Collecte dynamique en temps réel de liquide extracellulaire hippocampique de rats conscients à l’aide d’un système de microdialyse
21 octobre 2022
Le protocole fournit ici un échantillonnage dynamique détaillé en temps réel du liquide extracellulaire de l’hippocampe de rats éveillés à l’aide d’un système de microdialyse.
Le liquide extracellulaire hippocampique et la foule par la technique de microdialyse cérébrale contribue à surveiller la micro maladie spécifique des maladies du nerf central. La technique de microdialyse cérébrale permet d’obtenir une inquisition dynamique et continue du liquide cérébral interstitiel dans des régions cérébrales spécifiques de rats non anesthésiés. Commencez par fixer le rat anesthésié sur un localisateur cérébral stéréotaxique et essuyez la zone chirurgicale rasée avec un tampon povidone iodée et éthanol trois fois avant l’opération.
Ensuite, faites une incision faciale crânienne de 1,5 centimètre au milieu avec des ciseaux chirurgicaux et retirez le périoste à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces ophtalmiques. En considérant le bregma comme la position basale, à l’aide d’une perceuse crânienne, percer l’endocrâne pour percer une ouverture de deux millimètres dans la région CA1 de l’hippocampe. Maintenant, fixez la stilette du cathéter sur la pince d’un localisateur cérébral stéréotaxique et ajustez la position de l’enveloppe de microdialyse aux positions antéropostérieure, médiolatérale et ventrale dorsale.
Ajustez la valve dorso-ventrale du localisateur stéréo cérébral et implantez le boîtier de microdialyse dans la région CA1 à une profondeur de 3,5 millimètres. Percez trois autres ouvertures d’un diamètre de deux millimètres de sorte que les trois ouvertures forment un triangle dans lequel l’ouverture de la sonde est située au centre. L’implant se visse dans les ouvertures à une profondeur d’un millimètre et fixe le cathéter de sonde avec du ciment dentaire.
Ensuite, utilisez une suture chirurgicale 4-O pour fermer la peau. Connectez la microseringue de la pompe de microdialyse au dispositif d’activité éveillée ACSF et au collecteur d’échantillons cryogéniques conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, pour évacuer l’air dans le pipeline, réglez la pompe de microdialyse à un débit d’un microlitre par minute.
Ensuite, connectez le pipeline et la sonde de microdialyse cérébrale et faites fonctionner la pompe de microdialyse à un débit d’un microlitre par minute pour injecter ACSF dans la sonde jusqu’à ce que la surface de la sonde soit légèrement humide. Immerger la sonde dans une solution d’injection d’héparine sodique pour une utilisation ultérieure. Pour recueillir la HECF du rat éveillé, insérez la sonde de microdialyse cérébrale dans le cathéter de la sonde et placez le rat dans une chambre avec rembourrage pour s’assurer que les rats sont libres de se déplacer.
Allumez le contrôleur pivotant multicanal pour éviter d’entrelacer les pipelines de microdialyse pendant la libre circulation du rat. Allumez ensuite la pompe à microseringue et pompez l’ACSF à raison d’un microlitre par minute. Après un équilibrage de 60 minutes du système de collecte HECF de microdialyse, collecter périodiquement HECF.
Après l’arrêt du prélèvement, retirez la sonde de microdialyse cérébrale du cathéter de la sonde. Immergez la sonde dans de l’eau désionisée et lavez-la avec de l’eau désionisée pendant 12 heures pour éliminer les dépôts de sel échoués du pipeline et de la sonde. Retirez la sonde et placez-la dans une solution de tripsine à 0,05% à quatre degrés Celsius.
Le liquide extracellulaire hippocampique acquis par la technique de microdialyse cérébrale est semblable à de l’eau, incolore et transparent à la fréquence d’échantillonnage définie. Les procédures les plus importantes consistent à implanter soigneusement la microdialyse dans la région CA1 et à insérer la sonde dans le cathéter pop. La technique de microdialyse permet simplement d’aider au changement dynamique des marqueurs de la maladie dans des régions spécifiques du cerveau, à l’efficacité de la substance du médicament et au catabolisme tissulaire des composants du médicament.
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Aperçu
Cet article présente un protocole d'échantillonnage dynamique en temps réel du liquide extracellulaire de l'hippocampe (HECF) chez des rats éveillés, en utilisant une technique de microdialyse cérébrale. Ce processus permet aux chercheurs de surveiller des marqueurs spécifiques aux maladies du système nerveux central en obtenant des échantillons continus de régions cérébrales spécifiques, sans anesthésier les sujets.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Maladies neurodégénératives
- Techniques de microdialyse
Contexte
- Comprendre la dynamique des fluides extracellulaires est essentiel pour l'étude des mécanismes neuronaux et de la plasticité.
- Les méthodes actuelles impliquent généralement des techniques invasives qui peuvent influencer le contexte biologique.
- La microdialyse permet la collecte de liquide interstitiel pendant que le sujet est éveillé, fournissant des données plus pertinentes.
- Ce protocole répond au besoin de surveillance continue de la composition du liquide cérébral chez des modèles vivants.
Objectif de l'étude
- Améliorer la surveillance des marqueurs de la maladie dans l'hippocampe en mettant en œuvre une approche d'échantillonnage non invasive.
- Fournir un cadre méthodologique détaillé permettant aux chercheurs de reproduire la procédure.
- Mettre en place un système fiable pour observer les effets des médicaments et les changements métaboliques au fil du temps.
Méthodes utilisées
- L'étude utilise un système de microdialyse implanté dans la région CA1 de l'hippocampe.
- Des rats éveillés non anesthésiés servent de modèle biologique pour l'échantillonnage du LECF.
- La technique de microdialyse mesure le fluide à un débit d'un microlitre par minute.
- Les étapes critiques incluent l'implantation précise du cathéter, l'équilibration et des intervalles d'échantillonnage réguliers.
- Un nettoyage de la sonde de microdialyse après l'échantillonnage est effectué afin de garantir l'intégrité des données.
Résultats principaux
- Le LECR recueilli est clair et incolore, ce qui permet l'analyse des marqueurs de la maladie.
- Une méthodologie approfondie permet d'expérimenter les changements dynamiques dans les environnements neuronaux.
- Les informations obtenues grâce à cette méthode peuvent aider à évaluer l'efficacité des médicaments et à comprendre le catabolisme tissulaire.
Conclusions
- La présente étude démontre le potentiel de la microdialyse pour approfondir notre compréhension de la dynamique des fluides cérébraux et des processus pathologiques.
- La capacité de surveillance continue permet d'évaluer les changements en temps réel liés à l'action des médicaments et aux états métaboliques.
- Ces connaissances sont essentielles pour améliorer les stratégies de prise en charge des maladies neurologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La collecte dynamique en temps réel du liquide extracellulaire de l'hippocampe (HECF) chez des rats conscients permet une surveillance directe des modifications neurochimiques liées à l'évolution des maladies du SNC et à l'efficacité des médicaments. Cette capacité renforce la fiabilité prédictive en neurosciences translationnelles en fournissant des données quantitatives et résolues dans le temps sur des biomarqueurs provenant de régions cérébrales pertinentes pour la maladie. Cette approche soutient la découverte précoce et la réduction des risques mécanistiques pour les portefeuilles de neurothérapeutiques ciblant les voies hippocampiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'analyse des dynamiques neurochimiques sous-jacentes aux mécanismes des maladies du SNC in vivo.
- Permet la validation fonctionnelle de cibles en quantifiant les effets des médicaments et de leurs métabolites dans l'hippocampe.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques grâce à la mesure directe de marqueurs extracellulaires pertinents pour la maladie.
Développement de criblages et de tests
- Permet un échantillonnage quantitatif validé du liquide extracellulaire cérébral en vue de criblages de composés en aval.
- Permet la collecte reproductible et standardisée de données neurochimiques chez des modèles animaux éveillés.
- Facilite le développement d'analyses pour évaluer les réponses pharmacodynamiques aux composés actifs sur le système nerveux central.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne la mesure des biomarqueurs précliniques avec des critères d'évaluation pertinents pour la maladie en neurosciences translationnelles.
- Permet une continuité entre la découverte et la validation préclinique en suivant in vivo les effets dynamiques des médicaments.
- Prend en charge les décisions d'avancement ajustées au risque, basées sur des lectures neurochimiques en temps réel.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode de microdialyse s'intègre dans la continuité découverte-préclinique en permettant une analyse quantitative en temps réel du liquide extracellulaire hippocampique chez des rats conscients.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification des hypothèses et la clarification des voies pour les cibles du système nerveux central en surveillant les changements dynamiques des biomarqueurs.
- Tri : Fournit des données neurochimiques reproductibles et prêtes à l'essai pour l'évaluation des composés.
- Analytique : Produit des résultats quantitatifs permettant de comparer les effets des médicaments et les états pathologiques dans différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Fait le lien entre les études précliniques et translationnelles en alignant la mesure des biomarqueurs sur les critères cliniques.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour les flux de travail de découverte de médicaments du système nerveux central et de validation des biomarqueurs.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles du SNC.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'échantillonnage neurochimique et améliore la reproductibilité entre les études.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon et l'efficacité du capital en fournissant des données exploitables sur des biomarqueurs.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats thérapeutiques neurologiques selon des preuves dynamiques in vivo.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en chirurgie stéréotaxique et en implantation de sondes de microdialyse.
- Requiert un équipement spécialisé pour l'échantillonnage par microdialyse et l'analyse quantitative.
- Exige une standardisation interéquipes des débits d'échantillonnage et des protocoles analytiques.
- L'adaptation à différentes régions cérébrales ou modèles de maladie peut nécessiter une optimisation du protocole.
- L'échantillonnage est limité aux analytes de moins de 20 kDa en raison des spécifications de coupure de la sonde.
F.A.Q. sur la bio-pharmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Brain Microdialysis Probe Implantation Surgery
2:24
Microdialysis System Connection and Probe Check
3:15
Collection of Hippocampal Extracellular Fluid (HECF) from the Awake Rat
4:02
Maintenance of the Microdialysis System and Devices After Sampling
4:36
Results: Analysis of HECF Collected Using the Microdialysis Sampling Equipment
4:54
Conclusion
