Quantification d’ARN circulaires par PCR numérique

La dd-PCR est une méthode très sensible et précise pour la quantification absolue de l’ADN ou de l’ARN cible. Il a été utilisé pour le diagnostic de maladies où d’autres méthodes conventionnelles ne donnent pas de résultats précis. La dd-PCR est la technique la plus sensible pour détecter les molécules d’acide nucléique très peu abondantes.

Contrairement à la PCR quantitative, la dd-PCR ne nécessite aucun contrôle génétique pour la quantification. En raison de sa sensibilité et de sa précision, la dd-PCR peut être utilisée comme outil de diagnostic moléculaire et de recherche impliquant des molécules d’ARN peu abondantes comme les micro-ARN et les ARN circulaires. Avant d’utiliser la dd-PCR, il faut effectuer la RT-PCR ou la RT-qPCR pour confirmer que les amorces amplifient leurs gènes cibles sans amplification PCR non spécifique.

Pour commencer, préparez une séquence modèle de PCR de 200 nucléotides en joignant les 100 derniers nucléotides de la longueur totale de la séquence d’ARN circulaire aux 100 premiers nucléotides de la séquence d’ARN circulaire. Utilisez la séquence de modèles pour l’amorce, conçue par l’outil Web Primer 3. Prenez une boîte de 10 centimètres contenant environ 5 millions de cellules myoblastiques C2C12 proliférantes et un myotube C2C12 différencié de quatre jours pour isoler l’ARN.

Lavez les cellules avec 10 millilitres de 1X PBS trois fois et jetez le PBS à l’aide d’une pipette. Ajouter un millilitre de réactif d’isolement d’ARN et lyser les cellules par pipetage vigoureux. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de chloroforme et de vortex pendant 15 secondes.

Centrifuger le tube à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 12 000 G.Prélever 400 microlitres de la couche aqueuse supérieure, le charger sur une colonne de silice et centrifuger pendant une minute à 12 000 G à température ambiante. Prenez le flux à travers un nouveau tube et ajoutez 600 microlitres d’éthanol 100%. Ajouter 20 microlitres de billes de silice magnétiques et placer le tube sur un thermomélangeur, réglé à 25 degrés Celsius et 1 200 tr / min pendant cinq minutes.

Ensuite, placez le tube sur un support magnétique pendant 30 secondes ou jusqu’à ce que la solution devienne claire. Remettez en suspension les billes de silice magnétiques dans 500 microlitres de tampon de lavage contenant 90% d’éthanol. Après avoir placé le tube sur le support magnétique pendant 30 secondes, laissez les billes se déposer vers l’aimant et jetez le tampon à l’aide d’une pipette.

Sécher le tube à l’air libre à 50 degrés Celsius pendant trois minutes sur un thermomélangeur, en gardant le couvercle ouvert. Ajouter 20 microlitres d’eau sans nucléase et remettre les billes en suspension. Recueillir l’ARN dissous dans un nouveau tube pour l’évaluation de la quantité et de la qualité à l’aide d’un spectrophotomètre.

Mesurer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre et prendre un microgramme d’ARN pour la synthèse de l’ADNc. Mélanger un microgramme d’ARN total avec un microlitre de mélange dNTP, quatre microlitres de tampon transcriptase inverse 5X, deux microlitres d’amorce aléatoire de transcriptase inverse 10X, 0,25 microlitre d’enzyme transcriptase inverse et 0,5 microlitre d’inhibiteur de RNase. Porter le volume à 20 microlitres en utilisant de l’eau sans nucléase.

Placez le tube à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes, suivi de 50 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, placez le tube à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes pour inactiver l’enzyme. Configurez la réaction PCR de 22 microlitres dans des tubes ou des bandes PCR de 0,2 millilitre, ainsi qu’un tube de contrôle négatif et des tubes de contrôle sans gabarit.

Ajouter 11 microlitres de mélange maître dd-PCR, 5,5 microlitres de mélange d’amorces avant et arrière spécifique à l’ARN circulaire d’une concentration micromolaire et 5,5 microlitres d’eau sans nucléase pour mettre en place les tubes de réaction NTC. De même, pour configurer les tubes de réaction d’essai, ajoutez 11 microlitres de mélange maître dd-PCR, 5,5 microlitres de mélange d’amorces directes et inverses spécifiques à l’ARN circulaire d’une concentration micromolaire et 5,5 microlitres d’ADNc. Pour la génération de gouttelettes, transférez 20 microlitres du mélange PCR des tubes PCR de 0,2 millilitre aux puits d’échantillon de la cartouche du générateur de gouttelettes.

Ajoutez soigneusement 70 microlitres d’huile de génération de gouttelettes dans les puits de pétrole de la cartouche du générateur de gouttelettes, à l’aide d’une pipette. Couvrir la cartouche du générateur de gouttelettes avec un joint en caoutchouc et la placer dans la machine génératrice de gouttelettes pour obtenir le mélange de gouttelettes d’huile échantillon, généré dans les puits de gouttelettes de la cartouche. Pour l’amplification par PCR, transférer 40 microlitres du mélange de gouttelettes d’huile de l’échantillon des puits de gouttelettes de la cartouche du générateur de gouttelettes vers une plaque PCR de 96 puits à l’aide d’une pipette.

Scellez la plaque PCR à 96 puits avec le scellant en aluminium. Placez-le dans le bloc de machine d’étanchéité à plaques, préchauffé à 180 degrés Celsius, et cliquez sur le joint pour sceller la plaque PCR. Ensuite, placez la plaque dans le thermocycleur dd-PCR et réglez la température du couvercle à 105 degrés Celsius et un taux de rampe à deux degrés Celsius par seconde.

Une fois la PCR terminée, placez la plaque sur le compteur de gouttelettes dd-PCR avec le porte-plaque dans la position correcte pour compter les gouttelettes. Ouvrez le logiciel d’analyse des gouttelettes et configurez l’exécution en saisissant les informations de l’échantillon. Cliquez sur le bouton Analyser pour analyser les données une fois la lecture de gouttelettes terminée.

Ensuite, cliquez sur le bouton Amplitude 1D pour voir les gouttelettes positives et négatives. Pour séparer les gouttelettes positives des gouttelettes négatives, placez une ligne de seuil commune pour tous les échantillons ayant la même cible. Cliquez sur le bouton d’exportation pour exporter les données de comptage d’ARN circulaire sous forme de fichier csv.

Les données exportées montrent le nombre d’ARN circulaires présents dans chaque échantillon. Calculez manuellement le nombre d’ARN circulaires dans chaque échantillon par nanogramme d’ARN en considérant la quantité totale d’ADNc utilisée dans chaque réaction. L’analyse des données à l’aide du logiciel QuantaSoft est présentée ici.

Tous les échantillons, à l’exception de MT1, ont montré plus de 12 000 gouttelettes. Étant donné que le nombre total de gouttelettes était faible dans MT1, cet échantillon n’a pas été pris en compte pour l’analyse finale des données. Fait intéressant, il y avait une nette différence dans le profil d’expression de Circ B et C2 dans l’état de myotube différencié de quatre jours par rapport aux cellules myoblastiques.

L’analyse de l’abondance de Circ B et C2 en termes de nombre de copies a indiqué que les trois réplicas des myoblastes C2C12 avaient 76,8, 67 et 46 copies par nanogramme d’ARN, tandis que les deux échantillons de myotubes avaient 558 et 610 copies par nanogramme d’ARN. Les données du graphique à barres représentent la moyenne plus moins l’écart-type de deux à trois répétitions biologiques. La ddPCR est l’une des méthodes les plus avancées pour mesurer l’expression différentielle précise de l’ARN circulaire cible.

Cette méthode sera un outil essentiel pour accélérer la recherche et les industries de diagnostic de l’ARN circulaire au cours de l’année à venir.