Biodosage de létalité à l’aide d’Artemia salina L.

Ce protocole est un outil très utile pour une évaluation préliminaire de la toxicité générale sur différents types d’échantillons, tels que les extraits, les fractions et les composés provenant de différentes sources naturelles ou synthétiques. Le principal avantage de notre protocole est qu’il est très facile et bon marché et peut être utilisé sur plusieurs échantillons en même temps. De plus, l’équipement fait main améliore la fiabilité du site.

Dans cette étape technique, nous effectuons un criblage pour sélectionner les échantillons en fonction de leur profil de toxicité générale préliminaire qui subiront d’autres tests spécifiques, tels que des lignées cellulaires expansives ou même des tests in vivo. Cette méthode est principalement exploitée dans les domaines de la chimie des médicaments et d’autres produits pour cribler des échantillons biotiques. Notre protocole peut également être utilisé pour d’autres types d’échantillons tels que les nanosystèmes.

Tout en effectuant pour la première fois, soyez patient car cela nécessite des compétences d’observation fines et beaucoup d’attention à tous les paramètres rapportés Marcia Filipe et Vera Isca, les doctorants de notre laboratoire aideront à démontrer cette procédure. Commencez par placer le récipient en forme d’entonnoir dans le support noir et tournez l’entonnoir dans une direction appropriée pour voir la marque de niveau et le robinet. Pour fabriquer l’équipement de migration fait à la main, coupez le dessus de deux bouteilles en plastique de 0,5 litre pour obtenir une hauteur finale de 12 centimètres.

Créez un trou de 1,5 centimètre de diamètre sur un côté et à sept centimètres du fond de chaque bouteille et insérez un tube en caoutchouc de 13 centimètres entre les deux ouvertures. Scellez les ouvertures avec de la colle chaude et laissez-les sécher pendant 15 minutes. Placez les bouteilles sur une surface plane et remplissez-les d’eau pour vérifier qu’il n’y a pas de fuite.

Ajouter 28 grammes de sel à 800 millilitres d’eau du robinet pour préparer la solution saline artificielle, ou sel d’artémia à une concentration de 35 grammes par litre. Mélangez-le avec une tige d’agitation jusqu’à ce que tout le sel soit complètement dissous. Pour préparer les échantillons, dissoudre une quantité appropriée de chaque extrait et composé diméthylsulfoxyde, ou DMSO, à une concentration finale de 10 milligrammes par millilitre.

Diluez ensuite 10 microlitres de chaque échantillon dans un nouveau tube microcentrifugé en utilisant 990 microlitres de solution saline artificielle pour obtenir une concentration finale de 0,1 milligramme par millilitre. Sous une hotte dans un erlenmeyer, préparer une solution de dichromate de potassium dans de l’eau distillée à une concentration d’un milligramme par millilitre. Remplissez le récipient d’éclosion avec le milieu jusqu’à la marque de 500 millilitres et ajoutez une cuillère, ou environ 0,5 gramme de kystes d’artémia à la solution saline.

Fermez le conteneur. Placez une lampe pointant directement vers l’équipement et allumez-la. Fixez le système du fournisseur d’air au connecteur placé sur le dessus de l’équipement et allumez la pompe.

Les kystes de la crevette d’artémia éclosent dans la solution saline artificielle sous une aération vigoureuse, un éclairage continu et une température stable. Après 24 à 48 heures, lorsque les œufs ont éclos, éteignez la pompe à air et attendez que les nauplii soient séparés des caisses d’œufs vides. Pour séparer les œufs non éclos des nauplii vivants, ouvrez le robinet de sortie au fond et déchargez le contenu de l’entonnoir dans l’un des récipients du conteneur de l’équipement de migration fait à la main.

S’assurer que la solution contenant les nauplii et les œufs non éclos résiduels se trouve sous le niveau du tube. Placez l’équipement dans l’incubateur pendant quatre heures, puis dans le deuxième récipient, ajoutez la solution saline résiduelle au-dessus de la hauteur du tube. Couvrir le récipient avec des nauplii et les œufs non éclos résiduels à l’aide de papier d’aluminium et placer la lampe sur le deuxième récipient avec seulement la solution saline.

Les artémias seront attirées par la lumière et migreront d’un récipient à l’autre, conduisant à une séparation efficace entre les œufs et l’artémie vivante. Dans le récipient de récolte, prélever 900 microlitres de solution saline contenant 10 à 15 nauplii et placer la solution dans un puits d’une assiette de 24 puits. Tous les échantillons sont testés en quadruplicates.

Ajouter 100 microlitres de chaque témoin négatif. Contrôle positif, la solution saline artificielle, et chacun des échantillons aux puits et incuber la plaque sous éclairage pendant 24 heures. Après 24 heures, enregistrer le nombre de larves mortes dans chaque puits au microscope binoculaire à un grossissement de 12 x.

Ajouter 100 microlitres de solution de dichromate de potassium pour induire la mort des larves vivantes restantes et attendre six heures. Comptez le total des larves mortes dans chaque puits au microscope et déterminez le taux de mortalité selon l’équation montrée à l’écran. Effectuez tous les tests en trois exemplaires et calculez les écarts-types.

Enfin, exprimez les résultats comme la moyenne de trois expériences indépendantes avec chacune des quadruplatés internes plus, moins les écarts-types. La structure des composés sélectionnés extraits des espèces de Plectranthus et obtenus par semi-synthèse est représentée sur cette figure. Un nauplii nouvellement éclos d’Artemia Salina vu au microscope est montré sur cette image.

Cette image graphique représente le taux de mortalité d’Artemia Salina après 24 heures d’exposition à quatre extraits de méthanol de l’espèce Plectranthus à 0,1 milligramme par millilitre. Tous les extraits étaient acceptables en termes de toxicité générale à l’aide de cet essai. Ici, le sel correspond à la solution saline ou à l’ébauche.

Le dichromate de potassium a été utilisé comme témoin positif et le DMSO comme témoin négatif. Tous les extraits testés ont montré des résultats très encourageants avec des valeurs très faibles de pourcentages de mortalité comparables à ceux enregistrés pour le blanc et le témoin négatif. Le taux de mortalité d’Artemia Salina après 24 heures d’exposition aux cinq composés purs à 0,1 milligramme par millilitre est présenté dans cette figure.

D’après ces données, il est évident que seulement cinq présentent une toxicité minimale en utilisant ce test Vous devez vous rappeler trois étapes en particulier, l’éclosion, la migration et la collecte. Par conséquent, nous avons d’autres crevettes séparées et le nombre avec lequel travailler. Le site préliminaire est un modèle simple et peu coûteux de toxicité par canal par rapport à d’autres sites comme la culture cellulaire ou le poisson zèbre.

En outre, des sites de cytotoxicité plus coûteux peuvent alors être exploités.