Name: Modèles orthotopiques translationnels de glioblastome multiforme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Découvrez la technique d'injection intracrânienne de cellules de glioblastome dérivées de modèles GEM chez la souris immunocompétente. Ce modèle orthotopique reproduit fidèlement les caractéristiques invasives des tumeurs humaines et permet d'évaluer l'efficacité de nouvelles thérapies ciblant la croissance tumorale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous sommes reconnaissants à M. Alan E. Kulaga pour son excellente assistance technique et à Mme Michelle L. Gumprecht pour avoir affiné les techniques chirurgicales. Nous remercions le Dr Philip L. Martin pour l’analyse pathologique et Mme Lilia Ileva et le Dr Joseph Kalen du Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program pour les IRM.
Ce projet a été financé en tout ou en partie par des fonds fédéraux du National Cancer Institute, National Institutes of Health, en vertu du contrat n ° HHSN261201500003I. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les points de vue ou les politiques du ministère de la Santé et des Services sociaux, et la mention de noms commerciaux, de produits commerciaux ou d’organisations n’implique pas l’approbation du gouvernement des États-Unis.

Le protocole d’étude décrit ici a été approuvé par le NCI au Frederick Animal Care and Use Committee. NCI-Frederick est accrédité par AAALAC International et suit la politique du service de santé publique pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les soins aux animaux ont été fournis conformément aux procédures décrites dans le Guide de soin et d’utilisation des animaux de laboratoire (Conseil national de recherches, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.).
1. Préparation des cellules injectables
REMARQUE: Les cellules primaires de tumeurs cérébrales de souris (MBR) utilisées pour ce modèle ont été isolées à l’origine chez des souris TRP GEM induites par le tamoxifène, comme décrit dans El Meskini et al.5. Des détails sur la préparation cellulaire peuvent être trouvés dans cette référence.
<ol><li>Effectuer les étapes suivantes en utilisant une technique stérile dans une enceinte de biosécurité.</li>
	<li>Culture in vitro de cellules tumorales cérébrales primaires jusqu’à ce qu’elles atteignent la phase de croissance exponentielle.</li>
	<li>Récoltez les cellules dans 0,25% de trypsine, et une fois qu’elles se sont détachées, diluez-les avec un milieu de croissance pour inactiver la trypsine.</li>
	<li>Enduire les cellules par centrifugation à 400 x g et laver avec un média sans sérum. Répétez une fois avant de compter.</li>
	<li>Comptez les cellules manuellement ou avec un compteur de cellules automatisé. Resuspendre les cellules dans de la méthylcellulose stérile à 5 % dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à la concentration désirée, sur la base d’un volume d’injection final de 2 μL. La concentration cellulaire souhaitée peut varier en fonction de la lignée cellulaire et du modèle de tumeur cérébrale. Pour les cellules GBM GEM TRP, nous injectons 2 μL d’une solution de 25 x 106 cellules/ml, soit 50 000 cellules.</li>
</ol>2. Souche de souris
<ol><li>Breed ou acheter une souche de souris appropriée qui correspond au fond de souche des cellules tumorales cérébrales. Pour les cellules TRP, utilisez des souris B6D2F1/J âgées de 9 semaines (issues d’un croisement entre des femelles C57BL/6J [B6] et des mâles DBA/2J [D2]) comme receveurs de cellules tumorales.</li>
</ol>3. Mise en place de la zone chirurgicale
REMARQUE: Toutes les étapes chirurgicales sont effectuées à l’aide d’une technique aseptique dans un environnement propre et désinfecté. Le chirurgien doit porter des gommages et de l’équipement de protection individuelle, y compris un masque. Les outils chirurgicaux doivent être stérilisés thermiquement avant utilisation.
<ol><li>Placer des protecteurs de surface sous l’appareil stéréotaxique et sur la surface de travail.</li>
	<li>Fixez le tube en vinyle de l’appareil d’anesthésie au port d’entrée de la plate-forme d’anesthésie gazeuse de l’appareil stéréotaxique et un autre tube au port OUT.</li>
	<li>Connectez l’écran numérique à une source d’alimentation et à l’appareil.</li>
	<li>Connectez le contrôleur de micropompe (Figure 1A) à une source d’alimentation et fixez la micropompe (Figure 1A) au bras manipulateur de l’appareil (voir également les instructions du fabricant).</li>
	<li>Réglez la micropompe à 5,6 nL/s pour l’injection volumique de 2 000 nL.</li>
	<li>Allumez le stérilisateur de billes chaudes.</li>
	<li>Branchez le coussin chauffant de la souris dans le régulateur de température et connectez-le à une source d’alimentation. Placez l’assiette sur la plate-forme de scène. Réglez la température de la plaque à 37 °C.</li>
	<li>Chargez une seringue de précision de 30 G, en prenant soin de ne pas introduire de bulles. Insérez le piston et fixez l’aiguille. Assurez-vous de saisir l’aiguille uniquement par le moyeu. Appuyez sur le piston jusqu’à ce qu’une goutte du mélange de cellules de méthylcellulose passe par l’aiguille. Nettoyez l’aiguille avec un tampon de préparation d’alcool à 70 % en essuyant soigneusement les côtés de l’aiguille ou en plaçant un tampon de gaze stérile sur la surface de travail et en l’épongeant. Veillez à ne pas plier ou casser l’aiguille.</li>
	<li>Fixez la seringue de précision à la micropompe et faites pivoter le bras manipulateur loin de la scène, pour éviter le déplacement de l’aiguille de la seringue avant de placer la souris sur la scène.</li>
</ol>4. Préparer la souris à la chirurgie
<ol><li>Anesthésiez la souris en la plaçant dans la chambre d’induction avec le vaporisateur d’isoflurane réglé à 2,5%, ou selon les directives institutionnelles. Activez le flux d’isoflurane vers le nez.</li>
	<li>Transférer la souris dans l’appareil stéréotaxique et la fixer au nez, les dents du haut étant positionnées sur le support du nez (Figure 1B, 9). Serrez le bouton du nez pour le fixer (Figure 1B). Assurez-vous d’un niveau approprié d’anesthésie en effectuant un pincement des orteils pour vérifier les réflexes.<ol><li>Surveillez la couleur (rose) des oreilles, des pieds et des muqueuses pour assurer une oxygénation adéquate. Surveillez également la fréquence respiratoire (une augmentation ou une diminution pourrait indiquer la nécessité d’ajuster les niveaux d’isoflurane).</li>
	</ol></li>
	<li>Insérez des barres d’oreille (Figure 1B) dans les deux oreilles et serrez le bouton pour fixer la tête.</li>
	<li>Appliquez une pommade pour les yeux pour lubrifier les yeux pendant que la souris est sous anesthésie.</li>
	<li>Utilisez des pinces incurvées pour arracher les poils sur la tête de la souris à une zone environ 150% plus grande que l’incision prévue, afin d’assurer des conditions aseptiques adéquates.</li>
	<li>Injecter 0,5-1 mg / kg buprénorphine SR analgésie par voie sous-cutanée, ou utiliser un autre analgésique approuvé par le protocole.</li>
	<li>Positionnez la sonde rectale de la souris pour surveiller la température interne et prévenir l’hypothermie due à l’anesthésie. Maintenez la température corporelle de la souris entre 36,5 et 38,5 °C.</li>
	<li>Désinfectez le champ chirurgical à l’aide de cercles extérieurs, en alternant trois fois entre un gommage chirurgical et de l’éthanol.</li>
	<li>À l’aide d’une pince pour tirer la peau tendue, faites une incision d’environ 1 cm avec la lame du scalpel, en commençant entre les yeux. Le bregma doit être visible à travers l’incision. REMARQUE: Pour une technique stérile appropriée, touchez le site chirurgical uniquement avec les pointes d’outils stérilisés et placez les pointes d’outils sur une surface stérile uniquement (comme l’intérieur d’un paquet d’outils autoclavé).</li>
	<li>Utilisez l’extrémité en bois de l’applicateur à embout de coton pour gratter l’excès de tissu conjonctif, puis l’extrémité en coton d’un autre applicateur pour sécher.</li>
</ol>5. Injection cellulaire
<ol><li>Retournez le bras manipulateur avec la fixation de la seringue sur la souris, en serrant le bouton pour le fixer. Utilisez les boutons X et Y dans le plan horizontal pour déplacer le support de seringue sur le bregma. Abaissez l’aiguille à l’aide du bouton Z pour confirmer la position du bregma. Réglez la console de lecture numérique sur zéro.</li>
	<li>Utilisez les boutons X et Y et le relevé numérique correspondant pour déplacer l’aiguille dans la position souhaitée. Pour l’emplacement du cortex cortical, les coordonnées appropriées sont 3 mm postérieur, 2 mm latéralement droit au bregma et 2 mm de profondeur de la dure-mère. Utilisez le bouton Z pour déplacer l’aiguille à la surface du crâne.</li>
	<li>Percez un trou dans le crâne à l’aide d’une seringue de 1 ml munie d’une aiguille de 25 g. Placez le biseau de l’aiguille vers la seringue et l’aiguille de précision 30 G et tournez soigneusement le bras manipulateur sur le côté. À l’aide du pouce et du doigt, roulez l’aiguille d’avant en arrière lentement en appuyant doucement jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille ne fasse que percer la calotte crânienne.</li>
	<li>Utilisez un applicateur à embout de coton pour tamponner le sang loin du trou de l’aiguille. Replacez le bras manipulateur dans la position appropriée à l’aide de l’aiguille de seringue de précision chargée au-dessus du trou. Alignez la pointe de l’aiguille avec le trou, en utilisant le bouton Z pour abaisser l’aiguille jusqu’à la mémoire cérébrale, et réglez la console de lecture numérique à zéro.</li>
	<li>À l’aide du bouton Z, abaissez l’aiguille de 1 mm, puis attendez 1 min. Répéter jusqu’à ce que la profondeur désirée soit atteinte (2 mm comme indiqué). REMARQUE: L’aiguille est abaissée lentement pour éviter des dommages supplémentaires au tissu cérébral environnant et le reflux de la solution cellulaire.</li>
	<li>Démarrez la micropompe, puis surveillez pour vous assurer que la pompe s’arrête lorsque 2 μL ont été injectés. Ce processus devrait prendre environ 6 minutes à la vitesse indiquée. Ensuite, attendez 1 min avant de déplacer l’aiguille.</li>
</ol>6. Retrait de l’aiguille et fermeture de la plaie
<ol><li>Soulevez l’aiguille de 1 mm, puis attendez 1 min. Répétez jusqu’à ce que l’aiguille soit complètement libre du crâne.</li>
	<li>Si nécessaire, utilisez un applicateur à embout de coton pour tamponner le sang loin du site d’injection.</li>
	<li>À l’aide de l’extrémité en bois d’un applicateur à embout de coton, prenez un petit morceau de cire d’os (~ 1 mm) et façonnez-le en cône. Placez-le dans l’ouverture du crâne, en poussant la cire dans le trou.</li>
	<li>Forceps thermiques à l’aide d’un stérilisateur à billes et utilisez-les pour faire fondre la cire restante sur le crâne et lisser.</li>
	<li>Placez environ deux gouttes de solution de bupivacaïne (anesthésique) dans l’incision et utilisez une pince pour rapprocher les bords de la peau.</li>
	<li>Tirez la peau tendue et placez une ou deux pinces pour fermer la peau.</li>
	<li>Placez la souris dans une cage de récupération propre sur un coussin chauffant dans une zone sans courant d’air et observez attentivement la souris. Laissez la souris se réveiller complètement de l’anesthésie, en reprenant une activité normale, avant de la remettre dans un logement normal.</li>
	<li>Vérifiez la souris tous les jours après l’intervention chirurgicale et administrez la gestion de la douleur, conformément aux directives de l’établissement.<ol><li>Si la buprénorphine SR (étape 4.6) est utilisée pour l’analgésie, la formule à libération prolongée dure 72 h. Répétez l’injection uniquement si une douleur ou un inconfort visible est présent après 72 h. Lorsqu’elles sont effectuées correctement, les souris récupèrent bien des injections intracrâniennes et une analgésie supplémentaire n’est pas nécessaire.</li>
		<li>Retirez les agrafes 7 à 10 jours après la chirurgie.</li>
	</ol></li>
	<li>Surveiller la croissance tumorale par imagerie d’animaux vivants (IRM).<ol><li>Euthanasier les souris lorsque les paramètres sans cruauté sont atteints (c.-à-d. si l’animal perd 20 % de son poids corporel ou devient hypothermique).</li>
		<li>En raison de la nature invasive de ces tumeurs cérébrales, observez les souris pour les symptômes neurologiques, tels que la démarche inégale, la paralysie partielle, la rotation ou l’inclinaison de la tête. Euthanasier une souris si l’un de ces signes cliniques de croissance tumorale avancée est observé.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTamimi%2C+AF+%22Glioblastoma%22">Glioblastoma</a>. , (2017).</li>
<li>Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+and+tools+to+tackle+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Experimental models and tools to tackle glioblastoma.</a> Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).</li>
<li>Wen, P. Y., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+gliomas+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Malignant gliomas in adults.</a> The New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).</li>
<li>Haddad, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+glioblastoma+for+the+evaluation+of+novel+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies.</a> Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).</li>
<li>El Meskini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+orthotopic+model+for+glioblastoma+recapitulates+key+features+of+human+tumors+and+demonstrates+sensitivity+to+a+combination+of+MEK+and+PI3K+pathway+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors.</a> Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+etiology+of+high-grade+astrocytomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (44), 17933-17938 (2013).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+characterization+defines+human+glioblastoma+genes+and+core+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways.</a> Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).</li>
<li>Motomura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis-based+proteomic+subclassification+of+newly+diagnosed+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas.</a> Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).</li>
<li>Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tumor+imaging+with+dynamic+contrast-enhanced+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).</li>
<li>Raza, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+necrosis-associated+genes+in+glioblastoma+by+cDNA+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis.</a> Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).</li>
<li>Raza, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrosis+and+glioblastoma%3A+a+friend+or+a+foe%3F+A+review+and+a+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis.</a> Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Bergers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma%3A+defining+tumor+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma: defining tumor niches.</a> Trends in Cancer. 1 (4), 252-265 (2015).</li>
<li>Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKijima%2C+N+%22Mouse+Models+of+Glioblastoma%22">Mouse Models of Glioblastoma</a>. , Exon Publications. (2017).</li>
<li>Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+needle+insertion+speed+on+tissue+injury%2C+stress%2C+and+backflow+distribution+for+convection-enhanced+delivery+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain.</a> PloS One. 9 (4), 94919(2014).</li>
<li>Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Models+of+Experimental+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gliomas%22%5BJournal%5D)">Mouse Models of Experimental Glioblastoma.</a> Gliomas. , Exon Publications. (2021).</li>
<li>Zalles, M., Towner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-Clinical+Models+and+Potential+Novel+Therapies+for+Glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Gliomas%22%5BJournal%5D)">Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas.</a> Gliomas. , Exon Publications. 1-13 (2021).</li>
<li>Wierzbicki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+therapeutic+monitoring+of+H3K27M-mutant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma.</a> Current Oncology Reports. 22 (2), 19(2020).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Les modèles précliniques sont essentiels pour l’évaluation de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles stratégies de traitement du GBM. Les modèles murins génétiquement modifiés pour le GBM ont l’avantage de l’apparition de tumeurs dans le site autochtone, mais souvent avec une longue latence et une croissance tumorale imprévisible13. Les tumeurs du modèle GEM présentent une latence de 4 à 5 mois, et la fenêtre de temps idéale pour l’imagerie, le recrutement et le traitement est variable ch...

Le glioblastome (GBM; gliome de grade IV) est la tumeur cérébrale la plus courante et maligne, et les traitements actuels sont inefficaces, entraînant une survie médiane de 15 mois1. Des modèles précliniques fiables et précis qui représentent les voies de signalisation complexes impliquées dans la croissance des tumeurs cérébrales et la pathogenèse sont essentiels pour accélérer les progrès dans l’évaluation de nouveaux schémas thérapeutiques pour le GBM. Les modèles murins dans lesquels des lignées cellulaires de tumeurs cérébrales humaines sont implantées par voie sous-cutanée chez des souris immunodéprimées ne reflètent pas l’environnement immunitaire natif des tumeurs cérébrales et ne peuvent pas non plus être utilisés pour évaluer la capacité des traitements à traverser la barrière hémato-encéphalique2. Idéalement, les modèles murins précliniques devraient également reproduire étroitement l’histopathologie du GBM humain, y compris le niveau élevé d’invasivité dans le parenchyme environnant3. Bien que les modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) développent des tumeurs dans le contexte d’un système immunitaire intact, des schémas de sélection compliqués sont souvent nécessaires et les tumeurs peuvent se développer lentement et de manière incohérente4. Les modèles d’allogreffe dérivés de GEM sont mieux adaptés aux études thérapeutiques précliniques, où de grandes cohortes de souris porteuses de tumeurs sont nécessaires dans un délai plus court.
Dans un rapport précédent, nous avons décrit un modèle murin orthotopique GBM dérivé directement des tumeurs GEM. La tumorigenèse dans le GEM est initiée par des événements génétiques dans les populations cellulaires (principalement les astrocytes) exprimant la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), qui entraînent une progression vers le GBM. Ces GEM TRP hébergent un transgène TgGZT121 (T), qui exprime T121 après exposition à la Cre recombinase pilotée par GFAP. L’expression de la protéine T121 entraîne la suppression de l’activité des protéines Rb (Rb1, p107 et p103). La co-expression d’un transgène Cre piloté par GFAP (GFAP-CreERT2) cible l’expression aux astrocytes adultes après induction avec le tamoxifène. Les souris TRP hébergent également un Kras mutant dépendant de Cre (KrasG12D; R) allèle, pour représenter l’activation du récepteur tyrosine kinase voie, et sont hétérozygotes pour la perte de Pten (P)5,6. Des aberrations génétiques concomitantes dans les réseaux du récepteur tyrosine kinase (RTK), PI3K et RB sont impliquées dans 74% de la pathogenèse GBM7. Par conséquent, les principales voies de signalisation altérées dans le GBM humain sont représentées par les mutations modifiées chez les souris TRP, en particulier les tumeurs GBM, dans lesquelles les cibles partagées en aval des RTK sont activées5.
Le modèle orthotopique syngénique dérivé de GEM a été validé en tant que modèle récapitulant les caractéristiques des tumeurs cérébrales humaines, y compris le caractère invasif et la présence de biomarqueurs de sous-type, pour une utilisation comme plate-forme pour évaluer les traitements anticancéreux ciblant les voies aberrantes dans le GBM. Les cellules ont été cultivées à partir de tumeurs prélevées dans les cerveaux TRP et réimplantées dans le cerveau de souris appariées à la souche, en utilisant un équipement stéréotaxique pour l’injection intracrânienne dans le cortex. Ce modèle murin orthotopique préclinique a développé des tumeurs GBM hautement cellulaires, invasives, pléomorphes avec un taux mitotique élevé, et présentait des foyers linéaires de nécrose par des cellules néoplasiques et une vascularisation dense, comme observé pour le GBM humain. Les volumes tumoraux et la croissance ont été mesurés par imagerie par résonance magnétique (IRM) in vivo .
Dans ce rapport, nous décrivons la technique optimale pour l’injection intracrânienne de cellules GBM primaires ou de lignées cellulaires dans le cerveau de souris de type sauvage, en utilisant les tumeurs TRP comme exemple. Le même protocole peut être adapté pour les souris immunodéprimées et d’autres lignées cellulaires GBM. Des conseils cruciaux sont donnés pour éviter les pièges courants, tels que la préparation sous-optimale des cellules ou les fuites de cellules au site d’injection, et pour utiliser correctement l’équipement stéréotaxique afin d’assurer la reproductibilité et la fiabilité du modèle. À des fins translationnelles, nous validons le modèle par détection IRM de la croissance des tumeurs cérébrales chez les animaux vivants, la caractérisation histologique, et présentons un exemple de traitement chez des souris porteuses de tumeurs.

<table><tbody><tr><td>5 % de méthylcellulose dans 1X PBS, autoclavé</td><td>Millipore Sigma</td><td>M7027</td><td></td></tr><tr><td>1mL Seringue à tuberculine, embout coulissant</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>6" Applicateurs à pointe de coton</td><td>Puritan</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Plate-forme scénique réglable</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modèle 901</td><td></td></tr><tr><td>Embouts de barrière anti-aérosol</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-33</td><td></td></tr><tr><td>Coussinets de préparation à l’alcool stériles, grands - 2,5 x 3 pouces</td><td>PDI</td><td>C69900</td><td></td></tr><tr><td>B6D2&nbsp ; souche de souris (C57Bl/6J x DBA/2J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Jax #10006</td><td></td></tr><tr><td>Bone Wax</td><td>Surgical Specialties</td><td>901</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaïne 0,25</td> %<td>Henry Schein</td><td>6023287</td><td></td></tr><tr><td>BuprenorphineSR</td><td>ZooPharm</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tube en vinyle transparent 1/8ID X 3/16OD</td><td>UDP</td><td>T10004001</td><td></td></tr><tr><td>CVS Lubrifiant Pommade oculaire</td><td>CVS Pharmacie 247881</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpels jetables, Scalpel à lame #10</td><td>Miltex</td><td>16-63810</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’anesthésie au gaz avec raccordement à l’oxygène et boîte d’anesthésie</td><td>Somni Scientific</td><td>n/a</td><td>L’investigateur peut utiliser l’équipement standard facility </td></tr><tr><td>Gaz plateforme d’anesthésie pour souris</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modèle 923-B</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Graphpad</td><td>Prism&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 9 ans ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; version 9.4.1</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille Hamilton 30 g, &frac12 ; ", petit moyeu, point pst 3</td><td>Hamilton</td><td>Commande</td><td></td>spéciale</tr><tr><td>Seringue de précision Hamilton microliter, 1701 RN, pas d’aiguille 10 & micro ; L</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>Stérilisateur à billes chaudes avec perles</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Countess 3 Compteur de cellules automatisé</td><td>Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Tampons de préparation à l’alcool isopropylique</td><td>PDI</td><td>C69900</td><td></td></tr><tr><td>ITK_SNAP (Version 36.X, 2011- présent)</td><td>Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) à l’Université de Pennsylvanie, et le Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) à l’Université de l’Utah</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument avec console de lecture numérique</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modèle 940</td><td></td></tr><tr><td>Raccord Masterflex, PVDF, droit, Réducteur de cannelure de tuyau, 1/4 » ID x 1/8 » ID</td><td>Masterflex</td><td>HV-30616-16</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante pour souris</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>Sonde rectale pour souris</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH RET-3-ISO</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Super Versi-Dry Protecteurs de surface</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>74000-00</td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipette</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iode Blouse chirurgicale</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 9 mm Wound Clip Applicator</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 9 mm Wound Clip Remover</td><td>Fine Science Tools</td><td>12033-00</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 9 mm Wound Clip</td><td>Fine Science Tools</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Pince Semken, incurvée</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de température</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %)</td>Seringue à tuberculine <td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>avec aiguille de 25 g, embout coulissant</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump 3 avec contrôleur Micro2T</td><td>World Precision Instruments</td><td>Modèle UMP3T</td><td></td></tr></tbody></table>

modèles orthotopiques translationnels de glioblastome multiforme

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Les modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) pour le glioblastome multiforme humain (GBM) sont essentiels pour comprendre le développement et la progression des tumeurs cérébrales. Contrairement aux tumeurs xénogreffées, dans les GEM, les tumeurs apparaissent dans le microenvironnement natif chez une souris immunocompétente. Cependant, l’utilisation des GEM GBM dans les études de traitement précliniques est difficile en raison des longues latences tumorales, de l’hétérogénéité de la fréquence des néoplasmes et du moment du développement tumoral de grade avancé. Les souris induites par injection orthotopique intracrânienne sont plus traitables pour les études précliniques et conservent les caractéristiques des tumeurs GEM. Nous avons généré un modèle orthotopique de tumeur cérébrale dérivé d’un modèle GEM avec aberrations Rb, Kras et p53 (TRP), qui développe des tumeurs GBM présentant des foyers linéaires de nécrose par des cellules néoplasiques et une vascularisation dense analogue au GBM humain. Les cellules dérivées des tumeurs GBM GEM sont injectées par voie intracrânienne dans des souris receveuses de type sauvage et appariées à la souche et reproduisent les tumeurs de grade IV, contournant ainsi la longue période de latence tumorale chez les souris GEM et permettant la création de cohortes importantes et reproductibles pour les études précliniques. Les caractéristiques hautement prolifératives, invasives et vasculaires du modèle TRP GEM pour le GBM sont récapitulées dans les tumeurs orthotopiques, et les marqueurs histopathologiques reflètent les sous-groupes de GBM humains. La croissance tumorale est surveillée par des IRM en série. En raison de la nature invasive des tumeurs intracrâniennes dans les modèles immunocompétents, il est essentiel de suivre attentivement la procédure d’injection décrite ici pour prévenir la croissance tumorale extracrânienne.

Les souris injectées avec des cellules tumorales cérébrales doivent être surveillées quotidiennement pour détecter des signes de croissance tumorale tels que des convulsions, une ataxie ou une perte de poids. La croissance des tumeurs cérébrales peut également être surveillée par IRM à intervalles réguliers. Les IRM hebdomadaires permettent de visualiser l’augmentation de la charge tumorale dans le cerveau et les mesures du volume tumoral (Figure 1C). En particulier, les tumeurs TRP présente...

Ici, nous décrivons un modèle murin orthotopique préclinique pour le GBM, établi par injection intracrânienne de cellules dérivées de tumeurs modèles de souris génétiquement modifiées. Ce modèle présente les caractéristiques de la maladie du GBM humain. Pour les études translationnelles, la tumeur cérébrale de souris est suivie par IRM in vivo et histopathologie.

Modèles orthotopiques translationnels de glioblastome multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

Nous décrivons la technique optimale pour l’injection intracrânienne de cellules de glioblastome dérivées de GEM dans un cerveau de souris immunocompétent, ce qui entraîne des tumeurs qui récapitulent les principales caractéristiques du glioblastome humain. Cette technique d’injection orthotopique de cellules TRP dérivées de GEM donne des résultats hautement reproductibles, évolutifs et cohérents pour les tumeurs qui proviennent du cortex, tout en maintenant le caractère invasif des tumeurs GEM. Les tumeurs cérébrales du glioblastome chez la souris affichent une croissance agressive et envahissent le parenchyme cérébral environnant.Par conséquent, il peut être utilisé pour évaluer les thérapies qui peuvent supprimer l’infiltration tumorale et la migration chez les patients. Ce protocole peut être personnalisé pour d’autres modèles de tumeurs cérébrales, virus, thérapeutiques ou adapté pour l’injection dans différentes régions du cerveau avec les ajustements des coordonnées stéréotaxiques. Devon Atkinson, un associé de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Pour commencer, placez des protecteurs de surface sous l’appareil stéréotaxique et sur la surface de travail. Connectez le tube en vinyle de la machine d’anesthésie à l’orifice de la plate-forme d’anesthésie gazeuse de l’appareil stéréotaxique et un autre tube à son port de sortie. Connectez l’écran numérique à une source d’alimentation et à l’appareil.Ensuite, fixez la micro-pompe au bras manipulateur de l’appareil après avoir connecté le contrôleur de micro-pompe à la source d’alimentation. Réglez la micropompe à 5,6 nanolitres par seconde. Connectez le coussin chauffant de la souris au régulateur de température et à une source d’alimentation.Charger à contre-charge une seringue de précision de calibre 30 avec un mélange de cellules de méthylméthylcellulose en évitant les bulles. Après avoir inséré le piston, fixez l’aiguille et appuyez sur le piston jusqu’à ce que le mélange de cellules chargées tombe à travers l’aiguille. Nettoyez l’aiguille avec un tampon de préparation d’alcool à 70%.Une fois la seringue de précision fixée à la micropompe, faites pivoter le bras manipulateur loin de la scène avant de placer la souris pour éviter le déplacement de l’aiguille de la seringue. Transférez la souris anesthésiée à l’instrument stéréotaxique et fixez-la au cône nasal en plaçant les dents supérieures sur le support du cône nasal. Après avoir serré le cône nasal avec un bouton, pincez un orteil pour vérifier les réflexes afin d’assurer une anesthésie adéquate.Insérez ensuite les barres d’oreille et serrez le bouton pour fixer la tête. Appliquez une pommade pour les yeux pour lubrifier les yeux dans des conditions anesthésiées. Injectez l’analgésique buprénorphine SR par voie sous-cutanée et placez une sonde rectale de souris pour surveiller la température interne.Stériliser le champ chirurgical à l’aide de cercles extérieurs, en alternant trois fois entre un gommage chirurgical et de l’éthanol. Tirez la peau tendue avec une pince et utilisez une lame de scalpel pour faire une incision d’environ 1 centimètre de long entre les yeux. Pour l’injection cellulaire, retournez le bras manipulateur avec la seringue attachée à la souris.Après avoir serré les boutons, déplacez la seringue à l’aide des boutons X et Y dans le plan horizontal et montez-la sur le bregma. Abaissez l’aiguille, à l’aide du bouton Z, pour confirmer la position du bregma et réglez la console de lecture numérique à zéro. Ensuite, déplacez l’aiguille dans la position souhaitée, comme décrit dans le manuscrit, en utilisant les boutons X et Y et la lecture numérique correspondante, et utilisez le bouton Z pour déplacer l’aiguille à la surface du crâne.Percez un trou dans le crâne à l’aide d’une seringue de 1 millilitre avec une aiguille de calibre 25 attachée. Faites pivoter délicatement le bras manipulateur sur le côté, tout en plaçant le biseau de l’aiguille vers la seringue de précision de calibre 30. Une fois que le bras manipulateur avec l’aiguille de seringue de précision chargée est positionné sur le trou, alignez l’extrémité de l’aiguille avec le trou et utilisez le bouton Z pour abaisser l’aiguille dans la dure-mère du cerveau.Après avoir mis la console de lecture numérique à zéro, abaissez l’aiguille de 1 millimètre avec le bouton Z et attendez une minute. Une fois la profondeur de 2 millimètres atteinte, arrêtez la micropompe et assurez-vous que la pompe s’arrête lorsque 2 microlitres de suspension cellulaire ont été injectés. Pour retirer l’aiguille du crâne, soulevez-la d’un millimètre et attendez une minute.Pour la fermeture de la plaie, à l’aide de l’extrémité en bois d’un applicateur à pointe de coton, prenez un morceau de cire d’os et façonnez-le en cône. Après avoir placé la cire dans l’ouverture du crâne, poussez-la dans le trou. Utilisez la pince stérilisée par perles pour faire fondre la cire restante sur le crâne.Une fois qu’il devient lisse, ajoutez deux gouttes de solution anesthésique de bupivacaïne dans l’incision et tirez les bords de la peau ensemble, à l’aide de forceps. Après avoir tiré la peau tendue, à l’aide d’un ou deux clips de plaie, fermez la peau, placez la souris dans une cage de récupération propre sur un coussin chauffant dans une zone sans courant d’air et observez attentivement la souris. Les IRM hebdomadaires ont montré une augmentation de la charge tumorale dans le cerveau et des mesures du volume tumoral.La mesure du volume tumoral par IRM a révélé un manque de suppression de la croissance tumorale, même après la radiothérapie, et la survie des souris traitées n’a pas été augmentée. Les tumeurs GBM dans les modèles syngéniques semblaient être cultivées agressivement et ont percé le crâne par le point final terminal. Si une croissance extracrânienne est observée à l’imagerie après l’implantation cellulaire, cela indique une fuite cellulaire pendant le processus d’injection, et plus de précautions doivent être prises lors du retrait de l’aiguille d’injection.L’histopathologie des tumeurs orthotopiques TRP GBM a confirmé la présence d’astrocytome de grade 4, y compris la récapitulation des caractéristiques distinctives des tumeurs telles que la pseudopalissade et la nécrose. Soyez précis lorsque vous réglez le point zéro au niveau du bregma pour garantir des coordonnées d’injection cellulaire correctes. L’abaissement et le relèvement de l’aiguille dans le cerveau doivent être lents pour prévenir les traumatismes et les reflux.Après l’injection de cellules tumorales, des IRM hebdomadaires peuvent être utilisées pour déterminer la taille de la tumeur de base avant de commencer le traitement et pour visualiser l’évolution de la charge tumorale dans le cerveau.

translational-orthotopic-models-of-glioblastoma-multiforme

Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Le but de cet article est de décrire l'utilisation d'un modèle de glioblastome orthotopique pour les études de chimioradiothérapie. Cet article va passer si le traitement des cellules, l'implantation, et de la radiothérapie de la souris en utilisant un modèle intracrânienne.

La radiothérapie combinée à un modèle de tumeur de cerveau de souris orthotopique

Nous décrivons une méthode intégrée pour la précision, l'implantation stéréotaxique de cellules humaines de glioblastome multiforme dans le cerveau des souris nude et de série...

Implantation stéréotaxique intracrânienne et<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie bioluminescente de xénogreffes tumorales dans un système de modèle de souris de glioblastome multiforme

Les gliomas malins constituent un groupe hétérogène de néoplasmes glial fortement infiltrative avec les configurations cliniques et moléculaires distinctes. Les xénogreffes orthotopic primaires récapitulent les dispositifs histopathologiques et moléculaires des sous-types malins de glioma dans les modèles animaux précliniques.

Les xénogreffes orthotopiques primaires de gliome récapitulent la croissance infiltrante et la mutation de l’isocitrate déshydrogénase I

Nous avons établi un modèle de glioblastome orthotopique corticale chez la souris pour intravitale microscopie à deux photons qui récapitule les contraintes biophysiques normalement en jeu au cours de la croissance de la tumeur. Une fenêtre en verre chronique remplaçant le crâne au-dessus de la tumeur permet le suivi de la progression de la tumeur au cours du temps par microscopie à deux photons.

Un modèle de souris orthotopique glioblastome maintien contraintes physiques et parenchyme cérébral Convient pour intravitale deux microscopie biphotonique

Les astrocytes phénotypiquement sauvages et les cellules souches neurales récoltées sur des souris modifiées avec des allèles oncogéniques conditionnels floxés et transformés par recombinaison virale médiée par Cre peuvent être utilisés pour modéliser la pathogenèse de l’astrocytome in vitro et in vivo par injection orthotopique de cellules transformées dans le cerveau de compagnons de portée syngéniques et immunocompétents.

Modélisation astrocytome pathogenèse In Vitro Et In Vivo Utilisation corticale astrocytes ou cellules souches neurales à partir de, souris génétiquement modifiées conditionnelle

Nous décrivons ici un protocole efficace et polyvalent pour induire, surveiller et analyser de nouveaux glioblastomes (GBM) à l’aide d’ADN transposon injecté dans les ventricules de souris néonatales. Les cellules de la zone sous-ventriculaire, qui absorbent le plasmide, se transforment, prolifèrent et génèrent des tumeurs présentant des caractéristiques histopathologiques du GBM humain.

Transposon Mediated intégration du plasmide ADN dans le zone sous-ventriculaire de souris néonatale pour générer des modèles nouveaux de glioblastome

Les cellules de gliome GL261 fournissent un modèle animal immunocompétent utile du glioblastome. Les objectifs de ce protocole sont de démontrer des techniques appropriées pour surveiller la croissance tumorale intracrânienne à l’aide de l’imagerie de bioluminescence in vivo, et de vérifier l’utilité des cellules GL261 modifiées par la luciférase pour l’étude de l’immunologie tumorale et des approches immunothérapeutiques pour le traitement du glioblastome.

Bioluminescence imagerie d&#39;un modèle animal pour immunocompétentes glioblastome

Ici, nous présentons un protocole pour la préparation et l’administration stéréotaxique de lymphocytes humains allogéniques dans des souris immunodéficientes transportant des tumeurs primaires du cerveau humain orthotopique. Cette étude fournit une preuve de concept pour la faisabilité et l’efficacité antitumorale des immunothérapies cellulaires intrabrain-livré.

Stéréotaxique transfert adoptif de cellules immunitaires cytotoxiques dans des modèles murins de xénogreffes de glioblastome Multiforme Orthotopic homme

L’objectif de ce protocole est de fournir aux chercheurs une technique hautement reproductible pour les implantations intracrâniennes.

Implantation intracrânienne stéréotactique de lignées cellulaires de xénogreffes dérivées d’un patient chez des souris

Nous présentons un modèle de migration 3D du glioblastome utilisant des gliomasphères magnétiques dérivées du patient générées à partir de tumeurs nouvellement diagnostiquées et récurrentes. Cette plateforme permet de visualiser la dynamique migratoire spécifique au patient et d’évaluer l’efficacité thérapeutique. Le test peut être multiplexé après migration afin d’évaluer la localisation et les schémas d’expression des protéines.

Essai de migration du glioblastome 3D reproductible avec localisation sphéroïde médiée par nanoparticules magnétiques dans des conditions hypoxiques

Découvrez la technique d'injection intracrânienne de cellules de glioblastome dérivées de modèles GEM chez la souris immunocompétente. Ce modèle orthotopique reproduit fidèlement les caractéristiques invasives des tumeurs humaines et permet d'évaluer l'efficacité de nouvelles thérapies ciblant la croissance tumorale.

Modèles orthotopiques translationnels de glioblastome multiforme

Explorer plus de vidéos