Collecte d’exsudats de racines de luzerne pour étudier l’impact du phtalate de di(2-éthylhexyle) sur la production de métabolites

Ce protocole décrit comment évaluer l’impact des xénobiotiques sur la luzerne lors d’une analyse métabolomique non ciblée. La technique est très simple et pratique pour le fonctionnement et plus de types d’exsudats racinaires peuvent être identifiés. Ce qui aide à construire l’empreinte métabolomique des exsudats de racines de plantes.

Commencez la stérilisation des graines de medicago sativa ou de luzerne en rinçant les graines avec de l’hypochlorite de sodium à 0,1% pendant 10 minutes. Suivi d’un lavage avec de l’alcool éthylique à 75% pendant 30 minutes. Ensuite, rincez les graines stérilisées plusieurs fois avec de l’eau distillée.

Et puis faites-les germer sur le papier filtre humide placé dans une boîte de Pétri stérile. À 30 degrés Celsius dans l’obscurité. Après la germination, transférer 20 grosses graines dodues à germination uniforme sur un panier de greffe dans une bouteille de culture remplie de solution nutritive.

Placez toutes les bouteilles de culture dans une chambre de culture ayant des conditions contrôlées. Après deux semaines, transférer 15 plants de luzerne uniformes dans une nouvelle bouteille en verre pour les exposer à un milligramme par kilogramme et à 10 milligrammes par kilogramme de stress DEHP pour l’expérience de culture. Envelopper les bouteilles en verre de traitement et de contrôle avec du papier d’aluminium et du parafilm pour prévenir la photolyse et la volatilisation du DEHP.

Complétez la solution nutritive quotidiennement pour maintenir le niveau de liquide. Placez et alternez les bouteilles au hasard tous les deux jours pour assurer des conditions de croissance constantes pour les semis de luzerne. Après sept jours de culture, retirez les plants de luzerne des bouteilles.

Et lavez-les plusieurs fois à l’eau ultrapure pour les préparer à la collecte des exsudats racinaires. Commencez l’expérience de collecte des exsudats racinaires en transférant 10 plantules de luzerne uniformes dans des tubes centrifugés remplis de 50 millilitres d’eau désionisée stérilisée. Pour recueillir les exsudats racinaires, gardez les tubes debout pendant six heures avec les racines immergées dans l’eau.

Une fois cela fait, enveloppez les tubes de centrifugation avec du papier d’aluminium pour protéger les racines de la lumière. Retirer les plantes et lyophiliser le liquide recueilli pour le profilage des métabolites. Poursuivez l’expérience d’extraction en ajoutant 1,8 millilitre de solution d’extraction aux échantillons lyophilisés.

Dans le vortex pendant 30 secondes. Ensuite, appliquez les ondes ultrasonores sur les tubes pendant 10 minutes dans un bain d’eau glacée. Avant de centrifuger les échantillons.

Transférez soigneusement 200 microlitres de surnageant dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Aspirer 45 microlitres de surnageant du tube centrifuge et le mélanger dans des échantillons de contrôle qualité ou de contrôle qualité à un volume final de 270 microlitres. Une fois cela fait, lyophiliser les extraits dans un concentrateur sous vide.

Une fois le séchage terminé, ajoutez cinq microlitres de ribonucléase interne standard et poursuivez le séchage. Après évaporation, ajoutez 30 microlitres de solution de chlorhydrate de méthoxyamination et incuber les tubes à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de réactif BSTFA aux échantillons avant de placer les tubes à 70 degrés Celsius pendant 1,5 heure pour la dérivatisation.

Une fois l’incubation terminée et l’échantillon dérivatisé atteint la température ambiante, ajouter cinq microlitres d’esters méthyliques d’acides gras dissous dans le chloroforme aux échantillons dérivatisés. À l’aide d’une colonne capillaire mesurant 30 mètres sur 250 micromètres sur 0,25 micromètre, séparer un microlitre des exsudats racinaires avec un gaz porteur d’hélium à un débit de 1,0 millilitre par minute. Réglez la température d’injection à 280 degrés Celsius.

Et maintenir la température de la ligne de transfert à 280 degrés Celsius. Réglez le programme du four pour la séparation. Après avoir séparé les extraits, effectuer une spectrométrie de masse en mode collision d’électrons avec une énergie de moins 70 électronvolts.

Maintenez la température de la source d’ions à 250 degrés Celsius. Obtenez des spectres de masse en utilisant le mode de surveillance à balayage complet avec une plage de balayage de masse de 50 à 500 masses par charge à un taux de 12,5 spectres par seconde. 778 pics ont été détectés dans le chromatographe de l’échantillon témoin.

Dont 314 métabolites ont été identifiés selon les spectres de masse. Les acides ont ensuite été subdivisés en acides gras, acides aminés, acides organiques et acides phénoliques. En outre, certaines substances courantes généralement présentes dans les exsudats racinaires ont également été détectées dans les exsudats de racines de luzerne, notamment les pyrimidines, les hydroxypyrimidines, les flavonoïdes, les phénols, les cétones, les pyrimidines et les diterpènes.

Une carte thermique a été tracée en fonction du score VIP pour visualiser la variation des métabolites différentiels entre les différents traitements au DEHP. Par rapport aux échantillons témoins, l’exposition au DEHP a considérablement modifié la teneur en 50 métabolites et exsudats de racines de luzerne. Comprenant principalement des glucides et des acides organiques de faible poids moléculaire.

L’analyse des voies métaboliques a montré que le DEHP inhibait de manière significative le métabolisme des glucides qui sont le produit de la photosynthèse, ce qui indique que le DEHP peut supprimer la photosynthèse de la luzerne dans une certaine mesure le DEHP a favorisé le métabolisme des acides gras qui aident à résister au stress du DEHP. Au moins les exsudats de racines de la graine doivent être effectués pour chaque traitement afin d’assurer une analyse précise des données métabolomiques. Nous pouvons déterminer la métabolisation différentielle et étudier plus avant les règles importantes dans le comportement environnemental des contaminants.

Les interactions entre les plantes et la communauté biologique de terrain au sens large peuvent être déchiffrées principalement en utilisant cette méthode.