Extraction de lumican à partir d’une membrane amniotique et détermination de sa température de stockage
14 octobre 2022
Le présent protocole décrit l’extraction du lumican de la membrane amniotique (AM) et leurs conditions de stockage sous forme d’extrait de MA (AME) à -20 °C, 4 °C et à température ambiante (RT) pendant 6, 12, 20 et 32 jours pour quantifier ses protéines et sa concentration en lumicane.
Cette méthode vise à démontrer une technique simple d’extraction de protéines, utile pour l’obtention de protéines abondantes et d’autres facteurs. Cette technique pourrait être utilisée pour extraire d’autres facteurs et protéines présents dans la membrane amniotique et aussi, pour obtenir des protéines d’autres sources telles que les animaux et les tissus végétaux. Commencez par décongeler 100 milligrammes de la membrane amniotique obtenue à partir de la banque d’amnions.
Une fois décongelé, ajoutez 10 millilitres de la solution saline équilibrée stérile à une boîte de Petri et lavez la membrane pendant deux minutes. Ensuite, retirez la solution saline équilibrée utilisée dans un bécher et répétez le processus jusqu’à ce qu’aucune trace de glycérol ne soit visible dans la boîte de Pétri. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de dispase II à la membrane et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 30 minutes.
À la fin de l’incubation, effectuer une désépithélialisation mécanique avec un grattoir de cellule de policier en caoutchouc. Ensuite, visualisez la membrane au microscope inversé pour confirmer la dé-épithélialisation. Ensuite, lavez la membrane amniotique désépithélialisée avec la solution saline équilibrée stérile comme démontré précédemment, et placez-la dans un tube microcentrifuge de deux millilitres.
Ensuite, immergez le tube contenant la membrane dans de l’azote liquide pendant 40 minutes. Après la congélation avec de l’azote liquide, broyer manuellement la membrane pendant deux à trois minutes dans un mortier, pré-refroidi à moins 85 degrés Celsius, jusqu’à l’obtention d’une poudre fine. Ensuite, ajoutez 2,5 millilitres de solution inhibitrice de protéase et solubilisez la membrane finement réduite.
Nettoyez les murs de mortier à l’aide d’un couteau à scalpel et transférez le mélange dans un tube de cinq millilitres. Tourbillonner le tube pendant 30 secondes. Ensuite, homogénéiser le mélange tissulaire en centrifugeant d’abord à 34 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, puis en le centrifugeant immédiatement à nouveau à 3, 360 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.
À la fin de la centrifugation, recueillir le surnageant, qui est l’extrait de membrane amniotique, dans un nouveau tube. Ensuite, aliquote 0,7 millilitre dans un tube microcentrifuge différent de deux millilitres pour différents points de temps et températures. La quantité totale de protéines et la concentration de lumican dans l’extrait de membrane amniotique ont été affectées par le temps et les conditions de stockage.
La concentration de protéines basales était similaire parmi tous les extraits de membrane amniotique. Cependant, une concentration significativement élevée de protéines a été notée dans l’extrait stocké pendant 32 jours à quatre degrés Celsius et 20 jours à moins 20 degrés Celsius. Le lumican dans l’extrait de membrane amniotique était significativement plus élevé dans l’échantillon stocké pendant une période de 12 jours par rapport aux échantillons stockés pendant 30, 20 et six jours à quatre et moins 20 degrés Celsius.
Ces résultats suggèrent que la durée et la température d’entreposage appropriées pour atteindre la concentration la plus élevée de lumican sont de 12 jours à moins 20 degrés Celsius. Faites preuve du plus grand soin lors de la mise à la terre de la membrane amniotique gelée. La mise à la terre doit être douce car elle pourrait tomber du mortier.
D’autres études sont nécessaires pour déterminer le rôle de l’extrait membranaire amniotique de lumican dans les cellules épithéliales cornéennes et pour déterminer la dose idéale de lumican pour la réépithélialisation cornéenne.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Ce protocole décrit une méthode d'extraction de la lumican de la membrane amniotique (AM) et de son stockage dans diverses conditions. L'étude quantifie la concentration en protéines et en lumican au cours de différentes périodes de temps.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biochimie
- Biologie cellulaire
Contexte
- La lumican est un protéoglycane impliqué dans divers processus biologiques.
- La membrane amniotique est une source riche en protéines et en facteurs.
- La compréhension des conditions de stockage est essentielle pour préserver l'intégrité des protéines.
- Cette méthode peut être adaptée à d'autres tissus biologiques.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole d'extraction fiable pour la lumican.
- Évaluer les effets de différentes conditions de stockage sur la stabilité de la lumican.
- Fournir une méthode fondamentale pour l'extraction de protéines à partir de membranes biologiques.
Méthodes utilisées
- Décongélation des échantillons de membrane amniotique.
- Lavage de la membrane avec une solution saline équilibrée stérile.
- Incubation avec la dispase II pour l'extraction des protéines.
- Stockage de l'extrait de membrane amniotique à différentes températures pour analyse.
Résultats principaux
- Extraction réussie de la lumican de la membrane amniotique.
- Quantification de la concentration protéique dans différentes conditions de stockage.
- La stabilité de la lumican varie selon la température et la durée.
- Le protocole peut être adapté à d'autres protéines provenant de différentes sources.
Conclusions
- La méthode d'extraction est efficace pour obtenir la lumican.
- Les conditions de stockage influencent considérablement la stabilité des protéines.
- Ce protocole peut faciliter des recherches ultérieures sur les protéines de la membrane amniotique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'extraction fiable et la quantification de la lumican provenant de membrane amniotique humaine permettent un accès standardisé à un composant matriciel bioactif dont la pertinence potentielle s'applique à la recherche sur la réparation oculaire et tissulaire. La compréhension de la stabilité de la lumican dans des conditions de stockage définies soutient des protocoles reproductibles et éclaire les décisions de biotraitement pour des applications translationnelles. Ce protocole présente l'extraction de la lumican comme une capacité réutilisable pour la recherche et le développement en biopharmacie à un stade précoce ainsi que pour le développement de biomatériaux.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet d'étudier le rôle biologique de la lumican dans l'organisation de la matrice extracellulaire et l'épithélialisation.
- Facilite la validation fonctionnelle de la lumican comme candidat pour la recherche en médecine régénérative.
- Permet une détection mécanistique des risques en fournissant des préparations normalisées de lumican pour des études in vitro.
Développement de criblages et de tests
- Fournit une source reproductible de lumican pour l'étalonnage des tests et le criblage de composés.
- Permet une évaluation quantitative de la concentration en lumican dans des conditions contrôlées de stockage.
- Facilite la standardisation des tests en définissant des paramètres optimaux d'extraction et de stockage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Fournit des extraits enrichis en lumican pour l'évaluation préclinique dans des modèles pertinents de réparation cornéenne.
- Permet une continuité entre la découverte et la validation préclinique en préservant l'intégrité protéique pendant les périodes de stockage.
- Appuie les décisions d'avancement tenant compte des risques en précisant les profils de stabilité de la lumican.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole d'extraction et de quantification s'inscrit dans la continuité entre la phase de découverte précoce et la phase préclinique, soutenant à la fois la recherche fondée sur des hypothèses et le développement de biomatériaux translationnels.
- Biologie de la découverte : Fournit une plateforme permettant d'évaluer les effets mécanistiques de la lumican sur le comportement cellulaire et l'assemblage de la matrice.
- Essais de dépistage : Fournit des préparations normalisées de lumican pour le développement reproductible de tests et l'évaluation de composés.
- Analytique : Permet la mesure quantitative de la concentration de lumican afin de comparer les conditions de stockage et d'optimiser les protocoles.
- Recherche translationnelle : Préserve l'intégrité de l'extrait pour des études précliniques ultérieures dans des modèles de réparation tissulaire.
- Réutilisation institutionnelle : Établit un protocole adaptable à d'autres extractions de protéines à partir de membranes biologiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive concernant le rôle fonctionnel et la stabilité de la lumican.
- Valeur opérationnelle : Normalise l'extraction et le stockage, améliorant ainsi la reproductibilité et la reproductibilité à grande échelle.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'orientation (go/no-go) pour les programmes de biomatériaux et de médecine régénérative.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des initiatives de recherche et développement basées sur la lumican.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans les techniques d'extraction et de quantification des protéines.
- Requiert un accès à un stockage au froid, à la centrifugation et aux réactifs inhibiteurs de protéases.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles d'extraction et de stockage.
- Peut être adapté à d'autres sources de tissus moyennant une optimisation du protocole.
- Une manipulation soigneuse lors du broyage est nécessaire pour éviter la perte d'échantillon, comme indiqué dans le protocole.
