Name: Greffe de semis évolutive, flexible et rentable (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Découvrez une méthode de greffe de semis simple et économique pour étudier la signalisation à longue distance chez les plantes. Cette technique accessible sans formation préalable utilise des matériaux courants de laboratoire.

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Merci à Javier Brumos pour la formation initiale et les conseils dans la greffe de plants d’Arabidopsis .

1. Préparation de l’appareil
<ol><li>Fabriquer le dispositif de greffe de silicone en coulant une solution d’élastomère de silicone dans une boîte de Petri carrée (100 mm x 100 mm). Préparer 15 mL de la solution élastomère en suivant les directives du fabricant. REMARQUE: Les kits d’élastomère de silicone comprennent généralement un liquide à base de silicone et un agent de durcissement qui, lorsqu’ils sont mélangés, permettent au silicone de se solidifier.</li>
	<li>Préparez la boîte de Petri carrée en déposant quatre morceaux droits de fil de 29 G dans la boîte de Petri carrée, équidistants les uns des autres (Figure 1A). Assurez-vous que le fil affleure le fond du moule. Pour redresser complètement le fil, roulez-le sur une surface dure et uniforme avec un objet lourd et plat (par exemple, un support de tubes métalliques). REMARQUE: Les attaches torsadées contiennent souvent un fil de 29 G et peuvent être utilisées après avoir retiré le revêtement extérieur de papier avec de l’acétone.</li>
	<li>Versez la solution d’élastomère de silicone mélangée sur les fils et couvrez avec le dessus de la boîte de Pétri. Laisser durcir le silicone pendant 24-48 h à température ambiante.</li>
	<li>Retirez la feuille de silicone de la boîte de Petri à l’aide d’une pince propre et déplacez-la sur une surface plane et propre.</li>
	<li>Retirez les fils de la feuille de silicone. Retirez la fine couche de silicone restant à l’extérieur du canal à l’aide d’une pince à pointe fine, pour permettre au canal d’être ouvert d’un côté (Figure 1A).</li>
	<li>Couper la feuille de silicone perpendiculairement aux canaux en bandes de 3 mm à l’aide de ciseaux propres. Déplacez chaque bande dans une enveloppe en papier d’aluminium et scellez-la avec du ruban autoclave.</li>
	<li>Autoclaver les bandes à 121 °C pendant au moins 30 min et conserver jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.</li>
</ol>2. Préparation des plantules
<ol><li>Stériliser et vernaliser les graines.<ol><li>Suspendre jusqu’à 100 graines d’Arabidopsis dans 1 mL de solution d’eau de Javel à 50 % contenant 0,1 % de Tween 20 dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et incuber pendant 5 à 10 minutes. Retirer la solution d’eau de Javel par pipetage ou aspiration dans des conditions stériles. Rincer les graines avec 1 mL de dH2O stérilisé. Assurez-vous d’inverser les tubes pour rincer adéquatement les graines et retirez toute solution d’eau de Javel laissée au sommet du tube. Répétez le rinçage 4x.</li>
		<li>Laisser environ 0,25 mL d’eau dans les tubes avec les graines et conserver à 4 °C pendant 3 jours dans l’obscurité.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaquer les graines en préparation pour la greffe.<ol><li>Préparer une plaque de gélose MS à 1 % comme suit : pour 1 L de milieu solide MS (0,5 % saccharose), mélanger 4,4 g de sel MS, 5 g de saccharose et 10 g de gélose dans 800 mL d’eau, ajuster le pH à 5,7 avec KOH, puis porter le volume total à 1 L avec de l’eau supplémentaire. Autoclave pendant au moins 20, min avant de verser ~25 ml dans les boîtes de Petri carrées.</li>
		<li>Dans des conditions stériles, déplacer le nombre approprié de graines préparées dans l’assiette, à l’aide d’un embout de pipette de 20 μL pour aspirer et transférer les graines.</li>
		<li>Placez une bande stérile sur la surface de la plaque pour guider le positionnement des graines, de sorte que les graines soient alignées avec les canaux sur la bande. Retirez la bande une fois les graines plaquées. REMARQUE : Une plaque carrée de 100 mm x 100 mm peut accueillir deux rangées de semis (figure 1B).</li>
		<li>Une fois que les plaques sont debout, laissez le liquide s’évaporer du milieu solide et accumulez au fond de la plaque. Une fois les graines placées sur l’assiette, placez sur le couvercle de la plaque et scellez un côté de la plaque parallèle aux deux rangées de graines (indiquées par la région surlignée en bleu à la figure 1B) avec un parafilm. Enroulez du ruban adhésif respirant sur le dessus du parafilm et autour de tous les autres bords de la plaque.</li>
	</ol></li>
	<li>Dressez soigneusement deux plaques avec le côté scellé au parafilm vers le bas. Séparez les deux plaques au fond en plaçant un tube centrifuge horizontal de 15 mL entre elles et fixez-les à l’aide d’un élastique. Assurez-vous que les surfaces de la plaque forment un angle de 100°-110° avec la surface de paillasse (Figure 1C).</li>
	<li>Conserver les plaques dans cette orientation pendant 72 h dans l’obscurité totale à 21 °C, pour permettre aux hypocotyles de la plantule de croître ~5 mm de longueur. Après 72 h, retirez les plaques de l’obscurité et poussez sous 16 h de lumière (intensité de 100 μE m-2 sec-1) et 8 h de cycles d’obscurité pendant 2-4 jours de plus à la même température avant la greffe.</li>
	<li>Greffez les plants entre 5 et 7 jours après avoir été plaqués. Placez une bande de greffe sur les plantules en insérant leurs hypocotyles dans les canaux. Positionner doucement le semis de manière à ce que la jonction racine-hypocotyle soit positionnée au bas de la bande de silicone pour préparer le semis à la coupe (figure 1D).</li>
</ol>3. Procédure de greffe
<ol><li>Préparez un environnement de travail stérile en désinfectant une lunette de dissection avec de l’éthanol à 70 % et en autoclavant deux paires de pinces à pointe fine et un manche de scalpel. Effectuer toutes les procédures de greffe dans une goulotte stérile et à l’aide d’une lunette de dissection au besoin. Effectuez la majeure partie de la greffe en utilisant un grossissement de 10,5x.</li>
	<li>Préparez les scions. Utilisez une lame de scalpel fraîche pour couper l’hypocotyle perpendiculairement afin de créer une coupe droite et nette. Poussez la lame vers l’avant plutôt que d’appuyer vers le bas dans la plante pour éviter que le semis ne soit poussé dans la gélose (vidéo 1).</li>
	<li>Retirez la pousse. Prenez soin de garder la partie coupée de la pousse hydratée en assurant le contact avec la surface du support. Vous pouvez également déplacer la pousse dans une zone d’attente désignée, telle que le dessus d’une boîte de Petri remplie de dH2O stérile, jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.</li>
	<li>Préparez les porte-greffes. Tirez doucement la racine en attrapant la racine dans l’espace laissé entre les pinces fermées et en les tournant, en laissant la section coupée des porte-greffes au milieu de la bande (vidéo 2). REMARQUE: La racine fragile sera endommagée si elle est écrasée directement entre les pinces fermées, ce qui nécessite de coincer la racine dans l’angle aigu des extrémités de la pince à épiler pour manipuler le tissu.</li>
	<li>Prenez doucement la pousse désirée à l’aide de la pince à pointe fine et insérez-la dans le haut du canal. REMARQUE : Il est essentiel de confirmer visuellement le contact entre les greffons et les porte-greffes pour obtenir une greffe réussie (vidéo 3).</li>
	<li>Une fois que toutes les greffes ont été faites, enveloppez les plaques avec du parafilm et du ruban respirant et installez les plaques de la même manière qu’auparavant, sans déranger les plants ou les bandes de silicone. Déplacez délicatement les plaques dans une chambre de croissance réglée à 26 °C avec 16 h de cycles de lumière/8 h d’obscurité.</li>
	<li>Évaluer les plants greffés dans des conditions stériles après 7 à 10 jours. Retirez délicatement la bande de silicone à l’aide d’une pince en décollant un côté, ce qui permet aux canaux de libérer les semis. Enlevez toutes les racines adventives qui poussent à partir du greffon en les coupant du greffon avec une lame de scalpel fraîche ou en les écrasant à l’aide d’une pince à pointe fine. Évaluez visuellement si le porte-greffe s’est solidement attaché au greffon pour former un greffon réussi (Figure 2).</li>
	<li>Déplacer les greffons réussis vers le sol de multiplication des semis pour qu’ils poussent aussi longtemps que nécessaire. Couvrez le sol avec du plastique transparent pendant quelques jours pendant que les semis s’établissent. Après avoir transféré les plantes dans le sol, cultivez sous les cycles de lumière et d’obscurité mentionnés précédemment à 21 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+history+of+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Horticultural+Reviews%22%5BJournal%5D)">A history of grafting.</a> Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).</li>
<li>Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+control+in+tomato+with+ABA-deficient+roots%3A+Response+of+grafted+plants+to+soil+drying%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying.</a> Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).</li>
<li>Notaguchi, M., Okamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+long-distance+signaling+via+plant+vascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 161(2015).</li>
<li>Ko, D., Helariutta, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot-root+communication+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Shoot-root communication in flowering plants.</a> Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).</li>
<li>Thomas, H. R., Frank, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+pieces%3A+uncovering+the+molecular+basis+for+long-distance+communication+through+plant+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting.</a> New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).</li>
<li>Takahashi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+peptide+modulates+stomatal+control+via+abscisic+acid+in+long-distance+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling.</a> Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).</li>
<li>Brumos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+auxin+biosynthesis+is+a+key+regulator+of+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development.</a> Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).</li>
<li>Corbesier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FT+protein+movement+contributes+to+long-distance+signaling+in+floral+induction+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis.</a> Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-union+development%3A+A+delicate+process+that+involves+cell-cell+communication+between+scion+and+stock+for+local+auxin+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).</li>
<li>Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrografting+techniques+for+testing+long-distance+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Micrografting techniques for testing long-distance signalling.</a> The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).</li>
<li>Marsch-Martínez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+flat-surface+collar-free+grafting+method+for+Arabidopsis+thaliana+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings.</a> Plant Methods. 9 (1), 14(2013).</li>
<li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrografting+device+for+testing+systemic+signaling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).</li>
<li>Xia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+mechanisms+of+long-distance+mRNA+movement+in+a+Nicotiana+benthamiana%2Ftomato+heterograft+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system.</a> Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+movement+of+small+RNAs+from+shoots+to+roots+in+interspecific+heterografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts.</a> Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).</li>
<li>Ragni, L., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+thick+enough-the+Arabidopsis+hypocotyl+as+a+model+to+study+secondary+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth.</a> Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).</li>
<li>Chen, I. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetics+approach+reveals+a+role+of+brassinolide+and+cellulose+synthase+in+hypocotyl+elongation+of+etiolated+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings.</a> Plant Science. 209, 46-57 (2013).</li>
<li>An, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+regulation+of+apical+hook+development+by+gibberellins+and+ethylene+in+etiolated+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings.</a> Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).</li>
<li>Vandenbussche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene-induced+Arabidopsis+hypocotyl+elongation+is+dependent+on+but+not+mediated+by+gibberellins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).</li>
<li>Vandenbussche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+mutant+alh1+illustrates+a+cross+talk+between+ethylene+and+auxin%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin.</a> Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).</li>
<li>Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FERONIA+is+a+key+modulator+of+brassinosteroid+and+ethylene+responsiveness+in+arabidopsis+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls.</a> Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Résumé et importance La formation d’une union de greffe est cruciale pour une greffe réussie, qui nécessite un contact direct et non perturbé entre le porte-greffe et le greffon. La taille miniature et la fragilité des semis de petites plantes telles qu’Arabidopsis rendent techniquement difficile de répondre à cette exigence. Une technique développée dans les premières méthodes de greffe de plantules d’Arabidopsis consistait à insérer à la fois le greffon et le porte-greffe dans un c...

Le greffage est une technique horticole ancienne qui est devenue une pratique agricole établie en 500 avant notre ère1. La greffe de différentes variétés de plantes cultivées pour améliorer les rendements a été la première utilisation de cette technique et continue d’être utilisée à cette fin aujourd’hui. Au cours de la dernière décennie, la greffe a attiré de plus en plus l’attention en tant qu’outil permettant aux biologistes moléculaires d’étudier la signalisation à longue distance chez les plantes 2,3,4,5. Bien que la greffe de plantes adultes soit relativement facile, il est difficile de greffer des plantes peu de temps après la germination. Malgré cela, il est parfois nécessaire d’évaluer les effets de la signalisation à longue distance dans des processus tels que le développement des plantes, les réponses environnementales et la floraison 6,7,8.
Arabidopsis thaliana a été établi comme l’organisme modèle en biologie végétale pour de nombreuses raisons, y compris sa taille relativement petite, ce qui le rend facile à cultiver à l’intérieur d’un laboratoire. Cependant, la petite taille et la fragilité des plants d’Arabidopsis rendent la greffe de jeunes plants très difficile. Dans de nombreux cas, une formation pratique approfondie est nécessaire pour réussir à obtenir des greffes de semis. Il y a eu de nombreuses améliorations méthodologiques au fil des ans qui ont permis d’identifier des conditions de croissance idéales et de nouvelles techniques pour augmenter le taux de réussite de la greffe de semis 9,10,11. L’outil le plus récent introduit était une puce de greffe de plantules Arabidopsis, qui permet même aux utilisateurs inexpérimentés d’atteindre des niveaux acceptables de réussite de greffe12. Bien que cette avancée ait considérablement abaissé la barrière technique de la greffe de semis, le dispositif de puce est coûteux et le nombre de greffes pouvant être effectuées en parallèle devient rapidement prohibitif.
De plus, cet appareil ne peut être utilisé que pour les plantules d’Arabidopsis qui ont des dimensions hypocotyles similaires à celles des plantules de type sauvage. Bien qu’Arabidopsis soit l’espèce clé dans le monde de la génétique moléculaire des plantes, des travaux récents ont été effectués sur d’autres espèces en utilisant la greffe de semis. Les exemples incluent la greffe de soja et de haricot commun, le tabac à la tomate et le canola à Arabidopsis, puis l’échantillonnage des deux tissus pour les petits ARN13,14. Par conséquent, une méthode de greffage accessible à la plupart des laboratoires et pouvant être facilement adaptée à un large éventail d’espèces végétales sans modification majeure de la technique est hautement souhaitable.
Ce protocole détaille une méthode qui utilise la production interne d’un dispositif de greffage simple qui permet la personnalisation complète du diamètre et de la longueur du canal de greffage pour s’adapter à toute morphologie de semis chez la plupart des espèces végétales. La production de ces appareils est très abordable et hautement évolutive, car les seuls composants nécessaires sont un élastomère de silicone, un câblage ou un tube de la bonne taille, une lame de haute précision et un récipient pour servir de moule. En suivant le protocole de greffe détaillé ici, les utilisateurs peuvent obtenir des taux de greffe réussis de 45% (n = 105), comparables aux résultats de greffe précédemment rapportés10,12.

<table><tbody><tr><td>Tubes coniques de 15 mL</td><td>VWR International Inc</td><td>10026-076</td><td></td></tr><tr><td>ACETONE (HPLC & 4 L</td><td>VWR</td><td>BJAH010-4</td><td></td></tr><tr><td>BactoAgar</td><td>Sigma</td><td>A1296-500g</td><td></td></tr><tr><td>Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0,5 kg Kit</td><td>Dow</td><td>2646340</td><td></td></tr><tr><td>D-Saccharose (biologie moléculaire), 1 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1,5 mL), paquet de 500</td><td>Fisher Scientific</td><td>20901-551 / 05-402</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Poignée de scalpel de haute précision #4</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-164</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Ruban autoclave sans plomb</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-111</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri carrées Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Leica Zoom 2000 Microscope stéréoscopique</td><td>Central</td><td>L-Z2000</td><td></td></tr><tr><td>Ruban Micropore</td><td>3M</td><td>B0082A9FEM</td><td></td></tr><tr><td>Murashige et Skoog Basal Medium</td><td>Sigma</td><td>M5519-10L</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Genesee Scientific</td><td>16-101</td><td></td></tr><tr><td>hydroxyde de potassium</td><td>VWR International Inc</td><td>AA13451-36</td><td></td></tr><tr><td>Redi-earth Plug and Seedling Mix</td><td>Sun Gro Horticulture</td><td>SUN239274728CFLP</td><td></td></tr><tr><td>Scotts Osmocote Plus</td><td>Hummert International</td><td>7630600</td><td></td></tr><tr><td>Conception chirurgicale n° 22 Lame de scalpel en carbone</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-697</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20, 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>PINCE à épiler DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM</td><td>VWR</td><td>102091-580</td><td></td></tr></tbody></table>

greffe de semis évolutive, flexible et rentable

Scalable, Flexible, and Cost-Effective Seedling Grafting

La greffe de semis à un stade précoce est devenue un outil populaire en génétique moléculaire pour étudier les relations racine-pousse au sein des plantes. La greffe de semis à un stade précoce de la petite plante modèle, Arabidopsis thaliana, est techniquement difficile et prend beaucoup de temps en raison de la taille et de la fragilité de ses semis. Une collection croissante de méthodes publiées décrivent cette technique avec des taux de réussite, des difficultés et des coûts associés variables. Cet article décrit une procédure simple pour fabriquer un dispositif de greffage réutilisable interne à l’aide d’un mélange d’élastomère de silicone, et comment utiliser ce dispositif pour la greffe de semis. Au moment de la présente publication, la production de chaque dispositif de greffe réutilisable ne coûte que 0,47 $ en matériaux consommables. En utilisant cette méthode, les débutants peuvent avoir leurs premiers plants greffés avec succès en moins de 3 semaines du début à la fin. Cette procédure hautement accessible permettra aux laboratoires de génétique moléculaire des plantes d’établir la greffe de semis comme une partie normale de leur processus expérimental. En raison du contrôle total que les utilisateurs ont dans la création et la conception de ces dispositifs de greffe, cette technique pourrait être facilement ajustée pour une utilisation dans des plantes plus grandes, telles que la tomate ou le tabac, si désiré.

Divers aspects de la conception de la bandelette de greffe ont été testés afin d’identifier les conditions de greffe optimales qui nécessitaient le moins de compétences techniques (tableau 1). Tous les essais de greffe ont été réalisés sur un milieu de SEP à 0,5 %, qui a déjà été signalé comme un milieu de greffe idéal11,12.
La croissance optimale des plantules ne peut pas être obtenue avec la germination sur b...

Ce protocole décrit une méthode de greffe de plantules robuste qui ne nécessite aucune expérience ou formation préalable et peut être exécutée à très faible coût en utilisant des matériaux facilement accessibles dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire.

Greffe de semis évolutive, flexible et rentable

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage ...

Le greffage de semis à un stade précoce est un outil puissant pour établir la signalisation à longue distance chez les plantes. Nous espérons que cette méthode contribuera à l’adoption réussie du greffage d’ensemencement sans formation pratique. Commencez par préparer la boîte de Petri carrée, mesurant 100x100 millimètres pour couler l’élastomère de silicone.Prenez le fil de calibre 29 dans des attaches torsadées après avoir retiré le revêtement de papier extérieur sur le fil avec de l’acétone. Et redressez complètement le fil en le roulant sur une surface dure et uniforme avec un objet plat lourd, comme un support de tube métallique. Ensuite, posez quatre morceaux de fils redressés équidistants les uns des autres dans la boîte de Petri carrée, en veillant à ce que les fils reposent à plat sur le fond de la parabole.Versez la solution d’élastomère de silicium mélangé sur les fils de la boîte de Petri et placez le couvercle sur la boîte. Après avoir laissé durcir le silicone pendant 24 à 48 heures à température ambiante, retirez la feuille de silicone de la boîte de Petri à l’aide d’une pince propre et déplacez-la sur une surface propre et plane. Retirez les fils de la feuille de silicone.Pour vous assurer que les canaux sont ouverts d’un côté, utilisez des pinces à pointe fine pour nettoyer la fine couche de silicone bloquant le côté ouvert des canaux. Couper la feuille de silicone perpendiculairement aux canaux en bandes de trois millimètres à l’aide de ciseaux propres. Placez chaque bande dans une enveloppe en papier d’aluminium et scellez-la avec du ruban autoclave.Autoclaver les bandes à 121 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes avant de les stocker jusqu’à ce que nécessaire. Pour stériliser et vernaliser les graines, prenez un millilitre de solution d’eau de Javel à 50% contenant 0,1% de Tween 20 dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et suspendez-y jusqu’à 100 graines d’arabidopsis. Incuber la suspension de graines à température ambiante pendant cinq à 10 minutes.Post-incubation, aspirer ou pipeter la solution d’eau de Javel dans des conditions stériles. Rincez les graines avec un millilitre d’eau distillée stérilisée. Assurez-vous de retourner les tubes adéquatement pendant le rinçage des graines.Pour enlever toute solution d’eau de Javel laissée en haut du tube, répétez le rinçage quatre fois. Laissez environ 250 microlitres d’eau avec les graines dans le tube et conservez les graines dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant trois jours. Ensuite, avant de plaquer les graines, placez les bandes stériles sur la surface de la plaque MS préparée pour guider l’alignement des graines avec les canaux sur les bandelettes.Ensuite, en travaillant dans des conditions stériles, utilisez une pointe de pipette de 20 microlitres pour aspirer et transférer le nombre approprié de graines préparées sur la plaque. Une fois les graines plaquées, retirez les bandelettes stériles. Couvrir l’assiette.Et scellez l’un des côtés de la plaque parallèle aux rangées de graines avec du parafilm. Enroulez du ruban adhésif respirant sur le dessus du parafilm et autour de tous les autres bords de la plaque pour permettre l’échange d’air pendant l’incubation. Orientez soigneusement deux plaques verticalement avec leurs côtés scellés au parafilm vers le bas.Séparez-les en bas en plaçant horizontalement un tube centrifuge de 15 millilitres entre les deux, tout en les fixant ensemble sur le dessus avec un élastique. Assurez-vous que les surfaces de la plaque forment un angle de 100 à 110 avec la surface de la paillasse. Conservez les plaques dans cette orientation pendant 72 heures dans l’obscurité totale à 21 degrés Celsius pour permettre aux hypocotyles des plantules de croître d’environ cinq millimètres de longueur.Après quoi, retirez la configuration de l’obscurité et maintenez-la sous un cycle de lumière de 16 heures et un cycle d’obscurité de huit heures pendant deux à quatre jours à la même température avant la greffe. Greffez les plantules entre cinq et sept jours après avoir été plaquées. Placez une bande de greffe sur les plantules en insérant leurs hypocotyles dans les canaux.Positionnez doucement le semis de sorte que la jonction racine-hypocotyle reste au bas de la bande de silicone pour préparer le plant à la coupe. En travaillant dans une hotte stérile à l’aide d’une lunette de dissection, préparez les greffons pour la greffe. À l’aide d’une lame de scalpel fraîche, faites une coupe droite, propre et perpendiculaire à travers l’hypocotyle.Évitez d’appuyer et de pousser le semis dans l’agar-agar. Ensuite, retirez la goulotte et maintenez la partie coupée de la goulotte hydratée en assurant le contact avec la surface du média. Alternativement, la goulotte peut être déplacée dans une boîte de Petri remplie d’eau distillée stérile.Pour préparer les porte-greffes, saisissez soigneusement la racine dans l’espace entre les pinces fermées et tournez doucement pour la tirer, en laissant la section coupée des porte-greffes au milieu de la bande. Ensuite, prenez doucement la goulotte souhaitée à l’aide de la pince à pointe fine et insérez-la dans le haut du canal. Visuellement, confirmez le contact entre le greffon et le porte-greffe pour obtenir une greffe réussie.Une fois que toutes les greffes ont été faites, enveloppez les plaques avec du parafilm et du ruban respirant, et installez les plaques de la même manière que démontré précédemment sans déranger les semis ou les bandes de silicone. Déplacez délicatement les plaques dans une chambre de croissance réglée à 26 degrés Celsius avec un cycle de lumière de 16 heures et un cycle d’obscurité de huit heures. Après sept à 10 jours, évaluez les plantules greffées dans des conditions stériles en utilisant des forceps pour décoller soigneusement la bande de silicone d’un côté et libérer les plantules des canaux.Enlevez toutes les racines adventives qui poussent du greffon en les coupant avec une lame de scalpel fraîche ou en les écrasant avec une pince à pointe fine. Encore une fois, évaluez visuellement si le porte-greffe est fermement attaché au greffon formant une greffe réussie. Déplacez les greffons réussis sur le sol de multiplication des semis et recouvrez le sol de plastique transparent pendant quelques jours pendant que les semis s’établissent.Laissez les plantes pousser sous les cycles de lumière et d’obscurité mentionnés précédemment à 21 degrés Celsius. Les essais de greffage visant à déterminer le protocole de greffage optimal ont révélé un taux de réussite global de la greffe de 25% lorsque les graines ont germé directement sur les bandes de silicone avec des canaux fermés. La réorientation des graines pour maintenir les cotylédons des embryons et le radical pointant vers le bas pendant la germination a légèrement augmenté l’efficacité de greffage à 33%Lors du retrait de la fermeture en silicone sur les canaux pour permettre le contact entre la graine et le milieu de croissance, 85% des plantules ont germé avec succès.Cependant, le taux de réussite de la greffe est resté à 31%, ce qui indique qu’une croissance optimale des plantules ne pouvait pas être atteinte avec la germination sur bande. Fait intéressant, le protocole démontré dans lequel les plantules ont été cultivées verticalement sur la plaque de greffage avant d’être insérées dans les canaux ouverts dans les bandes a donné un taux global de réussite de greffe à 48% au cours des deux premiers essais. Compte tenu du taux de réussite plus faible du troisième essai et de la relativement petite échelle, qui peut être attribuée à de légères variations dans les sites de greffe, le succès global de la greffe s’est avéré être de 45%.Cependant, le protocole démontré prend comparativement moins de temps. En utilisant ce protocole, les laboratoires novices en matière de greffe de semis peuvent rapidement créer un grand nombre de dispositifs de soutien de greffe tout en étant en mesure de personnaliser facilement le dispositif pour répondre à leurs besoins spécifiques.

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Source : Beernink, B. M. et al. Agroinoculation directe des semis de maïs par injection avec des clones infectieux du virus de la mosaïque de la queue de renard et du virus de la mosaïque de la canne à sucre. J. Vis. Exp. (2021)Cette vidéo montre la délivrance médiée par Agrobacterium de clones viraux recombinants dans les semis de maïs pour la mise en silence génétique. Il décrit le processus d’infection à Agrobacterium , la propagation systémique du virus et les changements phénotypiques liés...

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Mise à l&#39;échelle de l&#39;ingénierie vasculaire Greffes Utilisation 3D Printed Guides et Méthode d&#39;empilage Anneau

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