter que les MCMTOC diffèrent des mMTOCs à bien des égards15. Par exemple, contrairement aux COTPp, qui proviennent principalement des COT périnucléaires, les MCMTOC proviennent du cortex ovocytaire. Lorsque le fuseau est encore au centre de l’ovocyte, les mcMTOCs sont localisés de manière asymétrique opposée au côté vers lequel le fuseau migre pour l’extrusionPB 15. Les MT de type astral ne peuvent pas atteindre le cortex dans la cellule ovocytaire relativement grande. Par conséquent, ces mcMTOCs nucléent les MT pour ancrer le fuseau (via des MTOC de type astral) au cortex. Ces résultats suggèrent un modèle dans lequel la force MT nucléée par mcMTOC contrecarre la force médiée par F-actine qui entraîne la migration du fuseau vers le cortex. L’équilibre entre ces deux forces opposées est essentiel pour réguler le positionnement central de la broche et la migration rapide de la broche15.
À ce jour, toutes les protéines PMC examinées (péricentrine, g-tubuline, Cep192 et Aurora kinase A) se localisent dans les deux pools MTOC : mcMTOCs et pMTOCs15. Par conséquent, il n’existe pas d’approche chimique ou génétique pour perturber sélectivement les MCMTOC sans perturber les pMTOC. Ces limitations peuvent être contournées en ciblant sélectivement les mcMTOCs par ablation laser. Parmi les technologies laser développées pour la microablation, les lasers femtosecondes multiphotons pulsés présentent un grand potentiel en raison de leur impact de précision limité au plan focal, de la profondeur de pénétration élevée de la lumière proche infrarouge et de la phototoxicité réduite et des dommages thermiques à la cellule16,17,18. Ce travail décrit une approche sélective pour ablater les mcMTOCs dans les ovocytes de souris à l’aide d’un laser multiphotonique couplé à un microscope inversé.

<table><tbody><tr><td>4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID</td><td>Instrument de précision World&nbsp ;</td><td>TW100F-4</td><td>Aiguilles d’injection&nbsp ;</td></tr><tr><td>Verre borosilicaté&nbsp ;</td><td>Fisherbrand&nbsp ;</td><td>Cat# 13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Capillarités en verre borosilicaté.</td><td>Instrument de précision mondial&nbsp ;</td><td>Cat# TW100-6</td><td>Aiguilles de maintien&nbsp ;</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à cage pour microscope Leica DMI6000 B</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chlrode dihydrate</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td>Contrôleur CO2 <td>Cat# C7902nbsp</td><td></td></tr><tr><td> ;</td><td>Pecon</td><td># 0506.000</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Couvercle HP</td><td>Pecon</td><td># 0506.020</td><td></td></tr><tr><td>DL-Acide lactique&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# L7900</td><td></td></tr><tr><td>DMi8</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>N/A</td><td>Microscope&nbsp ;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# E5134</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet 4i</td><td>Eppendorf&nbsp ;</td><td>N/A</td><td>Micro-injecteur&nbsp ;</td></tr><tr><td>Femtotips Microloader</td><td>Fisher scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>E5242956003</tr><tr><td>Gentamicine&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# G1272</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# 1272</td><td></td></tr><tr><td>Plat à fond en verre&nbsp ;</td><td>Mat Tek Corporation</td><td>Cat# P35G-1.0-20-C&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Sodium Salt</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat # H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell vios 160i</td><td>Thermo&nbsp ;</td><td>N/A</td><td>Incubateur de CO2</td></tr><tr><td>Micorscope confocal à balayage laser spectral Leica TCP SP8 avec support inversé DMI6000 B</td><td>Leica Microsystems, Inc</td><td>N/A&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat#G8540</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium dihydraté</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# M7774</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee Ti-Sapphire laser femtoseconde</td><td>Spectra-Physics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>mCH-Cep192 cRNA</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Medium Essential Medium Eagle - MEM</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat #M0258</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M4659</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M5310</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essentiel aigle moyen (MEM)</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# M0268 - 1L</td><td></td></tr><tr><td>Souris : Cep192-eGFP reporter CF-1</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (100 mm)</td><td>Fisherbrand&nbsp ;</td><td>Cat# FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>boîte de Pétri (35 mm)</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>Cat# 430165</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (60 mm)</td><td>Falcon&nbsp ;</td><td>Cat# 351007</td><td></td></tr><tr><td>Rouge phénol</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# P5530</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrolidone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrolidone (PVP)</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# P5405</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# P5655</td><td></td></tr><tr><td>Jument gestante&aiguë ; gonadotrophine sérique&nbsp ;</td><td>Lee BioSolutions</td><td>Cat# 493-10-10&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Acide pyruvique&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Acide pyruvique&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles à coudre&nbsp ;</td><td>D.M.C</td><td>N/A</td><td>N&deg ; 5 * 16 Aiguilles&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# S5761</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# S5886</td><td></td></tr><tr><td>Insert chauffant de niveau P</td><td>Pecon</td><td># 0426.300</td><td></td></tr><tr><td>Sterezoom S9i</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>N/A</td><td>Stéréomicroscope&nbsp ;</td></tr><tr><td>Seringue 1 mL</td><td>BD entreprise&nbsp ;</td><td>Cat# 309597</td><td></td></tr><tr><td>Taurine&nbsp ;</td><td>MilliporeSigma&nbsp ;</td><td>Cat# T0625</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de température Tempcontrol 37-2 digital</td><td>Pecon</td><td># 0503.000</td><td></td></tr><tr><td>Le régulateur de température Cube pour l’incubateur à cage</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ablation laser multiphotonique de centres organisateurs de microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

La fidélité de la méiose ovocytaire est essentielle pour générer des œufs euploïdes compétents sur le plan du développement. Chez les mammifères, l’ovocyte subit un long arrêt à la prophase I de la première division méiotique. Après la puberté et lors de la reprise méiotique, la membrane nucléaire se désassemble (rupture de l’enveloppe nucléaire) et le fuseau est assemblé principalement au centre des ovocytes . Le positionnement initial de la broche centrale est essentiel pour protéger contre les attaches anormales de kinétochore-microtubule (MT) et l’aneuploïdie. Le fuseau positionné au centre migre de manière sensible au temps vers le cortex, ce qui est un processus nécessaire pour extruder un minuscule corps polaire. Dans les cellules mitotiques, le positionnement du fuseau repose sur l’interaction entre les MT astrales médiées par les centrosomes et le cortex cellulaire. Au contraire, les ovocytes de souris n’ont pas de centrosomes classiques et, à la place, contiennent de nombreux centres d’organisation de MT acentriolaires (MTOC). Au stade de la métaphase I, les ovocytes de souris ont deux ensembles différents de MTOC: (1) les MTOC qui sont regroupés et triés pour assembler les pôles de fuseau (MTOC polaires), et (2) les MTOCs cytoplasmiques en métaphase (MCMTOC) qui restent dans le cytoplasme et ne contribuent pas directement à la formation du fuseau, mais jouent un rôle crucial dans la régulation du positionnement du fuseau et de la migration rapide du fuseau. Ici, une méthode d’ablation laser multiphotonique est décrite pour épuiser sélectivement les mcMTOCs marqués de manière endogène dans les ovocytes prélevés sur des souris rapporteures Cep192-eGfp . Cette méthode contribue à la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents au positionnement et à la migration du fuseau dans les ovocytes de mammifères.

L’ablation laser multiphotonique fournit une méthode efficace pour ablater sélectivement les structures intracellulaires. La présente étude a utilisé l’ablation laser multiphotonique pour épuiser sélectivement les mcMTOCs dans les ovocytes de souris. L’ablation au laser a épuisé efficacement les mcMTOCs comme le montre la réduction de la fluorescence endogène GFP dans les mcMTOCs ciblés à un niveau comparable à celui du fond. Le mCh-Cep192 exogène dans les mcMTOCs ciblés a également été aboli après l’ablation au laser. L’ablation au laser des mcMTOCs doit être effectuée à différents plans focaux dans l’ovocyte (où se trouvent les mcMTOCs (Figure 2) pour s’assurer que tous les mcMTOCs dans l’ovocyte sont épuisés (Figure 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig01.jpg"> Figure 1 : Microinjection d’ovocytes. Microinjection d’un ovocyte de souris arrêté par prophase I avec l’ARNc mCh-Cep192. Barre d’échelle: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig02.jpg"> Figure 2 : Déplétion des mcMTOCs dans les ovocytes de souris. Images représentatives de plans focaux uniques. Les carrés blancs indiquent un mcMTOC avant et après l’ablation laser multiphotonique. Barre d’échelle: 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig03.jpg"> Figure 3 : Déplétion des mcMTOCs à différents plans focaux dans un ovocyte de souris. Images de projection maximales représentatives d’un ovocyte de souris ablation par le MCMTOC. Barre d’échelle: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Dossier supplémentaire 1 : Compositions de Chatot, Ziomek et Bavister (CZB) et milieu essentiel minimal sans bicarbonate (MEM/PVP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Un protocole optimisé est présenté qui permet l’épuisement des centres d’organisation des microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris au cours de la métaphase I à l’aide d’un laser femtoseconde proche infrarouge.

Ablation laser multiphotonique de centres organisateurs de microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

Ce protocole offre une excellente stratégie pour ablater sélectivement les MTOC cytoplasmiques, qui sont des régulateurs essentiels pour le positionnement du fuseau dans les ovocytes de souris. Contribuant ainsi à notre compréhension des mécanismes moléculaires qui régulent la méiose des ovocytes. Cette technique permet d’effectuer des ablations ciblées dans des ovocytes vivants avec une grande précision spatiale et avec des effets phototoxiques minimaux sur la cellule. Ce protocole peut être utilisé pour induire une perturbation mécanique sélective de différents instructeurs sans altérer la viabilité cellulaire. Ce protocole nécessite les compétences techniques nécessaires pour ablater tous les MTOCs cytoplasmiques dans les plus brefs délais afin de ne pas compromettre la viabilité des ovocytes. Il est donc essentiel de pratiquer cette technique plusieurs fois avant de réaliser l’expérience proprement dite. Pour commencer, complétez le milieu CZB avec de la glutamine et de la milrinone et placez-le dans l’incubateur. Préparer les plats de collection et de culture. Préparez quatre micro-gouttes de milieu de collecte et deux micro-gouttes de milieu de culture dans des boîtes de Pétri de 60 et 35 mm, respectivement. Et couvrez-les d’huile minérale. Gardez le plat de collecte sur le chauffe-lames et incubez à 37

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Biologie du développement

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