PROCÉDÉ D’ISOLEMENT DE CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES À LONG ET À COURT TERME

La méthode d’isolement des cellules souches hématopoïétiques à long et à court terme ou des CSH aidera les chercheurs à mieux comprendre les mécanismes de renouvellement cellulaire et la base biologique de l’hétérogénéité dans le compartiment des CSH. Un facteur de transcription, Hoxb5, qui peut être un marqueur exclusif des CSH à long terme, a été identifié. Sur cette base, une lignée de souris rapporteures Hoxb5 a été établie et les CSH à long terme et à court terme ont été isolées avec succès.

Pour commencer la collecte des cellules de moelle osseuse du donneur, stérilisez un mortier et un pilon avec de l’éthanol à 70% et laissez-les sécher complètement. Équilibrez ceux qui ont un tampon de coloration cellulaire composé de suppléments de PBS sans calcium et sans magnésium. Mettez les os isolés de la souris mâle donneuse Hoxb5-tri-mCherry dans le mortier et ajoutez trois millilitres du tampon de coloration cellulaire.

Brossez les os avec le pilon, puis désagrégez les amas de cellules par pipetage doux et transférez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 100 microns dans un tube de 50 millilitres. Répétez le processus avec un tampon de coloration cellulaire frais jusqu’à ce que la solution devienne claire. Habituellement, répéter trois fois suffit pour obtenir une solution claire.

Après avoir isolé les fémurs et les tibias de la souris congénique CD45.1.2, couper les deux extrémités des os avec des ciseaux stériles tranchants. À l’aide d’une aiguille de calibre 23 munie d’une seringue de cinq millilitres remplie d’un tampon de suspension cellulaire glacé, rincer la moelle osseuse dans une boîte de culture cellulaire stérile contenant un tampon de suspension cellulaire. Désagrégez les amas de cellules par pipetage doux, puis filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 40 microns à l’aide d’une pipette P1000.

Pour la configuration du déclenchement, préparez l’échantillon en suivant les instructions fournies dans le texte et transférez-en 400 microlitres dans un tube à essai en polystyrène à fond rond avec un capuchon de crépine de 35 microns. Préparer et ajouter un réactif de contrainte des cellules mortes à l’échantillon avant l’analyse, en suivant les instructions du fabricant. Ensuite, allumez le cytomètre en flux et lancez le logiciel d’analyse en suivant les instructions du fabricant.

Ensuite, appuyez sur Charger pour commencer à acquérir les données. Après avoir exclu les doublets, les cellules mortes et les cellules de lignée positive, la fraction positive de la lignée négative, la fraction positive c-kit, Sca-1-positive. Ensuite, sortez la fraction positive Flk2.

Ensuite, les CSPp Hoxb5-positives ou Hoxb5-négatives dans la fraction CD150-positive, CD34-négative ou faible. Ensuite, préparez un tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 millimètre avec 600 microlitres de PBS sans calcium et magnésium, complété par 10% de FBS inactivé par la chaleur. Pour effectuer le tri pHSC Hoxb5-positif ou Hoxb5-négatif, placez le tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 millilitre préparé sur un dispositif de collecte de tri et triez les pHSC Hoxb5-positifs ou Hoxb5-négatifs dans le tube en utilisant la stratégie de gating mentionnée précédemment.

Dans le premier tri, utilisez le rendement du mode de précision de tri. Placez la plaque à 96 puits avec les cellules de support préalablement préparées sur l’étage unitaire de dépôt automatisé de cellules. Ensuite, réglez le tube de liaison à faible teneur en protéines de 1,5 millilitre sur le port de chargement du cytomètre en flux.

Triez les CSPp Hoxb5-positives ou Hoxb5-négatives dans la plaque à 96 puits avec les cellules de support en utilisant la stratégie de gating mentionnée précédemment. Trier 10 CSPp Hoxb5-positives ou Hoxb5-négatives pour tester leurs capacités d’auto-renouvellement. Les diagrammes de cytométrie en flux de l’analyse de la moelle osseuse des souris donneuses Hoxb5-tri-mCherry ont révélé environ 20 à 25% des cellules de la fraction pHSC définie par lignée négative, c-kit-positive, Sca-1-positive, CD150-positive, CD34-négative ou faible, Flk2-négatif étaient des pHSCp Hoxb5-positifs.

Voici les diagrammes de cytométrie en flux représentatifs de l’analyse du sang périphérique des souris receveuses. De plus, l’analyse du sang périphérique des souris receveuses après la primotransplantation a révélé que, bien que les CSPp Hoxb5 positives et Hoxb5 négatives présentaient un chimérisme de donneur similaire quatre semaines après la transplantation, une hématopoïèse continue n’a été observée que chez les receveurs de CSPp Hoxb5 positifs. Les CSH Hoxb5 négatives ont commencé à perdre la capacité de produire des cellules hématopoïétiques huit semaines après la transplantation.

Dans l’analyse de transplantation secondaire, seuls les receveurs de CSPp Hoxb5-positifs présentaient une hématopoïèse robuste. En revanche, les cellules de donneurs ont été à peine observées chez les souris receveuses de CSPp Hoxb5 négatives, ce qui suggère que les CSPp Hoxb5 négatives ont perdu leur capacité d’auto-renouvellement dans les 16 semaines suivant la transplantation primaire. Ce protocole prend habituellement de neuf à 12 heures, il est donc important de maintenir l’échantillon à quatre degrés Celsius tout au long des procédures autant que possible pour maintenir la viabilité cellulaire.