Isolement, activation et expansion des lymphocytes T par flottation à partir d’échantillons de cellules mononucléaires du sang périphérique humain à l’aide de microbulles

Le protocole d’activation et d’expansion des microbulles est important car il répond à un besoin majeur non satisfait dans la recherche et la fabrication de thérapies cellulaires, améliorant la persistance et l’efficacité des thérapies cellulaires. La technique de sélection positive, d’activation et d’expansion basée sur la flottabilité d’Akadeum limite la surstimulation et l’épuisement ultérieur des lymphocytes T pendant les flux de travail d’activation et d’expansion. Pour commencer, incuber 3 fois 10 au 8ème PBMC obtenu commercialement dans 2,5 millilitres de tampon de séparation, avec anticorps anti-CD3 biotinylé.

Mélangez délicatement les composants par pipetage et incuberez-les à température ambiante pendant 10 minutes. Ajouter des microbulles d’avidine dépouillées aux cellules dans un rapport de 0,5 à 1, selon les instructions du fabricant. Et mélanger à l’aide d’un rotateur commercial de bout en bout à 20 RPM pendant 10 à 15 minutes à température ambiante.

Centrifuger à 400g pendant cinq minutes à température ambiante. Après centrifugation, les cellules sélectionnées positivement seront au sommet de la suspension avec les microbulles d’avidine dépouillées, et les cellules non sélectionnées restantes seront dans la pastille cellulaire au fond du tube. À l’aide d’une pipette en verre de neuf pouces, insérez l’embout sous la couche de cellule à bulles au bas du tube.

Aspirez la pastille cellulaire et le subnageant avec une pipette électronique et transférez-les dans un nouveau tube. Remettez en suspension la couche de cellule à bulles laissée dans le tube d’origine dans un millilitre de milieu complet à cellules T. Centrifuger le subnageant à 400g pendant cinq minutes à température ambiante et l’utiliser pour mesurer indirectement la pureté et la récupération.

Après centrifugation des cellules subnageantes et non sélectionnées, aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un millilitre de milieu avant de compter. À l’aide d’un compteur de cellules automatisé, comptez les cellules du subnageant avec la microscopie à fond clair et déterminez le nombre de cellules capturées dans la couche de cellules à bulles, comme décrit dans le manuscrit texte. Pour créer l’avidine et les microbulles conjuguées anti-CD28 dépouillées, ajoutez l’anticorps anti-CD28 biotinylé aux microbulles commerciales et mélangez en utilisant une rotation de bout en bout pendant au moins deux heures.

Ajouter les microbulles de streptocoque conjuguées anti-CD28 à la suspension de cellules à bulles préparées dans un rapport de 1,5 à 1. Mélangez les composants en effectuant une rotation de bout en bout pendant 15 minutes. Ajustez ensuite le volume total à 2 millions de cellules par millilitre avec un milieu complet de cellules T, ou un autre milieu souhaité en fonction du nombre de cellules obtenu.

Distribuez un millilitre de cellules activées dans une plaque de 24 puits et incuber dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Après 24 heures, ajouter de l’IL-2 et de l’anti-CD3 soluble pour encourager une expansion ultérieure, calculé en utilisant le nombre initial de cellules plaquées au jour zéro. Replacez la plaque cellulaire dans l’incubateur de dioxyde de carbone humidifié et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Retirer la moitié du milieu du médium tous les deux jours. Remplacez-le par un milieu de cellules T frais et complet et ajoutez de l’IL-2 à une concentration de 50 unités par millilitre. Comptez les lymphocytes T deux fois par semaine pour évaluer la densité cellulaire.

Lorsque la densité cellulaire dépasse 2 fois 10 à la 6ème, ou 2,5 fois 10 à la 6ème cellule par millilitre, transférez-les dans un récipient plus grand, en les diluant à 5 fois 10 à la 5ème cellule par millilitre. Mélangez délicatement le contenu de chaque puits en tuyautant de haut en bas. Retirez tout le contenu du puits, y compris les microbulles, et transférez-les dans un tube de 1,5 millilitre.

Lavez bien chaque puits avec 400 microlitres de DPBS sans calcium et sans magnésium et transférez la solution dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifuger le tube à 400g pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 50 microlitres de tampon de séparation.

Ensuite, divisez 50 microlitres de suspension cellulaire en 25 microlitres chacun pour l’activation et l’épuisement. Colorez les cellules avec un cocktail de coloration d’anticorps d’activation et d’épuisement et incuberez-les pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ajouter un millilitre de tampon de séparation, mélanger doucement et centrifuger pour éliminer l’excès d’anticorps.

Aspirer complètement le surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon de séparation et transférez-la dans un récipient approprié pour l’analyse par cytométrie en flux. Des augmentations du nombre de lymphocytes T viables et de lymphocytes T transgéniques positifs ont été observés entre l’échantillon témoin et les cellules ayant reçu une costimulation par microbulles.

Une augmentation des populations de cellules effectrices a également été observée dans les échantillons de microbulles. Les lymphocytes T activés viables expriment une augmentation du marqueur d’activation précoce CD69 et du marqueur d’activation moyen à tardif CD25. Le nombre total et le pourcentage de marqueurs d’épuisement PD1 positifs étaient également significativement plus élevés dans les échantillons de cellules ayant reçu une co-stimulation par microbulles.

Un mélange et une distribution appropriés des microbulles sont essentiels pour assurer un dosage précis, car les microbulles flottent rapidement à la surface sans agitation. Nous nous attendons à ce qu’il le fasse en permettant une croissance rapide d’une grande population de cellules T avec une activité plus élevée que les cellules T plus épuisées fréquemment observées dans d’autres méthodes.