Name: Établissement d’organoïdes endométriaux 3D à partir de l’utérus de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Découvrez comment établir des organoïdes endométriaux 3D à partir d'épithélium utérin de souris. Cette méthode utilise une dissociation enzymatique et mécanique pour étudier la biologie endométriale et les maladies utérines.

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Nous remercions la Dre Stephanie Pangas et le Dr Martin M. Matzuk (M.M.M.) pour la lecture critique et la révision de notre manuscrit. Les études ont été soutenues par les subventions R00-HD00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.M.) et R01-HD110038 (M.M.M.), et par la subvention de soutien du centre de cancérologie NCI-P30 (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. est titulaire d’un prix Next Gen Pregnancy du Burroughs Wellcome Fund.

La manipulation de souris et les études expérimentales ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Baylor College of Medicine et aux lignes directrices établies par le Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
1. Isolement de l’épithélium utérin de souris à l’aide de méthodes enzymatiques et mécaniques
REMARQUE : Cette section décrit les étapes requises pour établir, passer, congeler et décongeler les organoïdes épithéliaux de l’endomètre provenant de souris à l’aide d’un échafaudage à matrice de gel. Des études antérieures ont déterminé que des cultures optimales d’organoïdes endométriaux de souris sont établies à partir de souris pendant la phase4 de l’oestrus, ce qui peut être déterminé par l’examen cytologique d’un écouvillonnage vaginal15. Des souris WT femelles adultes (âgées de 6 à 8 semaines, hybrides C57BL/6J et 129S5/SvEvBrd) ont été utilisées pour toutes les expériences. Les souris ont été euthanasiées sans cruauté selon les directives approuvées par l’IACUC en utilisant une sédation à l’isoflurane suivie d’une désarticulation cervicale. Une fois les souris euthanasiées, les étapes suivantes doivent être suivies. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les matériaux et les solutions utilisés dans ce protocole.
<ol><li>Laisser la matrice de gel décongeler sur la glace pendant environ 1-2 h avant utilisation.</li>
	<li>Pour disséquer la souris, utilisez des ciseaux pour faire une incision médiane sur l’abdomen et décollez doucement la peau pour exposer la couche péritonéale sous-jacente. Utilisez des pinces pour maintenir la couche péritonéale et faites des incisions latérales avec les ciseaux pour exposer le contenu abdominal.<ol><li>Localisez les cornes utérines en déplaçant doucement les coussinets graisseux abdominaux de côté. Disséquez-les en les tenant d’abord à la jonction cervicale et en utilisant des ciseaux pour couper le long de la graisse mésentérique. Après la dissection de l’utérus de souris, retirez soigneusement le tissu adipeux de la corne utérine avec de petits ciseaux. REMARQUE: Maintenir la stérilité pendant l’isolement cellulaire en stérilisant tous les outils chirurgicaux avant utilisation, pulvériser l’abdomen de la souris avec de l’éthanol à 70% et effectuer toutes les étapes suivant la dissection sous une capuche de culture tissulaire stérile.</li>
	</ol></li>
	<li>Coupez chaque corne utérine en petits fragments, chacun mesurant environ 4-5 mm.</li>
	<li>Placez tous les fragments utérins d’un utérus dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant 0,5 mL de trypsine à 1%. Permettre à la solution enzymatique de pénétrer dans la lumière utérine, provoquant une séparation enzymatique de l’épithélium endométrial du stroma sous-jacent.</li>
	<li>Incuber la plaque de 24 puits dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 °C pendant environ 1 h.</li>
	<li>Après 1 h d’incubation, transférer les fragments utérins dans une plaque de culture tissulaire de 35 mm contenant 1 mL de solution tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco.</li>
	<li>Au microscope à dissection, utiliser une pince fine et une pipette de 1 mL pour séparer mécaniquement l’épithélium utérin de la trompe utérine. Tout en maintenant enfoncée une extrémité d’un fragment utérin avec la pince, passez doucement l’embout de la pipette longitudinalement sur le fragment, en pressant l’épithélium hors de l’autre extrémité de la trompe utérine. Observez les feuillets épithéliaux séparés du fragment utérin au microscope à dissection.</li>
	<li>Utilisez la pipette de 1 mL pour recueillir et transférer délicatement les feuillets épithéliaux dans un tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Répétez le processus pour les fragments utérins restants, en transférant toutes les feuilles épithéliales dans le même tube de collecte.</li>
	<li>Enduire les feuillets épithéliaux dissociés par centrifugation pendant 5 min à 375 × g.</li>
	<li>Retirez délicatement le surnageant pour éviter de déranger la pastille de cellule.</li>
	<li>Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 0,5 mL de collagénase à 2,5 mg/mL + 2 mg/mL de solution de DNase. Pipeter de haut en bas environ 10x, ou jusqu’à ce qu’une suspension unicellulaire soit obtenue.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL de DMEM/F12 + 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) + antibiotiques, et centrifuger les cellules pendant 5 min à 375 × g. REMARQUE : Pour obtenir de plus amples renseignements sur l’antibiotique à large spectre utilisé pour la culture cellulaire, veuillez consulter le tableau des matériaux.</li>
	<li>Retirez délicatement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1 mL de DMEM/F12 + 10 % FBS + antibiotiques. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 375 × g.</li>
</ol>2. Traitement du compartiment stromal
REMARQUE: Cette section décrit les protocoles nécessaires pour isoler le compartiment stromal de l’endomètre de souris. Compte tenu de l’intérêt croissant pour les expériences de co-culture épithéliale/stromale, il est important de pouvoir traiter les populations de cellules stromales en plus des cellules épithéliales qui généreront des organoïdes.
<ol><li>Une fois que tout l’épithélium a été séparé enzymatiquement et mécaniquement des fragments utérins, les structures restantes en forme de trompe sont les compartiments « stromaux / myométrial ». Recueillir ce tissu dans une collagénase de 2,5 mg/mL + 2 mg/mL de DNase dans une solution HBSS.</li>
	<li>Incuber l’échantillon stromal/myométrial sur un agitateur à 37 °C pendant 15 min.</li>
	<li>Après l’incubation, ajouter 500 μL de DMEM/F12 + 10 % FBS + antibiotiques par souris et filtrer les fragments non dissociés à travers un filtre cellulaire de 40 μm.</li>
	<li>Enduire les cellules par centrifugation pendant 5 min à 375 × g.</li>
	<li>Retirez délicatement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de DMEM/F12 + 10 % FBS + antibiotiques. Ajouter le mélange goutte à goutte à 10 mL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotiques dans une plaque de culture cellulaire de 10 cm. Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié.</li>
	<li>Pour générer des co-cultures de cellules épithéliales et stromales de l’endomètre de souris, suivre les méthodes décrites pour les organoïdes de l’endomètre humain utilisant des systèmes matriciels sans échafaudage ou de collagène 6,8. NOTE: Bien que ces techniques n’aient pas encore été publiées pour les souris, elles peuvent être adaptées en fonction des protocoles publiés avec l’endomètre humain.</li>
</ol>3. Encapsulation de l’épithélium utérin dans une matrice de gel pour établir des organoïdes
REMARQUE: Gardez la matrice de gel sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.
<ol><li>Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans un volume de matrice de gel 20 fois celui de la pastille de cellule (c.-à-d. si la pastille de cellule est de 20 μL, remettre les cellules en suspension avec 400 μL de matrice de gel). Remettez soigneusement le granulé en suspension pour éviter d’introduire des bulles.</li>
	<li>Laisser la suspension de la matrice/cellule de gel se déposer à température ambiante pendant ~10 min.</li>
	<li>Une fois que la suspension de matrice/cellule de gel devient un gel semi-solide, utilisez une micropipette P200 avec une pointe de 200 μL de large alésage pour aspirer doucement 25 μL de la suspension de matrice/cellule de gel. Distribuer trois dômes distincts de 25 μL par puits d’une plaque de 12 puits et laisser durcir la matrice de gel pendant 15 minutes dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 °C.</li>
	<li>Une fois que la matrice de gel a durci, ajouter 750 μL de milieu organoïde à chaque puits contenant des dômes de matrice de gel. Incuber à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire humidifié. REMARQUE : La formulation des milieux organoïdes est indiquée dans le tableau des matériaux. Les organoïdes se forment généralement dans les 4 jours suivant la culture initiale.</li>
</ol>4. Analyse de l’expression génique des organoïdes de l’endomètre après un traitement à l’œstradiol
REMARQUE : Cette section décrit les méthodes utilisées pour établir le profil de l’expression génique des organoïdes épithéliaux de l’endomètre à l’aide de la qPCR en temps réel après un traitement à l’œstradiol (E2; voir le tableau 1). Parce que l’endomètre est sous le contrôle cyclique de l’hormone ovarienne E2, tester la réactivité des organoïdes à E2 est une mesure importante de la fonction physiologique. Nous avons obtenu un ARN de haute qualité et généré suffisamment d’ARNm pour profiler l’expression génique en utilisant la qPCR et / ou le séquençage de l’ARN de nos organoïdes épithéliaux de l’endomètre. Cette section décrit comment collecter des organoïdes et les traiter pour l’analyse en aval de l’expression génique. Le milieu de traitement choisi reflète celui utilisé pour traiter les cellules endométriales en culture. Cependant, il convient de noter que ce milieu de traitement peut être optimisé en conséquence, comme pour le traitement des cultures 3D de l’endomètre humain avec des hormones 8,16,17.
<ol><li>Culture des organoïdes de l’endomètre comme décrit ci-dessus.</li>
	<li>Retirer le milieu organoïde et le remplacer par 750 μL de milieu de famine quatre jours après l’ensemencement. Incuber pendant la nuit.</li>
	<li>Le lendemain matin, retirez le milieu de famine. Ajouter 750 μL de milieu de traitement contenant soit du véhicule, soit 10 nM d’E2. Incuber pendant 48 h.</li>
	<li>Procéder à l’isolement de l’ARN en suivant le protocole du fabricant du kit.</li>
</ol>5. Analyse histologique des organoïdes endométriaux
REMARQUE: L’imagerie des caractéristiques morphologiques des organoïdes de l’endomètre est essentielle pour évaluer l’effet cellulaire des facteurs de croissance, des manipulations génétiques ou des inhibiteurs de petites molécules. Cette section décrit les techniques utilisées pour fixer, traiter et imager les organoïdes épithéliaux de l’endomètre à l’aide de colorations histologiques et de coloration immunofluorescente par anticorps.
<ol><li>Préparer des tubes microcentrifuges de 1,5 mL contenant 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans 1x PBS. Placez-les sur de la glace.</li>
	<li>Aspirer le milieu des puits de la plaque de 12 puits contenant les organoïdes.</li>
	<li>À l’aide d’un embout de pipette de 1 mL avec un embout coupé, transférer 500 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits et détacher délicatement les dômes de la matrice de gel du fond de la plaque.</li>
	<li>Aspirer doucement les dômes entiers de la matrice de gel dans l’embout de la pipette et transférer dans le tube microcentrifuge de 1,5 mL.</li>
	<li>Fixez les organoïdes en les plaçant sur un rotateur à 4 °C pendant une nuit.</li>
	<li>Le lendemain matin, centrifuger le tube à 600 × g pendant 5 min pour enduire les organoïdes. Retirer délicatement la solution de paraformaldéhyde à 4 % à l’aide d’une pipette et jeter. Lavez les organoïdes 2x avec de l’éthanol à 70%.</li>
	<li>Après le dernier lavage, retirez tout sauf 50-100 μL d’éthanol du tube. Mettez le tube de côté.</li>
	<li>Placez un tube de gel de traitement des échantillons dans un bain-marie et micro-ondes pendant ~30 s pour faire fondre le gel. Assurez-vous que le gel de traitement de l’échantillon ne déborde pas en surveillant la consistance du gel. REMARQUE: Une fois que le gel de traitement de l’échantillon est fondu, mais pas bouillant, travaillez rapidement pour encapsuler les organoïdes.</li>
	<li>Transférer suffisamment de gel de traitement d’échantillon pour couvrir toute la surface du moule (environ 250 μL).</li>
	<li>Pendant que le gel de traitement de l’échantillon est encore fondu, transférer rapidement la solution d’éthanol à 50 μL à 70 % contenant les organoïdes. Assurez-vous que les organoïdes sont enfoncés ou poussés vers la partie inférieure du moule.</li>
	<li>Placez le moule histologique sur un seau de glace et laissez le gel de traitement de l’échantillon refroidir et se solidifier.</li>
	<li>Une fois que le gel de traitement de l’échantillon est complètement sec, transférez soigneusement le carré de gel de traitement de l’échantillon dans un sac à échantillons, en gardant une trace du plan où se trouvent les organoïdes.</li>
	<li>Placer le sac dans une cassette histologique et procéder en utilisant des méthodes standard utilisées pour la fixation du formol et l’incorporation de paraffine dans les tissus18.</li>
	<li>Après fixation et encastrement dans la paraffine, couper en sections de 5 μm à l’aide d’un microtome19. Procéder aux procédures standard de coloration ou d’immunomarquage à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E), comme indiqué ci-dessous.</li>
</ol>6. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine
<ol><li>Déparaffiner les sections comme suit : xylène, 2 x 10 min; 100% éthanol, 2 x 3 min; 80% d’éthanol, 3 min; 60% d’éthanol, 3 min; dH2O, 2 x 3 min; 1 min dans l’hématoxyline; eau du robinet (3 x 5 s); 1 min en éosine.</li>
	<li>Déshydrater les sections comme suit: 60% d’éthanol, 3 min; 80% d’éthanol, 3 min; 95% d’éthanol, 3 min; 100% éthanol, 2 x 3 min; xylène, 2 x 15 min.</li>
	<li>Montage à l’aide d’un support de montage.</li>
</ol>7. Coloration par immunofluorescence
<ol><li>Déparaffinisez les sections comme décrit à l’étape 6.1.</li>
	<li>Effectuer la récupération de l’antigène<ol><li>Immergez les lames dans une solution de récupération d’antigène dans un récipient allant au micro-ondes.</li>
		<li>Micro-ondes à feu vif pendant 20 min, en utilisant des intervalles de 5 minutes pour s’assurer que la solution ne déborde pas.</li>
	</ol></li>
	<li>Une fois l’étape de récupération de l’antigène de 20 minutes terminée, laissez les lames refroidir sur la glace pendant 40 minutes tout en étant immergées dans un tampon de récupération de l’antigène.</li>
	<li>Lavez les lames avec 1x TBST pendant 3 min</li>
	<li>Bloquer les lames en incubant dans 3% BSA dans TBST pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Incubation d’anticorps primaires<ol><li>Diluer l’anticorps dans 3% BSA dans TBST (1:50-1:1 000, selon Ab).</li>
		<li>Incuber pendant la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.</li>
		<li>Laver 3 x 5 min avec TBST.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubation d’anticorps secondaires<ol><li>Diluer l’anticorps dans 3% BSA (dans TBST) (1:250), ou dans 5% de sérum d’âne normal.</li>
		<li>Incuber pendant 1 h à température ambiante (RT) dans l’obscurité, car l’anticorps est conjugué à un fluorophore.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloration nucléaire<ol><li>Diluer le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) 1:1 000 dans le TBST.</li>
		<li>Incuber pendant 5 min à TA.</li>
		<li>Lavez 2 x 5 min avec TBST.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage<ol><li>Utilisez une goutte de support de montage pour monter la lame.</li>
		<li>Scellez le couvercle à l’aide de vernis à ongles le lendemain.</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de l’endomètre de souris et les protocoles couramment utilisés pour leur analyse en aval. Les organoïdes de l’endomètre sont un outil puissant pour étudier les mécanismes qui contrôlent les maladies liées à l’endomètre, telles que l’endométriose, le cancer de l’endomètre et l’échec de l’implantation. Des études marquantes publiées en 2017 ont rapporté les conditions de culture à long terme et renouvelables de cultures d’organoïdes end...

L’endomètre - le tissu muqueux interne de la muqueuse de la cavité utérine - est un tissu unique et très dynamique qui joue un rôle essentiel dans la santé reproductive d’une femme. Au cours de la vie reproductive, l’endomètre a le potentiel de subir des centaines de cycles de prolifération, de différenciation et de dégradation, coordonnés par l’action concertée des hormones ovariennes - œstrogènes et progestérone. Des études sur des souris génétiquement modifiées ont révélé des mécanismes biologiques de base qui sous-tendent la réponse endométriale aux hormones et le contrôle de l’implantation des embryons, de la décidualisation des cellules stromales et de la grossesse1. Les études in vitro, cependant, ont été limitées en raison des difficultés à maintenir les tissus primaires de l’endomètre de souris non transformés dans les cultures cellulaires 2D traditionnelles 2,3. Les progrès récents dans la culture de tissus endométriaux en tant que systèmes d’organes 3D, ou organoïdes, présentent une nouvelle opportunité d’étudier les voies biologiques qui contrôlent la régénération et la différenciation des cellules endométriales. Des systèmes organoïdes de l’endomètre de souris et d’homme ont été développés à partir d’épithélium endométrial pur encapsulé dans diverses matrices4,5, tandis que l’endomètre humain a été cultivé sous forme de co-cultures épithéliales/stromales sans échafaudage6,7, et plus récemment sous forme d’assemblages épithéliaux/stromaux encapsulés dans du collagène8 . Le potentiel de croissance et de régénération des cultures organoïdes épithéliales est soutenu par un cocktail défini de facteurs de croissance et d’inhibiteurs de petites molécules qui ont été déterminés empiriquement pour maximiser la croissance et la régénération des organoïdes 4,5,9. De plus, la capacité de congeler et de décongeler les organoïdes de l’endomètre permet la mise en banque à long terme d’organoïdes endométriaux provenant de souris et d’humains pour des études futures.
Des souris génétiquement modifiées ont révélé les voies de signalisation complexes qui contrôlent la grossesse précoce et la décidualisation, et ont été utilisées comme modèles de perte de grossesse, de cancer de l’endomètre et d’endométriose. Ces études génétiques ont été réalisées en grande partie avec la délétion spécifique à la cellule des allèles flanqués de loxP (« floxed ») en utilisant des recombinases cre qui sont spécifiquement actives dans les tissus reproducteurs femelles. Ces modèles murins comprennent le récepteur de progestérone-cre 10 largement utilisé, qui a une forte activité de recombinase dans les tissus épithéliaux et stromaux de l’endomètre, la lactoferrine i-cre, qui induit la recombinaison épithéliale de l’endomètre chez les souris adultes11, ou Wnt7a-cre, qui déclenche une délétion épithéliale spécifique dans les tissus dérivés de Müller12 . La culture de tissus endométriaux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés en tant qu’organoïdes 3D a fourni une excellente occasion d’étudier la biologie de l’endomètre et de faciliter l’identification des facteurs de croissance et des voies de signalisation qui contrôlent le renouvellement et la différenciation des cellules endométriales13,14. Les méthodes d’isolement et de culture du tissu endométrial de souris sont décrites dans la littérature et rapportent l’utilisation de diverses stratégies enzymatiques pour l’isolement de l’épithélium utérin pour la culture ultérieure d’organoïdes épithéliaux de l’endomètre4. Alors que la littérature précédente fournit un cadre critique pour les protocoles de culture organoïde épithéliale de l’endomètre 4,5,6, cet article fournit une méthode claire et complète pour générer, maintenir, traiter et analyser ces organoïdes. La normalisation de ces techniques est importante pour accélérer les progrès dans le domaine de la biologie de la reproduction des femmes. Ici, nous rapportons une méthodologie détaillée pour la purification enzymatique et mécanique du tissu épithélial de l’endomètre de souris pour la culture ultérieure d’organoïdes de l’endomètre dans un échafaudage à matrice de gel. Nous décrivons également les méthodologies pour les analyses histologiques et moléculaires en aval des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de souris encapsulés dans la matrice de gel.

<table><tbody><tr><td>Formulation de média organoïde</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Concentration finale</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Facteur de croissance réduit (GFR) Matrice de membrane basale, *sans LDEV</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>100 %</td></tr><tr><td>Trypsine du pancréas bovin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426-1G</td><td>1 %</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td>1X</td></tr><tr><td>N2 supplément</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B-27&trade ; Supplément (50X), moins vitamine A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>N-acétyl-L-cystéine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>ALK-4, -5, -7 inhibiteur, A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>EGF humain recombinant</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Noggin humain recombinant</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>Rspondin-1 humain recombinant</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td>500 ng/mL</td></tr><tr><td>Humain recombinant FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>HGF humain recombinant</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>R& D systems</td><td>5036-WN</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td>Autres fournitures et réactifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Concentration finale</td></tr><tr><td>Collagenase de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1G</td><td>5 mg/ mL</td></tr><tr><td>de désoxyribonucléase I du pancréas bovin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100MG</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>1X</td></tr><tr><td>HBSS, sans calcium, sans magnésium</td><td>ThermoFisher</td><td>14170112</td><td>1X</td></tr><tr><td>Falcon. Microplaques en polystyrène (24 puits)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp ; Microplaques en polystyrène (12 puits)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#0877229</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers, 40 & micro ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep (50 &micro ; g)</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-331</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, sans rouge de phénol</td><td>ThermoFisher</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal, dénudé de charbon de bois</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6765-500ML</td><td>2 %</td></tr><tr><td>Estratiol (E2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1024-1G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Formaldéhyde 16 % dans l’eau solution, EM Grade</td><td>VWR</td><td>15710</td><td>4 %</td></tr><tr><td>Cassette Epredia 1 Cassettes de tissus fendues</td><td>Fisher Scientific</td><td>1000961</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Moules de base d’encastrement en acier inoxydable</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-010-15&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, 200 proof (100 %)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td></td></tr><tr><td>Permount Medium Fisher</td><td>Scientific</td><td>50-277-97</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Sacs de biopsie en nylon</td><td>Fisher Scientific</td><td>6774010</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel Gel de traitement d’échantillons</td><td>VWR</td><td>83009-992</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hématoxyline Premium</td><td>VWR</td><td>95057-844</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’éosine Y (jaunâtre) Premium</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Tampon TBS, 20X, pH 7,4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8054</td><td>1X</td></tr><tr><td>TBST (10X), pH 7,4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8056</td><td>1X</td></tr><tr><td>Acide citrique&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium tribasique dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>Solution DAPI 3 %</td></tr> <tr><td>(1 mg/mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>dilution 1:1000</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles transparent</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037246</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Cover Glasses</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>11755050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4364346</td><td></td></tr><tr><td>Krt8 Antibody (TROMA-I)&nbsp ;</td><td>DSHB</td><td>TROMA-I&nbsp ;</td><td>Dilution de 1:50</td></tr><tr><td>Vimentin Antobody</td><td>Cell Signaling</td><td>5741S</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) Anticorps secondaire hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21209</td><td>Dilution 1:250</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Anticorps secondaire hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21206</td><td>dilution 1:250</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 Microscope de routine inversé avec appareil photo numérique</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Primer Sequence</td><td>Forward (5'-3')</td><td>Reverse (5'-3')</td><td>_</td></tr><tr><td>Lipocalin 2 (Lcn2)</td><td>GCAGGTGGTACGTTGTGGG</td><td>CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC</td><td></td></tr><tr><td>Lactoferrine (Ltf)</td><td>TGAGGCCCTTGGACTCTGT</td><td>ACCCACTTTTCTCATCTCTCGTTC</td><td></td></tr><tr><td>Progestérone (Pgr)</td><td>CCCACAGGAGTGTCAAGCTC</td><td>TAACTTCAGACATCATTTCCGG</td><td></td></tr><tr><td>Glycéraldéhyde 3 phosphate déshydrogénase (Gapdh)</td><td>CAATGTGTCCGTCGTGGATCT</td><td>GCCTGCTTCACCTTTTTTT</td><td></td></tr></tbody></table>

Établissement d’organoïdes endométriaux 3d à partir de l’utérus de souris

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Le tissu endométrial tapisse la cavité interne de l’utérus et est sous le contrôle cyclique de l’œstrogène et de la progestérone. C’est un tissu composé d’épithélium luminal et glandulaire, d’un compartiment stromal, d’un réseau vasculaire et d’une population complexe de cellules immunitaires. Les modèles murins ont été un outil puissant pour étudier l’endomètre, révélant des mécanismes critiques qui contrôlent l’implantation, la placentation et le cancer. Le développement récent de cultures organoïdes endométriales 3D présente un modèle de pointe pour disséquer les voies de signalisation qui sous-tendent la biologie de l’endomètre. L’établissement d’organoïdes endométriaux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés, l’analyse de leurs transcriptomes et la visualisation de leur morphologie à une résolution unicellulaire sont des outils cruciaux pour l’étude des maladies de l’endomètre. Cet article décrit les méthodes permettant d’établir des cultures 3D d’épithélium endométrial à partir de souris et décrit des techniques pour quantifier l’expression des gènes et analyser l’histologie des organoïdes. L’objectif est de fournir une ressource qui peut être utilisée pour établir, cultiver et étudier l’expression génique et les caractéristiques morphologiques des organoïdes épithéliaux de l’endomètre.

Images à contraste de phase d’organoïdes endométriaux de souris Nous avons établi des organoïdes à partir de l’épithélium de l’endomètre de souris WT, comme décrit dans le protocole ci-joint (voir schéma de la figure 1). Après la dissociation enzymatique de l’épithélium de l’endomètre de souris, les feuillets épithéliaux ont été séparés mécaniquement des cellules stromales utérines et dissociés avec la collagénase pour générer une suspension unicellulaire. Si elle est eff...

Ce protocole décrit des méthodologies pour établir des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de souris pour l’expression génique et les analyses histologiques.

Établissement d’organoïdes endométriaux 3D à partir de l’utérus de souris

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Ce protocole est important car il montre une méthodologie étape par étape pour isoler l’épithélium utérin très pur de l’utérus de souris pour la culture d’organoïdes endométrial. Cette méthode utilise efficacement la dissociation enzymatique et mécanique pour isoler l’épithélium utérin. Les techniques ont été rationalisées pour établir, traiter et analyser les organoïdes de l’épithélium de l’endomètre dérivés de l’épithélium isolé.Commencez par décongeler la matrice de gel sur de la glace pendant environ une à deux heures avant utilisation. Ensuite, disséquez la souris euthanasiée en faisant une incision médiane sur l’abdomen à l’aide de ciseaux, et en décollant doucement la peau pour exposer la couche péritonéale sous-jacente. Localisez les cornes utérines en déplaçant doucement les coussinets graisseux abdominaux de côté et maintenez les cornes utérines à la jonction cervicale avant de les couper le long de la graisse mésentérique.Après la dissection de l’utérus de souris, retirez soigneusement le tissu adipeux de la corne utérine avec de petits ciseaux. Une fois cela fait, coupez chaque corne utérine en petits fragments, chacun mesurant environ quatre à cinq millimètres. Placez tous les fragments utérins d’un utérus dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant 0,5 millilitre de 1% de trypsine.Incuber ensuite la plaque de 24 puits dans un incubateur de culture tissulaire humidifiée à 37 degrés Celsius pendant environ une heure pour la séparation enzymatique de l’épithélium de l’endomètre du stroma sous-jacent. Après l’incubation, transférer les fragments utérins dans une plaque de culture tissulaire de 35 millimètres contenant un millilitre de solution tamponnée au phosphate de Dulbecco ou DPBS. Ensuite, séparez l’épithélium utérin de la trompe utérine au microscope à dissection en tenant une extrémité d’un fragment utérin avec la pince et en faisant passer doucement l’extrémité de la pipette longitudinalement sur le fragment, en pressant l’épithélium hors de l’autre extrémité de la trompe utérine.Ensuite, observez les feuillets épithéliaux séparés du fragment utérin au microscope à dissection. Ensuite, transférez doucement toutes les feuilles épithéliales dans le même tube de 1,5 millilitre à l’aide de la pipette d’un millilitre. Et enduire les feuillets épithéliaux dissociés par centrifugation à 375 x g pendant cinq minutes.Retirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille de cellule et remettez en suspension la pastille de cellule dans 0,5 millilitre de 2,5 milligrammes par millilitre de collagénase plus deux milligrammes par millilitre de solution d’ADN. Pipeter de haut en bas environ 10 fois ou jusqu’à ce qu’une suspension à une seule cellule soit obtenue. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de DMEM F/12 plus 10% de sérum bovin fœtal ou FBS plus antibiotiques et centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 375 x g.Retirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de DMEM/F12 plus 10% FBS plus antibiotiques et centrifugez les cellules. Placez la matrice de gel sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête. Ensuite, retirez le surnageant des cellules de centrifugation et remettez en suspension la pastille cellulaire en utilisant 20 fois le volume de la matrice de gel sans introduire les bulles.Laisser la suspension cellulaire à matrice gel se déposer à température ambiante pendant environ 10 minutes. Une fois que la suspension de cellules à matrice gel devient un gel semi-solide, utilisez une micropipette P200 avec une pointe de 200 microlitres de large alésage et aspirez doucement 25 microlitres de la suspension cellulaire à matrice de gel. Distribuez trois dômes distincts de 25 microlitres par puits d’une plaque de 12 puits et laissez la matrice de gel durcir pendant 15 minutes et un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius.Une fois la matrice de gel durcie, ajoutez 750 microlitres de milieu organoïde à chaque puits contenant un dôme à matrice de gel et un incubateur à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire humidifié. Les images de contraste de phase des organoïdes de l’endomètre de souris ont montré que la séparation des cellules épithéliales et stromales a produit des échantillons avec pas plus de 10% à 15% de contamination du type cellulaire opposé. Les cellules épithéliales de l’endomètre ont été assemblées en organoïdes en trois à quatre jours.Les organoïdes endométriaux fixés à la paraffine au formol ont été visualisés par des colorations à l’hématoxyline et à l’éosine, qui présentaient la couche unique d’épithélium et les centres creux, les lumières des organoïdes. L’imagerie au microscope à fluorescence a montré que toutes les cellules des organoïdes étaient positives à la cytokératine 8 et contenaient du DAPI, ce qui indique que la fixation, l’incorporation et le traitement des organoïdes de l’endomètre sont compatibles avec l’immunomarquage à base d’anticorps. La PCR quantitative en temps réel a montré que la stimulation avec 10 nanomolaires d’estradiol augmentait l’expression de la lipocaline 2, de la lactoferrine et du récepteur de la progestérone dans les organoïdes épithéliaux, indiquant que les organoïdes épithéliaux de l’endomètre peuvent être utilisés avec succès pour mesurer les changements d’expression génique en réponse à l’œstradiol.Il est important de s’assurer qu’une séparation claire de l’épithélium endométrial est obtenue pendant l’étape de dissociation mécanique. On devrait pouvoir observer l’épithélium émergeant de la trompe utérine. D’autres méthodes incluent l’établissement des organoïdes épithéliaux par encapsulation dans une matrice de gel.Si vous le souhaitez, le compartiment stromal peut être digéré davantage pour créer des co-cultures stromales épithéliales 3D. La méthode peut aider à répondre aux questions sur les signaux contrôlant le renouvellement de l’endomètre. Il pourrait aider à traiter les maladies chez les femmes, telles que l’endométriose, la perte de grossesse et le cancer.

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