Essai de criblage à haute teneur pour l’identification de composés modificateurs de la cytotoxicité cellulaire dépendants des anticorps

La cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps, ou ADCC en abrégé, peut être médiée par des cellules tueuses naturelles, que nous appelons cellules NK, granulocytes et macrophages. Ce sont les cellules effectrices de l’ADCC. Si un anticorps tel que le trastuzumab, qui cible le récepteur du facteur de croissance épidermique, HER2, se lie aux cellules tumorales, ces cellules effectrices utilisent leurs récepteurs FcyR pour se lier à la région FC constante des anticorps.

L’anticorps relie les cellules tumorales et les cellules effectrices porteuses du récepteur FcyR, déclenchant la libération de leurs granules cytotoxiques. Cela conduit à l’apoptose des cellules cancéreuses. L’ADCC peut être efficace contre les tumeurs qui ne répondent pas aux effets anti-prolifératifs du trastuzumab.

Pour mettre en place le système ADCC, nous devons co-incuber les cellules de carcinome du sein JIMT-1 anti-HER2 positives avec la lignée cellulaire NK-92 en présence de l’anticorps anti-HER2 trastuzumab. La lignée cellulaire JIMT-1 que nous utilisons pour le test exprime de manière stable la protéine fluorescente verte. Tout d’abord, codez la plaque de criblage à haute teneur de 96 puits avec le milieu JIMT.

Pipeter 50 microlitres de milieu dans chaque puits de la plaque. Placez l’assiette dans un incubateur à CO2 pendant une heure. Le revêtement est crucial pour la fixation des cellules JIMT-1 à la surface vitrée de la plaque.

Pendant l’étape de revêtement, trypsiniser les cellules JIMT-1. Lavez les cellules avec deux millilitres de PBS stérile. Ensuite, ajoutez un millilitre de trypsine-EDTA dans la fiole.

Remettez le ballon dans un incubateur à CO2 pendant 10 minutes. Après l’incubation, tapotez la fiole pour vérifier si les cellules JIMT-1 se sont détachées. Arrêtez la digestion avec deux millilitres de milieu JIMT-1 et recueillez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres.

Ensuite, comptez les cellules JIMT-1 avec du bleu trypan dans une chambre de moulage bleue. Ajustez le nombre de cellules à 133 000 cellules par ml. Aspirez le milieu de revêtement, puis ajoutez 75 microlitres de suspension cellulaire à chaque puits.

Laissez les cellules se fixer pendant une nuit d’incubation à 37 degrés Celsius dans un incubateur à CO2. Le lendemain, aspirez le milieu et ajoutez 50 microlitres de milieu JIMT-1 frais dans les puits, puis transférez la plaque au laboratoire de criblage à haut débit. Le robot est utilisé pour transférer les composés d’essai sur les microplaques de criblage à haute teneur.

Avec le bras robotique, le robot saisit l’unité d’outils à goupilles, qui est calibrée pour transférer 25 nanolitres. Transférer un total de 100 nanolitres de composés d’essai de la plaque de bibliothèque de composés à la plaque d’essai en quatre étapes. Assurez-vous que la concentration finale des composés d’essai est de 20 micromolaires.

Entre chaque étape, lavez d’abord l’outil à broche dans 50% de DMSO, puis dans de l’éthanol à 70%. Incuber la plaque pendant une heure dans un incubateur à CO2 à 37 degrés Celsius. Culture de cellules NK dans des flacons de culture tissulaire T25.

Pendant que le traitement médicamenteux des cellules JIMT-1 est en cours, recueillir les cellules NK d’un ballon T25 dans un tube centrifuge de 15 millilitres. Comptez les cellules NK-92 avec du bleu trypan dans une chambre de comptage bleue. Ajustez le nombre de cellules à 400 000 cellules par ml.

Centrifuger le volume de la suspension de cellules NK qui contient 400 000 cellules par ml à 150 g pendant trois minutes à température ambiante. Préparer le milieu ADCC en ajoutant 20 microgrammes par ml d’anticorps anti-HER2 trastuzumab au milieu JIMT-1. Pipette 20 000 cellules NK dans un milieu ADCC de 50 microlitres vers les cellules GFP JIMT-1 cibles.

Le volume final est de 100 microlitres et la concentration finale de trastuzumab est de 10 microgrammes par ml. Placez la plaque d’essai dans l’équipement d’analyse à haute teneur, doté d’un incubateur intégré réglé à 37 degrés Celsius. Les plaques sont imagées à deux moments précis.

Tout d’abord, nous acquérons des images immédiatement après l’ajout des cellules effectrices aux cellules cibles, et la deuxième série d’images est prise trois heures après l’ajout de cellules NK. Tout d’abord, sélectionnez le type de microplaque. Utilisez des plaques de criblage à haute teneur de 96 puits.

Sélectionnez le choix de la mise au point car le test est effectué dans des plaques avec un objectif 10x en mode non confocale. Choisissez binning two pour doubler le rapport signal/bruit. Sélectionnez les canaux, le temps d’exposition, la puissance laser, le plan de mise au point et la longueur d’onde appropriés.

Prenez les images en fond clair à 650-760 nanomètres et détectez les cellules JIMT-1 transduites par EGFP avec une excitation de 488 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 500-550 nanomètres. Avant de commencer la mesure, prenez des échantillons d’images avec la fonction d’instantané afin de vérifier les paramètres corrects. Enfin, définissez le nombre de champs et le nombre de points temporels pour l’imagerie.

Choisissez, par exemple, neuf champs et deux points de temps. Pour analyser l’efficacité de l’ADCC, comptez bien les cellules JIMT-1 viables dans l’ADCC témoin. Utilisez le module cellules fines pour détecter les régions de l’image qui correspondent aux cellules.

Détectez chaque cellule comme une région de l’image qui a une intensité de fluorescence supérieure à celle de son environnement. Sélectionnez les cellules à l’aide de l’algorithme M intégré avec 80 micromètres de diamètre. Définissez le paramètre de sensibilité de fractionnement, qui répartit un objet volumineux en objets plus petits, sur la valeur 0,5.

Ajustez le seuil commun, qui est le niveau d’intensité de pixels le plus bas, à zéro. Exclure la détection de la zone de fond avec une intensité de fluorescence EGFP élevée en deux étapes. Tout d’abord, appliquez la fonction de calcul des propriétés d’intensité pour déterminer l’intensité de fluorescence EGFP dans la région des cellules précédemment sélectionnée.

Ensuite, définissez un seuil d’intensité minimale et maximale en utilisant l’option de sélection de population, de sorte que nous obtenions le nombre de cellules cibles JIMT-1 GFP viables à la fin de l’ADCC. Calculez l’efficacité de l’ADCC en divisant le nombre de cellules détectées après trois heures par le nombre de cellules détectées à l’instant zéro. Nous aimerions démontrer l’application pratique de notre méthode avec des résultats représentatifs.

Nous avons mis en place une plaque d’essai avec 16 composés retirés aléatoirement des étagères. Nous avons également inclus trois composés, la colchicine, la vincristine et la podophyllotoxine avec un effet inhibiteur attendu de l’ADCC. Le DMSO a été utilisé comme témoin négatif.

Chaque médicament a été utilisé en quatre répétitions sur la plaque. La figure montre le résultat de l’écran de test. Dans le groupe moins NK, la toxicité des médicaments sur les cellules JIMT-1 a été testée.

Dans le groupe plus NK, des cellules NK et du trastuzumab ont été ajoutés, ce qui a provoqué une cytotoxicité d’environ 50%. L’effet inhibiteur attendu de l’ADCC des trois composés d’essai a pu être détecté avec le test. Nous avons mis en place un système de test de co-culture modélisant l’interaction cliniquement pertinente entre les cellules cancéreuses du sein, les cellules NK et l’anticorps monoclonal thérapeutique trastuzumab.

Le test est basé sur la microscopie automatisée combinée à l’analyse d’images et convient au criblage de banques de composés chimiques afin d’identifier les médicaments modifiant l’ADCC. La procédure peut potentiellement être utilisée pour identifier des molécules adjuvantes qui potentialisent une réponse antitumorale ou pour identifier des produits chimiques ayant un effet indésirable.