Name: Contrôle de la fraction de particules dans des échafaudages de particules microporeuses recuites pour culture cellulaire 3D (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Découvrez comment contrôler la fraction de particules dans des échafaudages MAP microporeux pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthode améliore la reproductibilité des propriétés des biomatériaux et des réponses cellulaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier les National Institutes of Health, les National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) et le National Institute of Allergy and Infectious Disease (1R01AI152568). Ce travail a été réalisé en partie au Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), membre du North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), qui est soutenu par la National Science Foundation (numéro de prix ECCS-2025064) dans le cadre de la National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). Les auteurs tiennent à remercier l’ancien post-doctorant du laboratoire, le Dr Lucas Schirmer, ainsi qu’Ethan Nicklow, pour leur aide dans la génération du dispositif imprimé en 3D pour les expériences de culture cellulaire.

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Darling, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+by+click+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391(2020).</li>
<li>Truong, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+annealed+particle+hydrogel+stiffness%2C+void+space+size%2C+and+adhesion+properties+impact+cell+proliferation%2C+cell+spreading%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer.</a> Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+microgel+scaffolds+as+platforms+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254(2017).</li>
<li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2022).</li>
<li>Wilson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometric+post+modification+of+hydrogel+microparticles+dictates+neural+stem+cell+fate+in+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds.</a> Advanced Materials. 34 (33), 2201921(2022).</li>
<li>Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+microgel+fabrication+technique+on+granular+hydrogel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).</li>
<li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jammed+microgel+inks+for+3D+printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Jammed microgel inks for 3D printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076(2018).</li>
<li>Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+fraction+as+a+bioactive+cue+in+granular+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular%2C+colloidal%2C+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Polymer+Materials%22%5BJournal%5D)">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+variable+height+photolithography+for+valved+multilayer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55276(2017).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+%28NMR%29+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database.+Organic+Chemistry.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy.</a> JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Roosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+microgel+building+blocks+for+microporous+annealed+particle+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64119(2022).</li>
<li>Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+bioorthogonal+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Letters%22%5BJournal%5D)">Interfacial bioorthogonal crosslinking.</a> ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).</li>
<li>Welzel, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogel+micromechanics+unraveled+by+atomic+force+microscopy-based+nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation.</a> Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).</li>
<li>Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroporous+elastic+polyacrylamide+gels+prepared+at+subzero+temperatures%3A+control+of+porous+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure.</a> Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).</li>
<li>Rommel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+microgel+rods+interlinked+into+soft+macroporous+structures+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture.</a> Advanced Science. 9 (10), 2103554(2022).</li>
<li>Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+delivery+from+granular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid delivery from granular hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867(2021).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+governing+polyethylenimine+polyplex+transfection+in+Microporous+Annealed+Particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+formation+through+assembly+of+microgels+containing+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells.</a> Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).</li>
</ol>

ARA et TS ont déposé un brevet provisoire sur cette technologie.

Il a été démontré que la production microfluidique de microgels HA-NB génère des microgels avec une gamme de distribution granulométrique plus étroite que la production par lots d’émulsion 3,9. Les microgels décrits dans ce protocole ont été formulés à l’aide d’un agent de réticulation clivable MMP (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) pour soutenir la dégradation des matériaux. Cependant, les microgels HA-NB peuvent également être réticulés à l’aide d’un liant di...

Les échafaudages à particules microporeuses recuites (MAP) sont une sous-classe de matériaux granulaires dans lesquels les blocs de construction en microgel (μgel) sont reliés entre eux pour former un échafaudage poreux en vrac. Avec la microarchitecture unique de ces échafaudages granulaires, la porosité innée générée par l’espace vide entre microgel sphérique interconnecté favorise l’infiltration cellulaire accélérée et la migration1. Les blocs de construction en microgel des échafaudages MAP peuvent être fabriqués à partir de polymères synthétiques et naturels avec des modifications chimiques2. Les méthodes décrites ici mettent spécifiquement en évidence l’utilisation de microgels composés d’un squelette d’acide hyaluronique (HA) modifié avec des poignées fonctionnelles de norbornène (NB). La poignée fonctionnelle NB sur le polymère HA supporte les réactions chimiques de clic pour former des microgels et les relier entre eux pour générer des échafaudages MAP 3,4. De nombreux schémas ont été utilisés pour relier les microgels entre eux (c’est-à-dire le recuit), tels que les réactions enzymatiques1, 5,6 à base de lumière et chimiques de clicsans additifs 3,7. La chimie du clic sans additif est décrite dans ce travail, en utilisant la conjugaison Diels-Alder à demande inverse tétrazine-norbornène pour interconnecter les microgels HA-NB.
Pour fabriquer des échafaudages MAP, les utilisateurs génèrent d’abord les blocs de construction de microgel en utilisant des émulsions inverses dans des systèmes discontinus ou dans des dispositifs microfluidiques, ainsi qu’avec la pulvérisation électrohydrodynamique, la lithographie ou la fragmentation mécanique2. La production de microgels sphériques HA-NB a été bien décrite et a déjà été rapportée à l’aide des techniques d’émulsiondiscontinue 2 et de génération de gouttelettes microfluidiques 8,9,10,11. Dans ce travail, des microgels sphériques HA-NB ont été générés sur une plate-forme microfluidique focalisant l’écoulement pour une taille et une forme contrôlées, comme décrit précédemment 8,9,10. Après purification, les microgels existent dans une suspension aqueuse et doivent être concentrés pour induire un état de coincement. Lorsqu’ils sont coincés, les microgels présentent des propriétés d’amincissement par cisaillement, ce qui leur permet de fonctionner comme des matériaux injectables qui remplissent l’espace1. Une méthode pour induire un état de bourrage consiste à sécher les microgels par lyophilisation, ou lyophilisation, puis à réhydrater ensuite le produit séché dans un volume contrôlé12. Alternativement, l’excès de tampon peut être éliminé de la boue de microgel par centrifugation sur une passoire ou par retrait manuel du tampon de la pastille de microgel, soit par aspiration, soit à l’aide d’un matériau absorbant. Cependant, l’utilisation de la centrifugation pour sécher les microgels peut générer une gamme très variable de fractions de particules et de fractions de vide lors de la fabrication d’échafaudages granulaires12. Des techniques de lyophilisation des microgels ont été décrites en utilisant 70% d’IPA pour les microgels de polyéthylène glycol (PEG)13, des huiles fluorées pour les microgels méthacryloyl (GelMa) 14 et 70% d’éthanol pour les microgels HA12. Ce protocole met en évidence des méthodes de lyophilisation de microgels HA sphériques utilisant de l’éthanol à 70%, un réactif de laboratoire standard, afin de conserver les propriétés originales du microgel pendant le processus de séchage. Les microgels HA lyophilisés peuvent être pesés et réhydratés à des pourcentages pondéraux définis par l’utilisateur pour contrôler les fractions de particules finales dans les échafaudages MAP12.
La dernière étape de la formation de l’échafaudage MAP repose sur le recuit des microgels pour créer un échafaudage poreux en vrac1. En utilisant des composants de matrice extracellulaire natifs et en utilisant des schémas de recuit bio-orthogonaux, les échafaudages MAP servent de plate-forme biocompatible pour la culture cellulaire in vitro et la réparation tissulaire in vivo 3. Grâce à ces approches, les échafaudages MAP peuvent être fabriqués à partir de blocs de construction HA-NB avec des fractions de particules définies par l’utilisateur pour leur utilisation dans des applications d’ingénierie tissulaire12. Le protocole suivant décrit la production microfluidique de microgels HA-NB suivie d’une lyophilisation et d’une réhydratation pour contrôler la fraction de particules dans les échafaudages MAP. Enfin, les étapes de recuit des microgels sont décrites à l’aide de la chimie bio-orthogonale pour des expériences de culture cellulaire 3D in vitro .

<table><tbody><tr><td>Seringue Luer-Lok stérile, à usage unique, polycarbonate</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Seringue Luer-Lok stérile, à usage unique, polycarbonate</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 Maléimide</td><td>Invitrogen</td><td>A10254</td><td>Pour la synthèse de tétrazine marquée par fluorescence</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloïdine</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>Pour la coloration d’échantillons de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>VWR</td><td>89107-726</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie avec piston, 1,0 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie, 4 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille émoussée, 23 g 0,5", non stérile, coiffé</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>B23-50</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à vide pour flacon, 0,22 &mu ; m</td><td>Corning</td><td>CLS430521</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>VWR</td><td>1B1110</td><td>Pour tampon de lavage de microgel</td></tr><tr><td>Assemblages de pistons capillaires pour pipettes volumétriques, 1000 &mu ; L volume max.</td><td>Rainin</td><td>17008609</td><td></td></tr><tr><td>Assemblages de pistons capillaires pour pipettes volumétriques, 25 &mu ; L volume max.</td><td>Rainin</td><td>17008605</td><td></td></tr><tr><td>Assemblages de pistons capillaires pour pipettes volumétriques, 250 &mu ; L volume max.</td><td>Rainin</td><td>17008608</td><td></td></tr><tr><td>Countess Lames de chambre de comptage de cellules</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Compteur de cellules automatisé</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger, 15 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>667015B</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger, 50 mL</td><td></td><td>CELLTREAT 229421</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme, qualité ACS, Bouteille en verre</td><td>Stellar Scientific</td><td>CP-C7304</td><td>Pour la synthèse de tétrazine Corona marquée par fluorescence</td></tr><tr><td>, pistolet à plasma Corona BD-10A, générateur haute fréquence ETP</td><td></td><td>11011</td><td></td></tr><tr><td>, flacons CryoTube, polypropylène, filetage intérieur avec bouchon à vis</td><td>Nunc</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>D1 cellules mésenchymateuses de souris</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>Exemple de lignée cellulaire pour la culture dans des gels MAP</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Pour la coloration d’échantillons de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Oxyde de deutérium, 99,9 atomes D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td>Pour la spectroscopie RMN</td></tr><tr><td>Tube de dialyse, membrane de cellulose régénérée, seuil de coupure de poids moléculaire de 12 à 14 kDa</td><td>Spectra/Por</td><td>132703</td> Pour la purification de l’éther diéthylique <td>HA-NB et HA-Tet</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>BDH1121-4LPC</td><td>Pour la synthèse de tétrazine marquée par fluorescence</td></tr><tr><td>Diméthylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277056</td><td>Pour la synthèse de chlorure de tétrazine</td></tr><tr><td>4-(4,6-diméthoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-méthylmorpholinium marqué par fluorescence (DMTMM)&nbsp ;</td><td>TCI-Chemicals</td><td>D2919</td><td>Pour modifier le</td></tr><tr><td>dithiothréitol HA (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0861</td><td>Agent de liaison dithiol non dégradable (substitut du peptide clivable MMP)</td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, glucose élevé, avec 4500 mg/L de glucose, L-glutamine, pyruvate de sodium et bicarbonate de sodium, liquide, filtré stérilement, adapté à la culture cellulaire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td>Pour D1 culture cellulaire</td></tr><tr><td>EMS Paraformaldéhyde, Granulaire</td><td>VWR</td><td>100504-162</td><td>Pour la fabrication de 4 % de PFA</td></tr><tr><td>Absolu d’éthanol (200 proof)</td><td>KOPTEC</td><td>89234-850</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>Pour la culture cellulaire D1</td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>Kopf Instruments</td><td>HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre avec couvre-objet</td><td>Daigger Scientific</td><td></td><td></td>EF16034F</tr><tr><td>Acide 2-[4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-yl]éthanesulfonique (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronate de sodium, poids moléculaire moyen de 79 kDa, produit chez des bactéries Streptococcus zooepidemicus, qualité pharmaceutique, contamination microbienne < 100 UFC/g, endotoxines bactériennes < 0,050 UI/mg</td><td>de Contipro</td><td>N/A</td><td>de poids moléculaire moyen de 79 kDa a été utilisé pour la synthèse de HA-Tet, mais ces méthodes ont pu être adaptées à d’autres poids moléculaires.</td></tr><tr><td>Progiciel IMARIS Essentials</td><td>Oxford Instruments</td><td>N/A</td><td>Logiciel d’analyse d’images de microscopie</td></tr><tr><td>Pompe à perfusion, seringue double</td><td>Chemyx</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Support de laboratoire avec support pince de laboratoire</td><td>Geyer</td><td>212100</td><td></td></tr><tr><td>Azote liquide</td><td>Airgas</td><td>NI 180LT22</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate</td><td>TCI-Chemicals</td><td>L0290</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td>N/A</td><td>Labconco FreeZone 6 plus a été abandonné, mais d’autres lyophilisateurs à console de qualité laboratoire pourraient être utilisés pour ce protocole.</td></tr><tr><td>Méthyltétrazine-PEG4-maléimide</td><td>Kerafast</td><td>FCC210</td><td>Pour la synthèse de tétrazine</td></tr><tr><td>2-(4-morpholino)éthane marqué par fluorescence Acide sulfonique (MES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>Pour modifier HA</td></tr><tr><td>Micro verre de protection, 24 x 60 mm N° 1</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif microfluidique SU8 plaquette maîtresse</td><td>FlowJem</td><td></td><td>Conception sur mesure réalisée soit en interne en salle blanche ou externalisée</td></tr><tr><td>Huile minérale lourde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>Peptide de réticulation dithiol clivable MMP (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5-Norbornene-2-methylamine</td><td>TCI-Chemicals</td><td>95-10-3</td><td>Pour synthèse HA-NB</td></tr><tr><td>Ruban d’emballage</td><td>Scotch</td><td>3M 1426</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PEG(thiol)2</td><td>JenKem Technology USA</td><td>A4001-1</td><td>Pour la synthèse de tétrazine</td></tr><tr><td>pénicilline-streptomycine marquée par fluorescence, 10 000 unités/mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Pour la culture cellulaire D1</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, polystyrène, jetable, Dia. x H=150 x 15 mm</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Pour le lavage des HMP</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>RainX traitement hydrofuge du verre</td><td>Grainger</td><td>465D20</td><td>Solution de traitement hydrophobe synthétique pour le traitement par dispositif microfluidique</td></tr><tr><td>Peptide RGD (Ac-RGDSPGERCG-NH2)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Élastiques Agrafes</td><td>112417</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Chem-Impex</td><td>30070</td><td>Pour dialyse</td></tr><tr><td>Span 80 pour la synthèse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1338-43-8</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Élastomère de silicone</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>4019862</td><td>polydiméthylsiloxane (PDMS) élastomère pour la fabrication de dispositifs microfluidiques et de dispositifs de culture tissulaire</td></tr><tr><td>Filtre à seringue, Whatman Uniflo, 0.2 &mu ; m PES, 13 mm de diamètre</td><td>Cytvia</td><td>09-928-066</td><td></td></tr><tr><td>Microscope numérique LCD Tetraview</td><td>Celestron</td><td>44347</td><td></td></tr><tr><td>Sel de tétrazine-amine HCl</td><td>Chem-Impex</td><td>35098</td><td>Pour la synthèse de HA-Tet</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471283</td><td>Pour la synthèse de tétrazine Tris</td></tr><tr><td>(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)</td><td>Millipore Sigma</td><td>51805-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97063-864</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan, 0,4 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA (0,25 %), Rouge de phénol</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-200-056</td><td>Pour soulever les cellules adhérentes à l’ensemencement dans des gels MAP</td></tr><tr><td>Tygon ND-100-80 Tube médical sans DEHP, calibre de l’aiguille = 23, épaisseur de la paroi = 0,020 po, diamètre intérieur = 0,020, extérieur diamètre = 0,060 po Thomas</td><td>Scientific</td><td>1204G82</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de système de polymérisation UV, LX500 LED&nbsp ;</td><td>OmniCure</td><td>010-00369R</td><td></td></tr><tr><td>Tête de polymérisation UV, spot LED Spot UV Luxmètre UV</td><td>OmniCure</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>, Traceable</td><td>VWR</td><td>61161-386</td><td></td></tr><tr><td>Dessiccateur</td><td>sous vide Bel-Art</td><td>08-594-15C</td><td></td></tr><tr><td>X-Acto Z Series Couteau utilitaire de précision</td><td>Elmer’s</td><td>XZ3601W</td><td></td></tr></tbody></table>

contrôle de la fraction de particules dans des échafaudages de particules microporeuses recuites pour culture cellulaire 3d

Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture

Les microgels sont les éléments constitutifs des échafaudages de particules microporeuses recuites (MAP), qui servent de plate-forme à la fois pour la culture cellulaire in vitro et la réparation tissulaire in vivo . Dans ces échafaudages granulaires, la porosité innée générée par l’espace vide entre les microgels permet l’infiltration et la migration cellulaire. Le contrôle de la fraction vide et de la fraction particulaire est essentiel pour la conception d’échafaudages MAP, car la porosité est un signal bioactif pour les cellules. Les microgels sphériques peuvent être générés sur un dispositif microfluidique pour une taille et une forme contrôlées, puis lyophilisés à l’aide de méthodes empêchant la fracturation du réseau de polymères. Lors de la réhydratation, les microgels lyophilisés conduisent à des fractions de particules contrôlées dans les échafaudages MAP. La mise en œuvre de ces méthodes de lyophilisation sur microgel a conduit à des études reproductibles montrant l’effet de la fraction de particules sur la diffusion des macromolécules et la propagation cellulaire. Le protocole suivant couvrira la fabrication, la lyophilisation et la réhydratation de microgels pour contrôler la fraction de particules dans les échafaudages MAP, ainsi que le recuit des microgels par réticulation bio-orthogonale pour la culture cellulaire 3D in vitro.

L’objectif de ce protocole est de démontrer la préparation d’échafaudages de particules microporeuses recuites (MAP) avec un schéma de réticulation bio-orthogonale ainsi que des fractions de particules contrôlées pour la culture cellulaire 3D. Tout d’abord, HA a été modifié avec des groupes pendants norbornène à utiliser à la fois dans la formation de microgel et l’interconnexion pour former des échafaudages MAP. À l’aide de ces méthodes, environ 31 % des unités de répétition HA ont été modifiées avec succès avec une poi...

La minimisation de la variabilité de la fraction de particules dans les échafaudages granulaires facilite l’expérimentation reproductible. Ce travail décrit des méthodes de génération d’échafaudages granulaires avec des fractions de particules contrôlées pour des applications d’ingénierie tissulaire in vitro .

Contrôle de la fraction de particules dans des échafaudages de particules microporeuses recuites pour culture cellulaire 3D

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo ...

Les matériaux granulaires, tels que les échafaudages MAP, sont des matériaux injectables poreux fabriqués à partir de particules d’hydrogel de taille microscopique interconnectées. Le contrôle de la fraction des particules est essentiel aux propriétés des matériaux et aux réponses cellulaires. Les fractions de particules variables dans les échafaudages MAP entraînent une gamme de propriétés d’échafaudage et de réponses cellulaires, mais cette technique permet aux utilisateurs de définir la fraction de particules finale dans les échafaudages MAP qu’ils créent.Les échafaudages MAP peuvent être utilisés pour favoriser la réparation et la régénération de plaies complexes, ainsi que pour administrer des médicaments. La fraction particulaire, par exemple, affecte le taux et le degré d’infiltration et de régénération cellulaires. Cette méthode peut être appliquée à toutes les classes d’hydrogels granulaires.Maintenant que nous pouvons fabriquer des échafaudages MAP avec des fractions de particules contrôlées par l’utilisateur, nous pouvons étudier de manière reproductible la bioactivité de ces matériaux et étudier des réponses cellulaires uniques, telles que le confinement. La mise en place de la génération de microgel microfluidique nécessite du temps et de la patience pour apprendre les techniques. Il est préférable d’avoir plusieurs appareils préparés et prêts au cas où vous rencontreriez des problèmes avec la configuration.Commencez par la production microfluidique d’acide hyaluronique, ou HA, et de microgels de norbornène, ou NB. Avant de sécher les microgels, pesez un tube à vis cryo-sûr. Ensuite, dans une hotte stérile, transférer les microgels lavés et purifiés dans un tube à vis cryo-sécuritaire à l’aide d’une pipette volumétrique.Ajouter 70% d’éthanol aux microgels purifiés et bien mélanger. Centrifuger le tube pendant cinq minutes à 5 000 g. Aspirer le surnageant et ajouter 70% d’éthanol.Bien mélanger et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, centrifuger brièvement pour s’assurer que les microgels sont au fond du tube. Ajouter de l’azote liquide dans un récipient cryogénique et placer le tube de microgels pour qu’il soit congelé.Après cinq à 10 minutes, retirez le tube de microgels avec une pince. Retirez rapidement le capuchon et couvrez le tube avec un mouchoir en papier de qualité laboratoire. Fixez le tissu avec un élastique et transférez-le dans un récipient ou une chambre de lyophilisation.Chargez l’échantillon sur le lyophilisateur en suivant les instructions du fabricant et lyophilisez à 0,066 Torr et moins 63 degrés Celsius. Pesez les microgels lyophilisés du tube avant de les conserver à température ambiante. Mélanger le polydiméthylsiloxane, ou base élastomère PDMS avec l’agent de durcissement à un rapport de 10 à un en masse.Verser le mélange PDMS dans une grande boîte de Petri en plastique et dégazer dans le dessiccateur pendant 30 minutes, ou jusqu’à ce que toutes les bulles aient disparu. Une fois que toutes les bulles ont disparu, placez soigneusement le moule imprimé en 3D dans le PDMS pour minimiser la formation de nouvelles bulles. Placer au four à 60 degrés Celsius pendant deux heures pour durcir le PDMS.Après le durcissement, utilisez un couteau ou une lame de rasoir pour tracer doucement autour du périmètre du dispositif de culture et retirez soigneusement la moisissure. Utilisez un poinçon de biopsie de quatre millimètres pour retirer tout PDMS du fond des puits. Coupez les appareils pour qu’ils s’adaptent sur un couvercle en verre.Utilisez du ruban adhésif pour enlever la poussière de la face inférieure du dispositif de culture. Placez le couvercle en verre propre et le dispositif de culture sur une plaque chauffante à 135 degrés Celsius pendant 15 minutes pour éliminer l’humidité. Dans une hotte, utilisez un pistolet à plasma corona haut sur le couvercle en verre et le côté inférieur de l’appareil pendant 30 secondes.Ensuite, liez rapidement les surfaces traitées ensemble. Appliquez doucement une pression pour assurer une bonne étanchéité entre le dispositif de culture et le couvercle en verre. Placez l’appareil dans un four à 60 degrés Celsius pendant la nuit pour sécuriser le lien.Le lendemain, autoclaver l’appareil à stériliser avant utilisation in vitro. Ensuite, préparez les composants de l’échafaudage microporeux recuit, ou MAP, en fonction de la fraction de particules souhaitée pour la culture cellulaire dans des échafaudages MAP. Peser les microgels lyophilisés pour déterminer la masse des microgels.Reconstituez ensuite les microgels dans 84% du volume MAP final du milieu cellulaire en fonction du pourcentage de poids MAP choisi. Laissez les microgels gonfler pendant 20 minutes. Dissoudre l’acide hyaluronique, ou HA-tétrazine, et le milieu cellulaire dans 16% du volume final de MAP.Une fois que les cellules ont atteint la confluence désirée, soulevez et comptez les cellules. Transférer 10 000 cellules par microlitre de MAP dans un nouveau tube. Centrifuger les cellules et aspirer le surnageant de la pastille sans aspirer les cellules.Ajouter les microgels et les agents de réticulation à la pastille à l’aide d’une pipette à déplacement. Bien mélanger et ensemencer 10 microlitres par puits. Pipeter dans un mouvement circulaire pour répartir uniformément le mélange dans le puits.Laisser les microgels recuit à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes avant d’ajouter des milieux cellulaires pour remplir les puits. Maintenez les cultures 3D à 37 degrés Celsius et changez de support si nécessaire. Pour éviter d’aspirer l’échafaudage, stabilisez la pointe de la pipette le long de la crête du puits supérieur.Aux points temporels souhaités, fixer les échantillons en remplaçant le média par 50 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % par puits pendant 30 minutes à température ambiante. Lavez les échantillons trois fois avec 50 microlitres de PBS, ou tampon préféré, et procédez à l’immunofluorescence, ou coloration par fluorescence en utilisant 50 microlitres par puits ainsi que le volume de travail. Il a été démontré que les dispositifs microfluidiques avec une région de focalisation d’écoulement produisaient des microgels HA-NB de 50 ou 100 microns de diamètre.Le milieu de lyophilisation des microgels a été optimisé pour minimiser la formation de cryogel en utilisant de l’éthanol à 70%. Cependant, d’autres milieux, tels que l’alcool isopropylique, l’eau et l’acétonitrile, peuvent être utilisés de manière interchangeable pour faciliter la formation de cryogel. Pour faciliter l’interconnexion bio-orthogonale des microgels HA-NB, un agent de réticulation linéaire HA-tétrazine a été synthétisé.La spectroscopie RMN du proton montre une modification réussie de 11% des unités de répétition HA avec un groupe pendentif tétrazine. Le produit de microgel lyophilisé séché a été réhydraté avec des volumes spéciaux et recuit pour obtenir différents pourcentages de poids de microgels dans des échafaudages MAP. Ces pourcentages pondéraux de microgels dans les échafaudages MAP correspondaient à des fractions de particules uniques.La culture cellulaire dans des échafaudages MAP est illustrée ici. Les cellules en culture 3D dans des échafaudages MAP ont été fixées le cinquième jour, colorées et imagées sur un microscope confocal. Les coupes Z uniques montrent des différences dans la croissance cellulaire et les échafaudages comprenant différents pourcentages de poids MAP.Sélectionnez vos milieux de lyophilisation de manière appropriée selon que vous voulez des cryogels, ou non. Ne sautez pas les étapes d’incubation, afin que vos microgels aient suffisamment de temps pour gonfler dans le média. Des techniques standard telles que la microscopie, la cytométrie en flux, le séquençage de l’ARN, etc. peuvent être utilisées pour évaluer les réponses cellulaires dans ces matériaux granulaires avec des porosités définies.

controlling-particle-fraction-microporous-annealed-particle-scaffolds

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Nous présentons deux procédés pour la microfabrication de puces polymère poreux pour la culture cellulaire en trois dimensions. Le premier est gaufrage à chaud combiné avec un processus de soudage à la vapeur de solvant. Le second utilise un procédé développé récemment microthermoforming combinée à la technologie d'ions piste menant à une simplification significative de la fabrication.

La microfabrication de Chip entreprises Échafaudages pour la culture cellulaire en trois dimensions

PH biocompatibles adaptés nanocapteurs sol-gel peuvent être incorporés dans le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) échafaudages électrofilées. Les échafaudages d'auto-déclaration produits peuvent être utilisés pour la surveillance in situ des conditions micro-environnementales dans tout la culture de cellules sur l'échafaud. Cela est bénéfique que la construction cellulaire 3D peut être contrôlé en temps réel sans perturber l'expérience.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Cet article décrit une gamme de configurations pour l’ensemencement de cellules souches mésenchymateuses humaines sur des matériaux, dans ce cas des fils électrofilés, qui ne couvrent pas la base des plaques de puits de culture standard afin de maximiser et de quantifier le nombre de cellules qui se fixent initialement par rapport à la densité d’ensemencement connue.

Optimisation Fixation des mésenchymateuses humaines cellules souches sur Poly (ε-caprolactone) électrofilées Yarns

Les progrès des technologies des biomatériaux permettent le développement de constructions tridimensionnelles de type multicellulaire. Nous avons développé des protocoles d’électrofilage pour produire trois échafaudages individuels afin de cultiver les principales cellules structurelles des voies respiratoires afin de fournir un modèle 3D in vitro de la paroi bronchiole des voies respiratoires.

Adapter le processus Électrofilage de fournir trois environnements uniques pour un Tri-couches<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle du mur Airway

Nous présentons ici un protocole afin d’obtenir des systèmes 3D-culture en auto-assemblage peptide échafaudages pour promouvoir la différenciation des chondrocytes articulaires humains dédifférenciées en tissu cartilagineux.

Culture de cellules mammifères dans les échafaudages de Peptide en trois dimensions

Nous présentons une procédure pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans une matrice extracellulaire 3D pour obtenir une formation de modèles reproductibles. Un dispositif cube contenant deux hydrogels différentes est utilisé pour atteindre multidirectionnel d’imagerie pour la formation de tissu motif.

Contrôle de Cluster cellule 3D initial dans un dispositif hybride Gel Cube modèle répétable Formations

Les tiges de microgel avec des groupes réactifs complémentaires sont produites via la microfluidique avec la capacité de s’interconnecter en solution aqueuse. Les microgels anisométriques se coincent et s’interconnectent en constructions stables avec des pores plus grands par rapport aux systèmes sphériques. Les microgels modifiés avec GRGDS-PC forment des constructions 3D macroporeuses qui peuvent être utilisées pour la culture cellulaire.

Échafaudages 3D macroporeux interconnectés à partir de tiges de microgel

Ce protocole décrit un ensemble de méthodes de synthèse des blocs de construction de microgel pour les échafaudages de particules microporeuses recuites, qui peuvent être utilisés pour une variété d’applications de médecine régénérative.

Synthèse microfluidique de blocs de construction de microgel pour échafaudage de particules microporeuses recuites

Cet ouvrage détaille la préparation de la 3D de fibrine échafaudages pour la culture et la différenciation des cellules souches plutipotent. Ces échafaudages peuvent être utilisés pour cribler les effets de divers composés biologiques sur le comportement des cellules souches ainsi que modifié pour contenir des systèmes de délivrance de médicaments.

Préparation de la 3D pour les applications de fibrine Échafaudages CULTURE DE CELLULES SOUCHES

Vélocimétrie d'image micro-particule (μPIV) est utilisé pour visualiser des images paires de micro-particules ensemencées dans des flux sanguins qui sont en corrélation croisée pour donner un profil de vitesse précise. Taux de cisaillement, de la vitesse maximale, la forme du profil de vitesse, et la vitesse d'écoulement, dont chacun a des applications cliniques, peuvent être obtenus à partir de ces mesures.

Micro-particules vélocimétrie par image de profil de vitesse pour mesures de débits Micro sang

Découvrez comment contrôler la fraction de particules dans des échafaudages MAP microporeux pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthode améliore la reproductibilité des propriétés des biomatériaux et des réponses cellulaires.

Contrôle de la fraction de particules dans des échafaudages de particules microporeuses recuites pour culture cellulaire 3D

Explorer plus de vidéos