Hydrogels de collagène 3D Microtechnique avec alignement de fibres à longue portée

Cette méthode nous permet de concevoir des hydrogels de collagène 3D avec des niveaux contrôlés d’alignement des fibres pour modéliser les environnements trouvés dans les tissus sains et malades du corps. Cette technique fournit une approche microfluidique simple pour concevoir des hydrogels de collagène alignés, introduire des cellules et quantifier le comportement des cellules dans des environnements 3D topographiquement définis. Neil Joshi, Mehran Mansouri, Ann Byerly et Justin Vidas pour mon laboratoire feront la démonstration de la procédure.

Pour commencer, montez une feuille PDMS de 250 micromètres d’épaisseur sur un support en plastique et découpez la conception microfluidique à l’aide d’un couteau artisanal à une profondeur de lame de 0,5 millimètre, à une vitesse d’un centimètre par seconde et à une force élevée. À l’aide d’un bain à ultrasons, nettoyez les découpes du canal microfluidique pendant cinq minutes. Rincez les canaux soniqués dans de l’eau désionisée et séchez-les sur une plaque chauffante à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Conservez les canaux dans une boîte de Petri propre et couverte jusqu’à utilisation. Pour fabriquer la couche de couverture PDMS et fonctionnaliser la surface en vue d’une modification future, préparez une solution de triéthoxysilane aminopropyle à 2% dans un bécher en verre en ajoutant un millilitre de triéthoxysilane aminopropylique à 49 millilitres d’acétone. Ensuite, diluer une solution de glutaraldéhyde à 25% dans de l’eau désionisée.

Faire deux millilitres de solution pour chaque glissement de couvercle de 24 millimètres par 50 millimètres. Nettoyez les couvercles dans un sonicateur de bain pendant cinq minutes en utilisant de l’IPA. Rincez l’IPA des lamelles de couvercle à l’eau désionisée.

Une pellicule d’eau lisse sur le couvercle indique que l’IPA est soigneusement rincée. Sécher le couvercle sur une plaque chauffante pendant cinq minutes à 100 degrés Celsius. Placez les couvercles séchés dans des boîtes de Petri propres, en veillant à ce qu’elles ne se chevauchent pas.

À l’aide d’une baguette de décharge corona, exposez les glissements de couvercle à une décharge corona pendant une minute chacun. Retirez les lamelles de couvercle dans les cinq minutes suivant l’exposition corona et immergez chaque glissement de couvercle dans la solution de triéthoxysilane aminopropylique pendant 10 secondes, en vous assurant que le couvercle est immergé Ensuite, retirez les lamelles de couvercle de la solution aminopropyl triéthoxysilane, immergez-les dans l’acétone pendant 10 secondes et séchez-les à l’air comprimé. Replacez le couvercle sec dans la boîte de Pétri, le côté traité tourné vers le haut.

Pipeter un millilitre de solution de glutaraldéhyde sur la surface de chaque glissement de couvercle. Couvrez autant de surface que possible sans laisser la solution se répandre sur le bord du couvercle. Laissez les couvercles reposer en contact avec la solution pendant 30 minutes, puis rincez à l’eau désionisée pendant 20 secondes.

Sécher les lamelles de couvercle à l’aide d’air comprimé et les replacer dans la boîte de Petri, côté plasma vers le haut Pour découper au laser la base magnétique modulaire, découpez les dessins de la couche de PMMA à l’aide des réglages laser appropriés, tels que le nombre de passes et la puissance. Les réglages laser doivent être ajustés de manière à ce que les aimants puissent être insérés dans la couche de PMMA. Lavez la partie découpée au laser avec de l’eau et du savon pour éliminer les débris du processus de découpe au laser.

N’utilisez pas de solvants, car ils pourraient propager des microfissures dans les bords découpés au laser. Pour assembler la plate-forme, poussez les aimants à la main dans la base découpée au laser. L’épaisseur des aimants doit être inférieure à l’épaisseur de la base en PMMA pour s’assurer que les aimants affleurent la surface de la base.

Décollez le support de l’adhésif sensible à la pression, ou feuille PSA, et fixez la base à un couvercle traité au glutaraldéhyde avec le côté fonctionnalisé vers le haut. Placez délicatement la découpe du canal PDMS dans la cavité définie par le cadre. Appuyez avec une pince à épiler à bout large pour éliminer les bulles d’air et assurer le contact conforme.

Placez l’albumine sérique bovine ou le couvercle du canal traité par BSA sur le dessus de la découpe du canal, le côté BSA tourné vers le bas. Assurez-vous que les orifices d’entrée et de sortie du fluide sont alignés avec le canal. L’appareil est prêt pour l’injection de collagène I.

Placez une pompe à seringue, une seringue stérile réfrigérée, une solution de collagène I neutralisée réfrigérée et une aiguille stérile de verrou luer à 20 degrés à bout incliné de calibre 90 degrés dans une enceinte de biosécurité. Chargez la solution de collagène I dans la seringue, en évitant les bulles. Fixez l’embout de l’aiguille à la seringue, chargez la seringue dans la pompe à seringue, l’aiguille tournée vers le bas, et amorcez l’aiguille avec une solution de collagène I.

Réglez la pompe à seringue au débit requis entre 50 et 2 000 microlitres par minute. Placez les canaux PDMS préparés sur une prise de laboratoire et mettez-les au niveau de l’aiguille. Insérez l’aiguille dans l’orifice d’entrée du canal PDMS.

Injectez le canal jusqu’à ce qu’une goutte de collagène de 30 microlitres que je recueille du côté de la sortie. Abaissez la prise de laboratoire et séparez doucement l’aiguille du canal nouvellement rempli. Répétez jusqu’à ce que tous les canaux aient été remplis de solution de collagène I.

Chargez les canaux remplis dans les boîtes de Petri à côté d’une lingette propre et non pelucheuse saturée d’eau désionisée pour éviter la déshydratation du gel de collagène I nouvellement formé. Couvrir la boîte de Petri et placer les canaux chargés dans l’incubateur pendant deux heures avant l’étape de décollement. Pour le décollement et l’équilibrage des médias, commencez par soulever le couvercle PDMS à l’aide d’une pince à épiler pour exposer le gel de collagène I polymérisé.

Ajouter 650 microlitres de milieu de croissance endothélial au puits. Vous pouvez également fixer un autre module pour introduire une couche de collagène supplémentaire ou fournir des capacités de perfusion de support. Laissez les appareils dans l’incubateur pendant au moins quatre heures pour équilibrer le gel et le média.

Remplacez le support avant l’ensemencement par des cellules. La fonctionnalisation du glissement du couvercle en verre a permis le décollage du canal et la fonctionnalisation du couvercle PDMS avec BSA ont empêché la fixation du collagène I. L’alignement des fibres de collagène I n’a pas été affecté après le décollage du couvercle.

Les images des HUVECs cultivées sur le segment aligné de la matrice ont montré un alignement accru des fibres d’actine par rapport aux HUVECs sur le segment avec des fibres aléatoires. Notre approche nous permet de modéliser le microenvironnement tumoral et de quantifier la réponse des différents types de cellules. Nous pouvons également introduire des canaux d’écoulement pour soutenir des expériences à long terme.