Name: PROCÉDÉ D’ISOLEMENT DE CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES À LONG ET À COURT TERME (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Découvrez le protocole d'isolement des cellules souches hématopoïétiques à long et court terme utilisant le système rapporteur Hoxb5. Cette méthode par cytométrie en flux permet d'étudier les mécanismes de renouvellement cellulaire et la hétérogénéité du compartiment CSH chez la souris.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Hiroshi Kiyonari pour les soins aux animaux et pour avoir fourni des souris receveuses à RIKEN BDR, ainsi que Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka et Masaki Miyahashi pour la gestion du laboratoire à l’Université de Kobe. Les auteurs apprécient également grandement le soutien continu apporté à ce travail. Masanori Miyanishi a été soutenu par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) Numéros de subvention KAKENHI JP17K07407 et JP20H03268, la Fondation Mochida Memorial pour la recherche médicale et pharmaceutique, la Fondation des sciences de la vie du Japon, la Fondation scientifique Takeda, la Fondation Astellas pour la recherche sur les troubles métaboliques et AMED-PRIME, AMED sous le numéro de subvention JP18gm6110020. Taro Sakamaki est soutenu par les numéros de subvention JP21K20669 et JP22K16334 de JSPS KAKENHI et a été soutenu par le programme de base à noyau JSPS et le programme d’associé de recherche junior RIKEN. Katsuyuki Nishi a été soutenu par JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.
1. Préconditionnement des souris receveuses
<ol><li>Préparer les souris congéniques C57BL/6 mâles âgées de 8 à 10 semaines comme souris receveuses. Le nombre de souris receveuses dépend du protocole expérimental. Nous préparons généralement 10 à 20 souris pour chaque condition.<ol><li>Nourrissez les souris avec de l’eau stérilisée additionnée d’enrofloxacine (170 mg/L). Comme les souris receveuses irradiées sont très sensibles à l’infection, gardez les cages aussi propres que possible. REMARQUE: La supplémentation en antibiotiques commence 24 heures avant l’irradiation et se poursuit pendant 3 semaines après la transplantation pour éviter les infections.</li>
	</ol></li>
	<li>Irradiation corporelle totale<ol><li>L’irradiation corporelle totale détruit les cellules de moelle osseuse receveuses pour assurer la greffe des cellules donneuses. Transférer les souris receveuses dans une cage d’irradiation. Irradier mortellement les souris receveuses avec une dose unique de 8,7 Gy à 12-16 h avant la transplantation. REMARQUE : La dose de rayonnement et le temps peuvent varier selon l’équipement. La dose de rayonnement létale doit être confirmée par l’irradiateur et la souche de souris du chercheur.</li>
		<li>Remettez-les dans leurs cages après l’irradiation corporelle totale.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Prélèvement des cellules de moelle osseuse du donneur
<ol><li>Préparer une souris Hoxb5-tri-mCherry mâle âgée de 12 semaines et euthanasier la souris par exposition au CO2 suivie d’une luxation cervicale ou en utilisant des méthodes approuvées par le comité local d’éthique animale. Remarque : Le volume de réactif par souris est décrit dans les étapes suivantes.</li>
	<li>Dans des conditions stériles, retirez la peau et exposez les os (fémur, tibia, bassin, humérus). Coupez les principaux muscles et prenez les os (fémur, tibia, bassin, humérus) de la souris. Placez-les dans des boîtes de culture cellulaire stériles avec du PBS glacé sans Ca 2+ et Mg2+.</li>
	<li>Coupez les muscles et les tissus fibreux des os à l’aide d’une pince à épiler, de petits ciseaux et de lingettes pour éviter la contamination. Veillez à ne pas casser les os lors de cette étape. Jetez tous les os cassés afin de maintenir la stérilité.</li>
	<li>Stérilisez un mortier et un pilon avec de l’éthanol à 70% (EtOH) et laissez-les sécher complètement. Équilibrer avec un tampon de coloration cellulaire (PBS libre de Ca 2+ et Mg2+ complété par 2% de FBS inactivé par la chaleur, 2 mM d’EDTA, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine).</li>
	<li>Mettez les os dans le mortier et ajoutez 3 mL de tampon de coloration cellulaire. Écrasez les os avec le pilon. Désagrégez les amas de cellules par pipetage doux et transférez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 100 μm dans un tube de 50 mL.</li>
	<li>Répétez l’étape 2.5 jusqu’à ce que la solution devienne claire. Habituellement, trois fois suffisent.</li>
</ol>3. Séparation des cellules c-kit+ par tri magnétique
<ol><li>Coloration d’anticorps pour le tri magnétique<ol><li>Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de coloration cellulaire. Ajouter 10 μL d’IgG de rat (5 mg/mL) pour réduire la liaison aux anticorps non spécifiques, et pipeter doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette P1 000. Incuber sur la glace pendant 15 min.</li>
		<li>Ajouter l’anticorps c-Kit (clone 2B8) à une concentration de 4 μg/mL et mélanger avec une pipette P1 000. Incuber sur la glace pendant 15 min.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de tampon de coloration cellulaire et bien mélanger. Centrifuger les échantillons à 400 x g, 4 °C, 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de tampon de coloration cellulaire.</li>
		<li>Ajouter 35 μL de microbilles anti-APC pour enrichir les cellules c-Kit+ et mélanger avec une pipette P1,000. Incuber sur la glace pendant 15 min.</li>
		<li>Ajouter 4-5 mL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de coloration cellulaire.</li>
	</ol></li>
	<li>Tri magnétique des cellules c-Kit+<ol><li>Suivez les instructions du fabricant pour trier les cellules. En bref, amorcez une colonne de tri magnétique avec 3 mL de tampon de coloration cellulaire. Filtrer l’échantillon (1 mL) à travers une passoire à cellules de 40 μm et charger l’échantillon sur la colonne de tri magnétique.</li>
		<li>Laver en ajoutant trois fois 3 ml de tampon de coloration cellulaire. Ajoutez le tampon de coloration de cellule uniquement lorsque le réservoir de colonne est vide.</li>
		<li>Placez la colonne de tri magnétique sur un tube glacé de 15 ml et ajoutez 5 ml de tampon de coloration cellulaire. Rincez les cellules en poussant fermement le piston dans la colonne. Gardez le flux sur la glace. REMARQUE: En cas de perte accidentelle de l’échantillon, nous conservons le flux jusqu’à la fin de l’expérience.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Coloration des cellules souches hématopoïétiques
<ol><li>Centrifuger l’échantillon préparé à l’étape 3.2.3 à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter l’anticorps CD34 (clone RAM34) à une concentration de 50 μg/mL à la pastille et incuber sur de la glace pendant 60 min. NOTE: La préparation des cellules de support pendant la première heure d’incubation avec CD34 est recommandée pour raccourcir le temps de traitement.</li>
	<li>Préparer le mélange principal d’anticorps conformément au tableau 1. Ajouter 100 μL du mélange principal à l’échantillon et incuber sur de la glace pendant 30 minutes. L’anticorps de l’antigène CD34 (clone; RAM34) nécessite 90 min pour une coloration suffisante.</li>
	<li>Ajouter 4-5 mL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger l’échantillon à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Ajouter la streptavidine-BUV737 à une concentration de 3 μg/mL à la pastille et incuber sur de la glace pendant 30 min.</li>
	<li>Ajouter 4-5 mL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger l’échantillon à 400 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 400 μL de tampon de coloration cellulaire. Conservez l’échantillon sur la glace.</li>
</ol>5. Préparation des cellules de soutien
<ol><li>Préparer une souris congénique CD45.1+ CD45.2+ âgée de 12 semaines; Idéalement, cela devrait avoir le même âge que la souris donneuse. Euthanasier la souris par exposition au CO2 suivie d’une luxation cervicale ou en utilisant des méthodes approuvées par le comité local d’éthique animale. REMARQUE : Dans l’exemple fourni, des souris congéniques CD45.1+ CD45.2+ ont été élevées en interne par croisement B6. Souris congéniques CD45.1 avec souris C57BL/6J16.</li>
	<li>Dans des conditions stériles, prenez à la fois des fémurs et des tibias, et placez-les dans des boîtes de culture cellulaire stériles avec du PBS glacé sans Ca 2+ et Mg2+. Coupez les muscles et les tissus fibreux des os à l’aide d’une pince à épiler et de petits ciseaux.</li>
	<li>Coupez les deux extrémités des os avec des ciseaux tranchants et stériles. Utilisez une aiguille de 23 G et une seringue de 5 mL remplie d’un tampon de suspension cellulaire glacé (PBS sans Ca 2+ et Mg2+ complété par du FBS inactivé à 2 %, de la pénicilline 100 U/mL et de la streptomycine à 100 μg/mL) pour rincer la moelle osseuse dans une boîte de culture cellulaire stérile avec tampon de suspension cellulaire. Désagrégez les amas de cellules par pipetage doux.</li>
	<li>Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine à cellules de 40 μm à l’aide d’une pipette P1 000. Compter le numéro cellulaire de la suspension cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et préparer une suspension cellulaire de moelle osseuse contenant 1 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Transférer 200 μL de la suspension cellulaire de moelle osseuse (2 x 105 cellules) dans une plaque à fond rond à 96 puits. Conserver sur la glace jusqu’à utilisation. REMARQUE: Les plaques à fond rond sont recommandées pour faciliter la collecte des cellules.</li>
</ol>6. Tri Hoxb5pos ou Hoxb5neg pHSC
<ol><li>Configuration du point de contrôle<ol><li>Transférer 400 μL de l’échantillon préparé à l’étape 4.5 dans un tube à essai en polystyrène à fond rond muni d’un capuchon à pression de crépine cellulaire de 35 μm. Préparer le réactif de coloration des cellules mortes et l’ajouter à l’échantillon avant l’analyse conformément aux instructions du fabricant.</li>
		<li>Allumez un flowcytomètre et démarrez le logiciel d’analyse conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, appuyez sur Charger et acquérez les données. REMARQUE: Un cytomètre en flux équipé de cinq lasers et d’une buse de 70 μm est recommandé pour améliorer la pureté des cellules triées.</li>
		<li>Après avoir exclu les doublets, les cellules mortes et les cellules de lignée positive, la fraction Lineage−c-Kit+Sca-1+. Ensuite, sortez la fraction Flk2+. Ensuite, grille Hoxb5pos ou Hoxb5neg pHSCs dans la fraction CD150+CD34−/faible (Figure 2). Effectuer une compensation pour le chevauchement spectral dans la première expérience. REMARQUE: Les cellules Hoxb5 positives devraient représenter 20% à 25% de la fraction Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/faibleFlk2−.</li>
	</ol></li>
	<li>Hoxb5pos ou Hoxb5neg pHSC tri<ol><li>Préparez un tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 mL contenant 600 μL de PBS sans Ca 2+ et Mg2+ complété par 10 % de FBS inactivé par la chaleur.</li>
		<li>Placez le tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 mL sur un dispositif de collecte de tri et triez lesCSPp Hoxb5 pos ou Hoxb5neg dans le tube de 1,5 mL en utilisant la stratégie de contrôle définie à l’étape 6.1.3. Dans le premier tri, utilisez le rendement du mode de précision de tri.</li>
		<li>Placer la plaque à 96 puits avec les cellules de support préparées à l’étape 5.5 sur l’étape de l’unité de dépôt de cellules automatisées (ACDU). Placer le tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 mL préparé à l’étape 6.2.2 sur l’orifice de chargement d’un cytomètre en flux.</li>
		<li>Triez lespoints de vente Hoxb5 ou Hoxb5neg pHSC dans une plaque de 96 puits avec les cellules de support en utilisant la stratégie de contrôle définie à l’étape 6.1.3. Triez 10Hoxb5 pos ou Hoxb5neg pHSC pour tester leurs capacités d’auto-renouvellement. NOTE: Un double tri est recommandé pour améliorer la pureté. Dans le deuxième tri, utilisez la pureté comme mode de précision de tri recommandé.</li>
		<li>En règle générale, 500 à 1 000 CSp Hoxb5pos et 1 500 à 4 000 HCp Neg5 sont récoltés après double tri. Procéder aux procédures de transplantation dès que possible après le tri HSC pour améliorer la viabilité cellulaire (idéalement dans les 1-2 heures).</li>
	</ol></li>
</ol>7. Transplantation
<ol><li>Déposer sur de la glace la plaque de 96 puits triée au CSH préparée à l’étape 6.2.4. Manipulez la plaque de 96 puits triée par HSC dans des conditions stériles, idéalement dans une hotte cellulaire.</li>
	<li>Anesthésier une souris receveuse avec de l’isoflurane à 2% dans une chambre d’induction d’anesthésie gazeuse. Une fois que l’animal est complètement anesthésié, retirez-le et placez-le sur le côté. Pour assurer une anesthésie suffisante, confirmez l’absence de mouvement en réponse à un stimulus nocif.</li>
	<li>Après la confirmation de l’anesthésie appropriée, effectuez une injection rétro-orbitaire dès que possible pour empêcher la souris de reprendre conscience. L’injection rétro-orbitale prend moins de 30 s. REMARQUE: Comme le temps d’injection est court, nous terminons la procédure sans appliquer de pommade ophtalmique dans les yeux. Cependant, si la procédure prend plus de temps, nous recommandons l’utilisation d’une pommade ophtalmique.</li>
	<li>Pipeter doucement les cellules dans la plaque de 96 puits triée HSC pour les mélanger. Prélever les cellules donneuses dans la plaque de tri à l’aide d’une seringue à insuline de 30 G et les injecter dans le plexus veineux rétro-orbitaire des souris receveuses. Le volume injectable recommandé est de ≤200 μL.</li>
	<li>Observez jusqu’à ce que les souris soient conscientes et se déplacent dans une cage propre. Remettez-les dans leurs cages après avoir confirmé leur rétablissement.</li>
</ol>8. Analyse du sang périphérique
<ol><li>Prélever 50 μL de sang périphérique dans la veine de la queue et le remettre en suspension avec 100 μL de PBS sans Ca 2+- et Mg2+ avec 2 mM d’EDTA. Transférer tous les échantillons dans une plaque de 96 puits. Centrifuger à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de tampon de lyse des globules rouges et incuber sur de la glace pendant 3 min. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant. Répétez une fois de plus.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant.</li>
	<li>Préparer le mélange principal d’anticorps conformément au tableau 2. Ajouter 50 μL de mélange principal d’anticorps et incuber sur de la glace pendant 30 minutes.</li>
	<li>Ajouter 150 μL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de tampon de coloration cellulaire. Centrifuger les échantillons à 400 x g et 4 °C pendant 5 min, et jeter le surnageant. Remettez en suspension dans 200 μL de tampon de coloration cellulaire et ajoutez le réactif de coloration des cellules mortes avant l’analyse conformément aux instructions du fabricant.</li>
	<li>Analyser le chimérisme du sang périphérique à l’aide d’un cytomètre en flux comme décrit précédemment16. Prélever du sang à 4 semaines, 8 semaines, 12 semaines et 16 semaines après la transplantation pour suivre la reconstitution multi-lignée. Des diagrammes de cytométrie en flux représentatifs sont fournis à la figure 3.</li>
</ol>

<ol><li>Weissman, I. L., Shizuru, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+the+identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells%2C+and+their+capability+to+induce+donor-specific+transplantation+tolerance+and+treat+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases.</a> Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).</li>
<li>Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hierarchy+of+multipotent+hematopoietic+progenitors+in+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).</li>
<li>Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+mouse+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells.</a> Science. 241 (4861), 58-62 (1988).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li>
<li>Ikuta, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+hematopoietic+stem+cells+express+mouse+c-kit+but+do+not+depend+on+steel+factor+for+their+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li>
<li>Christensen, J. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flk-2+is+a+marker+in+hematopoietic+stem+cell+differentiation%3A+A+simple+method+to+isolate+long-term+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Morrison, S. J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-term+repopulating+subset+of+hematopoietic+stem+cells+is+deterministic+and+isolatable+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype.</a> Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).</li>
<li>Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+repopulation+of+irradiated+mice+with+limiting+numbers+of+purified+hematopoietic+stem+cells%3A+In+vivo+expansion+of+stem+cell+phenotype+but+not+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function.</a> Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).</li>
<li>Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+reveals+multiple+functional+defects+of+aged+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).</li>
<li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+molecular+and+functional+platelet+bias+of+aged+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells.</a> Nature Communications. 7, 11075(2016).</li>
<li>Kataoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evi1+is+essential+for+hematopoietic+stem+cell+self-renewal%2C+and+its+expression+marks+hematopoietic+cells+with+long-term+multilineage+repopulating+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).</li>
<li>Gazit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgd5+identifies+hematopoietic+stem+cells+in+the+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).</li>
<li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+imaging+of+bone+marrow+shows+non-dividing+stem+cells+are+mainly+perisinusoidal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal.</a> Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).</li>
<li>Chen, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hoxb5+marks+long-term+haematopoietic+stem+cells+and+reveals+a+homogenous+perivascular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche.</a> Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).</li>
<li>Ema, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+self-renewal+capacity+in+single+hematopoietic+stem+cells+from+normal+and+Lnk-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice.</a> Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).</li>
<li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).</li>
<li>Yamamoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+unveils+self-renewing+lineage-restricted+progenitors+generated+directly+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells.</a> Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).</li>
<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+CD11A+on+hematopoietic+stem+cells+denotes+the+loss+of+long-term+reconstitution+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%3A+Subtypes%2C+not+unpredictable+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).</li>
<li>Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+heterogeneity%3A+Implications+for+aging+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine.</a> Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+Providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).</li>
<li>Nishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+minimum+requirements+for+successful+haematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation.</a> British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).</li>
<li>Sakamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hoxb5+defines+the+heterogeneity+of+self-renewal+capacity+in+the+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts associé à cette étude.

Traditionnellement, les CSH définies par marqueurs de surface cellulaire ont été préparées pour étudier les fonctions des CSH, telles que la capacité d’auto-renouvellement et la multipuissance 19,20,21. Cependant, la fraction de CSH définie immunophénotypiquement (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) contient deux populations distinctes de CSH : les...

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH), qui possèdent une capacité d’auto-renouvellement et de multipotence, résident au sommet de la hiérarchie hématopoïétique 1,2. En 1988, Weissman et ses collègues ont démontré pour la première fois que l’isolement des CSH de souris pouvait être réalisé en utilisant la cytométriede flux 3. Par la suite, une fraction définie par une combinaison de marqueurs de surface cellulaire, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, a été signalée comme contenant toutes les CSH chez les souris 4,5,6,7,8.
Les CSH définies immunophénotypiquement (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) (ci-après, les CSHp) étaient auparavant considérées comme fonctionnellement homogènes. Cependant, des analyses récentes sur une seule cellule ont révélé que les CSHp présentent toujours une hétérogénéité en ce qui concerne leur capacité d’auto-renouvellement 9,10 et leur multipotence11,12. Plus précisément, deux populations semblent exister dans la fraction des CSHp en ce qui concerne leur capacité d’auto-renouvellement : les cellules souches hématopoïétiques à long terme (CSH-LT), qui ont une capacité d’auto-renouvellement continue, et les cellules souches hématopoïétiques à court terme (CSS-ST), qui ont une capacité d’auto-renouvellement transitoire 9,10.
À ce jour, les mécanismes moléculaires de la capacité d’auto-renouvellement qui distinguent les CSL-LT et les CST-ST restent mal compris. Il est crucial d’isoler les deux populations cellulaires en fonction de leurs capacités d’auto-renouvellement et de découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents. Plusieurs systèmes rapporteurs ont également été introduits pour purifier les LT-HSC13,14,15; cependant, la pureté LT-HSC définie par chaque système rapporteur est variable, et la purification exclusive LT-HSC n’a pas été atteinte à ce jour.
Par conséquent, le développement d’un système d’isolation pour les CSL-LT et les CSS-ST accélérera la recherche sur la capacité d’auto-renouvellement dans la fraction des CSHp. Dans l’isolement des CSH-LT et des CSS-ST, une étude utilisant un criblage non biaisé en plusieurs étapes a identifié un seul gène, Hoxb5, qui est exprimé de manière hétérogène dans la fraction16 des CSp. De plus, l’analyse de la moelle osseuse des souris rapporteures Hoxb5 a révélé qu’environ 20% à 25% de la fraction pHSC est constituée de cellulesPos Hoxb5. Un test de transplantation compétitif utilisant des CSp Hoxb5 pos et des CSp négatives Hoxb5 a révélé que seuls les CSp Hoxb5 pos possèdent une capacité d’auto-renouvellement à long terme, tandis que les CSPp Hoxb5neg perdent leur capacité d’auto-renouvellement en peu de temps, ce qui indique que Hoxb5 identifie les CSH-LT dans la fraction16 des CSPp. 
Ici, nous démontrons un protocole étape par étape pour isoler les LT-HSC et les ST-HSC à l’aide du système de rapporteur Hoxb5 . De plus, nous présentons un test de transplantation compétitif pour évaluer la capacité d’auto-renouvellement des CSp Hoxb5pos/neg (Figure 1). Ce système de rapporteur Hoxb5 nous permet d’isoler de manière prospective les LT-HSC et les ST-HSC et contribue à la compréhension des caractéristiques spécifiques aux LT-HSC.

<table><tbody><tr><td>Bande de 0,2 mL de 8 tubes, capuchon dôme</td><td>SSIbio</td><td>3230-00</td><td></td></tr><tr><td>0,5M EDTA pH 8,0</td><td>Iinvtrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro ; m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30G seringue à insuline</td><td>BD</td><td>326668</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro ; m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr> 5 <tr><td>mL Tube à essai en polystyrène à fond rond, avec capuchon à pression pour crépine</td><td>cellulaire FALCON</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD Solution de coloration de viabilité</td><td>BioLegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>96 puits U-Bottom</td><td>FALCON</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC-MicroBeads</td><td>Milteny biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Aspirateur avec piège flacon</td><td>Biosan</td><td>FTA-1</td><td></td></tr><tr><td>B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103232</td><td></td></tr><tr><td>B220-Biotine (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>B220-BV786 (RA3-6B2)</td><td>BD Biosciences</td><td>563894</td><td></td></tr><tr><td>B6. Souris congéniques CD45.1</td><td>Sankyo Labo Service</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 10 %</td><td>Système</td><td></td> de commande spéciale BAYER 341106546 <td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II&nbsp ;</td><td>BD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de coloration brillant</td><td>BD</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101222</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Biotine (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BUV395 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563553</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV711 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563168</td><td></td></tr><tr><td>CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)</td><td>Invitrogen</td><td>56-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-BV421 (TC15-12F12.2)</td><td>BioLegend</td><td>115943</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)</td><td>Invitrogen</td><td>56-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>560230</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC (RAM34)</td><td>Invitrogen</td><td>11034185</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100216</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon ; -Biotine (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100304</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon ; -BV421 (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1/CD45.2 souris congéniques</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>élevées dans notre laboratoire</td></tr><tr><td>CD45.1-FITC (A20)</td><td>BD Biosciences</td><td>553775</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE (104)</td><td>BD Biosciences</td><td>560695</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100430</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Biotine (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100730</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Biotine (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger 15ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-15</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger 50ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-50</td><td></td></tr><tr><td>c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)</td><td>Invitrogen</td><td>47117182</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-) sans Ca et Mg, liquide&nbsp ;</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46135182</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo version 10</td><td>BD Biosciences&nbsp ;</td><td></td><td></td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</tr><tr><td>Gmmacell 40 Exactor</td><td>Best theratronics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108422</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Biotine (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Hoxb5-tri-mSouris cerise (arrière-plan C57BL/6J)&nbsp ;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Elevés dans notre laboratoire</td></tr><tr><td>IgG à partir de sérum de rat, qualité technique, >=80 % (SDS-PAGE), solution aqueuse tamponnée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8015-100MG</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Pfizer</td><td>4987-114-13340-3&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes S200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA&nbsp ;</td><td>6-6689-01</td><td></td></tr><tr><td>LS Colonnes</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse&nbsp ;</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>MACS&nbsp ; MultiStand</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque pour la culture tissulaire (pour cellule d’adhésion) 6Well</td><td>IWAKI</td><td>3810-006</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Séparateur Milteny biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Cages à souris</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-331</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée polyvalente</td><td>TOMY</td><td>EX-125</td><td></td></tr><tr><td>NARCOBIT-E (II)</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-1071-I</td><td></td></tr><tr><td>NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)</td><td>BioLegend</td><td>108728</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine Solution Mixte</td><td>Nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Mortier en porcelaine &phi ; 120mm avec pilon</td><td>Asone</td><td>6-549-03</td><td></td></tr><tr><td>Tube Protéiné LoBind 1,5 mL&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Sca-I-BUV395 (D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>563990</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel en acier inoxydable</td><td>FastGene</td><td>FG-B2010</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612775</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-red</td><td>Invitrogen</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>Frein de queue pour souris standard</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>TCRb-BV421 (H57-597)</td><td>BioLegend</td><td>109230</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116220</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Biotine (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Terumo 5ml Seringue concentrique Luer-Slip</td><td>TERUMO</td><td>SS-05LZ</td><td></td></tr><tr><td>Terumo Aiguille Hypodermique 23G x 1</td><td>TERUMO</td><td>NN-2325-R</td><td></td></tr></tbody></table>

procÉdÉ d’isolement de cellules souches hÉmatopoÏÉtiques À long et À court terme

Isolation Method for Long-Term and Short-Term Hematopoietic Stem Cells

La capacité d’auto-renouvellement et le potentiel de différenciation multi-lignée sont généralement considérés comme les caractéristiques déterminantes des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Cependant, de nombreuses études ont suggéré qu’une hétérogénéité fonctionnelle existe dans le compartiment HSC. Des analyses récentes de cellules uniques ont rapporté des clones de CSH avec des destins cellulaires différents dans le compartiment des CSH, appelés clones de CSH biaisés. Les mécanismes sous-jacents aux résultats hétérogènes ou peu reproductibles sont peu compris, notamment en ce qui concerne la durée de l’auto-renouvellement lorsque des fractions de CSH purifiées sont transplantées par immunomarquage classique. Par conséquent, l’établissement d’une méthode d’isolation reproductible pour les CSH à long terme (CSH-LT) et les CSH à court terme (CSS-ST), définies par la durée de leur auto-renouvellement, est crucial pour surmonter ce problème. En utilisant un dépistage non biaisé en plusieurs étapes, nous avons identifié un facteur de transcription, Hoxb5, qui pourrait être un marqueur exclusif des CSL-LT dans le système hématopoïétique de la souris. Sur la base de cette découverte, nous avons établi une lignée de souris rapporteures Hoxb5 et isolé avec succès les LT-HSC et les ST-HSC. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’isolation des LT-HSC et des ST-HSC à l’aide du système de rapporteur Hoxb5 . Cette méthode d’isolement aidera les chercheurs à mieux comprendre les mécanismes d’auto-renouvellement et la base biologique d’une telle hétérogénéité dans le compartiment HSC.

Auparavant, la capacité d’auto-renouvellement était mesurée à l’aide de tests de transplantation compétitifs, dans lesquels on pensait que les CSH du donneur ne conservaient leur capacité d’auto-renouvellement que si des cellules de donneurs multi-lignées dans le sang périphérique du receveur sont observées17. De plus, plusieurs rapports définissent les CSH-LT comme des cellules qui continuent à produire des cellules sanguines périphériques plusieurs mois après la deuxième greffe de moelle osseuse...

Nous présentons un protocole étape par étape pour l’isolement des cellules souches hématopoïétiques à long terme (LT-HSC) et des CSH à court terme (ST-HSC) à l’aide du système rapporteur Hoxb5.

PROCÉDÉ D’ISOLEMENT DE CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES À LONG ET À COURT TERME

Self-renewal capacity and multi-lineage differentiation potential are generally regarded as the defining characteristics of hematopoietic stem cells ...

La méthode d’isolement des cellules souches hématopoïétiques à long et à court terme ou des CSH aidera les chercheurs à mieux comprendre les mécanismes de renouvellement cellulaire et la base biologique de l’hétérogénéité dans le compartiment des CSH. Un facteur de transcription, Hoxb5, qui peut être un marqueur exclusif des CSH à long terme, a été identifié. Sur cette base, une lignée de souris rapporteures Hoxb5 a été établie et les CSH à long terme et à court terme ont été isolées avec succès.Pour commencer la collecte des cellules de moelle osseuse du donneur, stérilisez un mortier et un pilon avec de l’éthanol à 70% et laissez-les sécher complètement. Équilibrez ceux qui ont un tampon de coloration cellulaire composé de suppléments de PBS sans calcium et sans magnésium. Mettez les os isolés de la souris mâle donneuse Hoxb5-tri-mCherry dans le mortier et ajoutez trois millilitres du tampon de coloration cellulaire.Brossez les os avec le pilon, puis désagrégez les amas de cellules par pipetage doux et transférez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 100 microns dans un tube de 50 millilitres. Répétez le processus avec un tampon de coloration cellulaire frais jusqu’à ce que la solution devienne claire. Habituellement, répéter trois fois suffit pour obtenir une solution claire.Après avoir isolé les fémurs et les tibias de la souris congénique CD45.1.2, couper les deux extrémités des os avec des ciseaux stériles tranchants. À l’aide d’une aiguille de calibre 23 munie d’une seringue de cinq millilitres remplie d’un tampon de suspension cellulaire glacé, rincer la moelle osseuse dans une boîte de culture cellulaire stérile contenant un tampon de suspension cellulaire. Désagrégez les amas de cellules par pipetage doux, puis filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 40 microns à l’aide d’une pipette P1000.Pour la configuration du déclenchement, préparez l’échantillon en suivant les instructions fournies dans le texte et transférez-en 400 microlitres dans un tube à essai en polystyrène à fond rond avec un capuchon de crépine de 35 microns. Préparer et ajouter un réactif de contrainte des cellules mortes à l’échantillon avant l’analyse, en suivant les instructions du fabricant. Ensuite, allumez le cytomètre en flux et lancez le logiciel d’analyse en suivant les instructions du fabricant.Ensuite, appuyez sur Charger pour commencer à acquérir les données. Après avoir exclu les doublets, les cellules mortes et les cellules de lignée positive, la fraction positive de la lignée négative, la fraction positive c-kit, Sca-1-positive. Ensuite, sortez la fraction positive Flk2.Ensuite, les CSPp Hoxb5-positives ou Hoxb5-négatives dans la fraction CD150-positive, CD34-négative ou faible. Ensuite, préparez un tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 millimètre avec 600 microlitres de PBS sans calcium et magnésium, complété par 10% de FBS inactivé par la chaleur. Pour effectuer le tri pHSC Hoxb5-positif ou Hoxb5-négatif, placez le tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 millilitre préparé sur un dispositif de collecte de tri et triez les pHSC Hoxb5-positifs ou Hoxb5-négatifs dans le tube en utilisant la stratégie de gating mentionnée précédemment.Dans le premier tri, utilisez le rendement du mode de précision de tri. Placez la plaque à 96 puits avec les cellules de support préalablement préparées sur l’étage unitaire de dépôt automatisé de cellules. Ensuite, réglez le tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 millilitre sur le port de chargement du cytomètre en flux.Triez les CSPp Hoxb5-positives ou Hoxb5-négatives dans la plaque à 96 puits avec les cellules de support en utilisant la stratégie de gating mentionnée précédemment. Trier 10 CSPp Hoxb5-positives ou Hoxb5-négatives pour tester leurs capacités d’auto-renouvellement. Les diagrammes de cytométrie en flux de l’analyse de la moelle osseuse des souris donneuses Hoxb5-tri-mCherry ont révélé environ 20 à 25% des cellules de la fraction pHSC définie par lignée négative, c-kit-positive, Sca-1-positive, CD150-positive, CD34-négative ou faible, Flk2-négatif étaient des pHSCp Hoxb5-positifs.Voici les diagrammes de cytométrie en flux représentatifs de l’analyse du sang périphérique des souris receveuses. De plus, l’analyse du sang périphérique des souris receveuses après la primotransplantation a révélé que, bien que les CSPp Hoxb5 positives et Hoxb5 négatives présentaient un chimérisme de donneur similaire quatre semaines après la transplantation, une hématopoïèse continue n’a été observée que chez les receveurs de CSPp Hoxb5 positifs. Les CSH Hoxb5 négatives ont commencé à perdre la capacité de produire des cellules hématopoïétiques huit semaines après la transplantation.Dans l’analyse de transplantation secondaire, seuls les receveurs de CSPp Hoxb5-positifs présentaient une hématopoïèse robuste. En revanche, les cellules de donneurs ont été à peine observées chez les souris receveuses de CSPp Hoxb5 négatives, ce qui suggère que les CSPp Hoxb5 négatives ont perdu leur capacité d’auto-renouvellement dans les 16 semaines suivant la transplantation primaire. Ce protocole prend habituellement de neuf à 12 heures, il est donc important de maintenir l’échantillon à quatre degrés Celsius tout au long des procédures autant que possible pour maintenir la viabilité cellulaire.

isolation-method-for-long-term-and-short-term-hematopoietic-stem-cells

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

L&#39;isolement et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH)

Cette vidéo montre comment les micro-dissection du sac vitellin et l'aorte-gonades-mésonéphros région à partir d'embryons et l'utilisation de cytométrie en flux à trier les cellules souches hématopoïétiques.

L&#39;isolement des premiers cellules souches hématopoïétiques de murin sac vitellin et AGA

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo</emÉrythropoïèse> des cellules souches hématopoïétiques humaines

Nous décrivons ici l'isolement des cellules souches CD133 exprimer foie et les cellules souches du cancer du foie murin ensemble, un processus qui nécessite la digestion des tissus, l'enrichissement des cellules, et l'isolement de cytométrie en flux. Nous incluent des méthodes pour l'isolement cellulaire de pointe unique et l'expansion clonale.

Isolement des cellules CD133 + Foie souches pour l&#39;expansion clonale

Une méthode pour analyser la distribution des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse par cytométrie en flux ainsi que d'isoler efficacement hautement purifiées de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est décrite. La procédure d'isolement est essentiellement basée sur l'enrichissement magnétique des cellules + c-kit et de tri cellulaire pour purifier CSH pour des études cellulaires et moléculaires.

Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

Cette vidéo présente une technique de génération de souris du système immunitaire humain (HIS). Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) CD34+ sont isolées à partir de cellules leucocytaires du sang de cordon ombilical humain à l’aide de billes magnétiques recouvertes d’anticorps. Les CSH CD34+ sont développées dans un milieu de croissance enrichi en cytokines et cryoconservées. Enfin, les CSH décongelées sont injectées dans un chiot de souris immunodéficient pour établir le modèle de souris...

Isolement de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon ombilical pour générer des souris du système immunitaire humain

Ce protocole permet le maintien des cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes in vitro en imitant le microenvironnement de moelle en utilisant des acides gras abondants, le cholestérol, des concentrations plus faibles de cytokines, et l’hypoxie.

Une méthode de culture pour maintenir les cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes

Cette étude a permis d’établir une méthode stable et efficace pour l’isolement, la culture et la détermination fonctionnelle des cellules souches CD34+ résidentes de la paroi vasculaire (CD34+ VW-SC). Cette méthode d’isolement facile à suivre et rapide peut être utilisée par d’autres chercheurs pour étudier les mécanismes potentiels impliqués dans les maladies cardiovasculaires.

Isolement immunomagnétique des cellules souches CD34+ résidentes de la paroi vasculaire chez la souris

Nous présentons ici des protocoles qui permettent d’isoler des cellules stromales de l’os murin, de la moelle osseuse, du thymus et du tissu thymique humain compatibles avec la multiomique unicellulaire.

Isolement de cellules stromales à partir d’organes hématopoïétiques

Nous décrivons un protocole d’extraction de noyaux de haute qualité à partir de cellules souches pluripotentes induites cryopréservées, de types de cellules stromales/endothéliales et de cellules sanguines dérivées de cellules souches pluripotentes induites afin de soutenir les analyses de séquençage de nouvelle génération à noyau unique. La production de noyaux intacts de haute qualité est impérative pour les expériences multiomiques, mais peut constituer une barrière à l’entrée sur le terrain...

Isolement nucléaire à partir de cellules sanguines dérivées in vitro cryoconservées

Découvrez le protocole d'isolement des cellules souches hématopoïétiques à long et court terme utilisant le système rapporteur Hoxb5. Cette méthode par cytométrie en flux permet d'étudier les mécanismes de renouvellement cellulaire et la hétérogénéité du compartiment CSH chez la souris.

PROCÉDÉ D’ISOLEMENT DE CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES À LONG ET À COURT TERME

Explorer plus de vidéos