Fractionnement subcellulaire pour l’isolement des composants synaptiques du cerveau murin

Les synapses sont les unités de calcul de base du cerveau. La méthode présentée est un outil simple et précieux pour étudier les synapses et leurs processus moléculaires et aussi pour comprendre comment elles pourraient être modifiées dans divers troubles cérébraux. Cette technique implique un fractionnement des structures synaptosomes isolées du cerveau.

Cela permet au chercheur de capturer des effets qui peuvent être compartimentés au niveau de la synapse. Les niveaux de distribution et l’activité de protéines spécifiques peuvent également être analysés avec une résolution sous-synaptique. Cette procédure prend environ 11 heures à un chercheur individuel à compléter si tout se passe bien.

Une personne qui n’a jamais effectué cette technique peut avoir des difficultés avec la longueur de cette procédure car cela prendra naturellement un peu plus de temps pour quelqu’un qui n’est pas familier avec les étapes. En raison de la longueur de cette journée expérimentale, nous vous recommandons fortement d’effectuer les dissections avec un partenaire qui peut vous aider à faciliter la collecte rapide de tissus pour vous assurer qu’aucun échantillon ne repose sur la glace plus longtemps que nécessaire. Nous recommandons également de préparer des tampons et des matériaux de paillasse la veille de cette expérience afin que tout soit à portée de main en cas de besoin.

Cela est particulièrement vrai pour les tubes collecteurs. Plusieurs aliquotes d’un total de 11 fractions subcellulaires seront collectées à la fin de cette procédure. Donc, avoir ces tubes clairement étiquetés à l’avance rendra votre journée beaucoup plus facile.

Pour commencer, insérez de fins ciseaux sous la peau à l’incision de décapitation à une profondeur péri-crânienne et faites une incision sagittale moyenne jusqu’à la suture intranasale pour rétracter le cuir chevelu du crâne. En travaillant de la zone occipitale vers chaque aspect temporal, coupez le fascia et le muscle pour exposer la surface externe du crâne au-delà de chaque méat acoustique externe. Fixez le cuir chevelu et l’aspect rostral du crâne avec la main non dominante et de l’autre main, insérez de fins ciseaux de deux millimètres dans la face caudale du foramen magnum où la moelle épinière est visible sortant.

Faites une incision médiane jusqu’à ce que les ciseaux atteignent la surface interne de l’os intrapariétal. Changez l’angle des ciseaux pour que les lames soient parallèles à la surface dorsale du crâne. Continuez à faire avancer l’incision médio-sagittale rostralement à travers les os pariétaux et frontaux en utilisant les sutures sagittales et interfrontales comme guide et terminez l’incision juste au-delà de la suture internasale.

Ensuite, faites une incision perpendiculaire de trois millimètres à l’os nasal, rostrale à la suture internasale, en plaçant les ciseaux perpendiculaires au crâne avec chaque lame positionnée à une suture prémaxillaire nasale et en faisant une coupe uniforme. Tout en sécurisant l’aspect rostral, utilisez un côté d’une paire de pinces texturées pour soulever doucement le crâne du cerveau, puis soulevez-le latéralement et ventralement. Répétez l’opération le long de la ligne médiane au besoin, puis pour l’autre hémisphère jusqu’à ce que toute la surface du cerveau soit exposée.

À l’aide d’une pince incurvée ou d’une fine spatule, soulevez doucement le côté rostral du cerveau. Coupez les nerfs optique et crânien pour compléter l’excision du crâne. Homogénéiser les cerveaux à l’aide d’un homogénéisateur en verre placé sur un bain de glace en 12 passes ascendantes à 500 tr / min.

Faites une brève pause à chaque descente pour assurer une homogénéisation complète du tissu. Transférer l’homogénat cérébral total dans un tube à centrifuger à fond rond à grande vitesse de 14 millilitres et le faire tourner à 800 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir le surnageant appelé S1.transférer S1 dans un nouveau tube à centrifuger, jeter la pastille. Prendre deux aliquotes de cinq microlitres de S1 pour le dosage de l’acide bicinchoninique et deux aliquotes de 100 microlitres de S1 pour le transfert Western.

Faites tourner S1 à 9 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir le surnageant somal synaptique, ou S2, et la pastille brute de synaptosome ou P2. Prendre deux aliquotes de 10 microlitres de S2 pour le dosage de l’acide bicinchoninique et deux aliquotes de 500 microlitres de S2 pour le transfert Western. Jeter le surnageant après avoir obtenu les aliquotes. après centrifugation à 9 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, obtenir le surnageant S2' et le synaptosome lavé, P2'Jeter le surnageant et resuspendre P2'dans trois millilitres de tampon A.Éviter de remettre en suspension la partie rouge foncé au fond de la pastille, qui contient principalement des mitochondries.

Prélever deux aliquotes de 20 microlitres de P2' pour le dosage de l’acide bicinchoninique et deux aliquotes de 100 microlitres de P2' pour le transfert Western. Pour la lyse hypotonique du synaptosome lavé, ajouter neuf volumes de tampon B refroidi pour remettre en suspension P2' et homogénéiser le synaptosome dans un homogénéisateur en verre. Transférer les échantillons dans des tubes centrifugeuses coniques à bouchon de 50 millilitres et les faire pivoter sur un revolver à tube dans une chambre froide de quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Centrifuger le P2' lysé à 25 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir le surnageant de lyse ou LS1, et la pastille de lyse contenant des membranes synaptosomales, ou LP1. Prendre deux aliquotes de 50 microlitres de LS1 pour le test de l’acide bicinchoninique et deux aliquotes de 400 microlitres de LS1 pour le transfert Western. Transférer le LS1 dans un tube centrifuge recouvert pour une ultracentrifugation.

Centrifuger LS1 dans un rotor ultracentrifuge à angle fixe à 100 000 G pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir un surnageant synaptique du cytosol, ou LS2, et une pastille de vésicule synaptique, ou LP2. Resuspendre le LP2 dans 500 microlitres de tampon A et à l’aide d’une aiguille de calibre 23 et d’une seringue d’un millilitre LP deux avec trituration douce. Prendre deux aliquotes de 10 microlitres de LP2 pour le test de l’acide bicinchoninique et deux aliquotes de 250 microlitres de LP2 pour le transfert Western.

Transférer environ 30 millilitres de LS2 dans des unités de filtration centrifuges avec une coupure de 10 mili-Dalton et concentrer le LS2 à environ 0,5 millilitre en tournant à 5 000 G pendant une heure à quatre degrés Celsius. Prendre deux aliquotes de 10 microlitres de LS2 concentré pour le test bicinchoninique et deux, 250 aliquotes de 250 microlitres de LS2 concentré pour le transfert Western. Resuspendre LP1 dans un millilitre de tampon B, et prendre deux aliquotes de 10 microlitres de LP1 pour le dosage de l’acide bicinchoninique et deux aliquotes de 50 microlitres de LP1 pour le transfert Western.

Ajustez le LP1 restant à un volume final de 7,5 millilitres et à une concentration finale de saccharose de 1,1 molaire avec tampon B et tampon C.Ensuite, transférez 7,5 millilitres du LP1 remis en suspension dans un tube ultracentrifuge de 14 millilitres. Superposez soigneusement le LP1 avec 3,75 millilitres de tampon D et marquez le dessus de la solution avec un stylo. Ensuite, superposez avec environ 1,25 millilitre de tampon A.Et marquez de la même manière le haut de la solution avec un stylo.

Équilibrez les tubes pour l’ultracentrifugation en poids, et non en volume, avec l’ajout goutte à goutte du tampon A à 10 milligrammes près. Centrifuger à 48 000 G pendant 2,5 heures à quatre degrés Celsius dans un rotor ultracentrifuge à godet oscillant et acquérir des images des gradients intacts pour documenter le caractère distinctif de chaque interface de saccharose et le succès du fractionnement. Retirez soigneusement la couche superficielle de saccharose de 320 millimolaires et récupérez la fraction de myéline à l’interface de saccharose millimolaire de 320 millimolaires et 855 millimolaires dans un volume de 800 microlitres.

Pipeter à partir de la paroi des tubes de manière circulaire pour s’assurer que la fraction complète est recueillie. Récupérez ensuite la fraction SPM à l’interface de saccharose millimolaire de 855 millimolaires et 1,1 millimolaire dans un volume de 1000 microlitres. Aspirer soigneusement le saccharose restant et récupérer la pastille mitochondriale en remettant en suspension dans 200 microlitres de tampon B.Diluer la fraction SPM avec deux volumes de tampon B, puis centrifuger dans un rotor à angle fixe dans un tube à centrifuger de 3,5 millilitres.

Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille SPM dans le tampon A pour un volume final de 250 microlitres. Prenez deux, cinq aliquotes de MPS pour le dosage de l’acide bicinchoninique et divisez le MPS restant en deux pour le transfert Western. Les images de microscopie électronique du synaptosome sont montrées dans cette figure.

Un synaptosome contenant des vésicules synaptiques à la fois pré et post synaptiques et des vésicules synaptiques dans une mitochondrie sont montrés ici. L’analyse immunoblot des fractions subcellulaires a été réalisée pour évaluer les marqueurs de pureté des fractions. Par rapport à l’homogénat initial du cerveau entier, l’analyse a révélé l’enrichissement de la n-cadhérine dans la fraction de membrane plasmique synaptique, de l’alpha synucléine dans le cytosol synaptique, de la synaptophysine dans la fraction des vésicules synaptiques et de la protéine basique de la myéline dans la fraction myéline.

Une fois la pureté de la fraction établie, l’immunoblot quantitatif peut être utilisé pour déterminer la localisation des protéines d’intérêt ou interroger les différences dans la distribution des protéines entre les génotypes ou les traitements. Lorsque vous essayez cette procédure, assurez-vous d’utiliser de la verrerie sans détergent afin que le synaptosome intact puisse être recueilli. Aussi, soyez prudent lors de la préparation des gradients de saccharose pour vous assurer d’obtenir des interfaces claires.

Cela vous permettra d’isoler avec succès la fraction de membrane plasmique synaptique. Diverses analyses structurelles et fonctionnelles peuvent être effectuées pour améliorer la qualité des fractions synaptiques telles que la microscopie électronique, l’immunobuvardage, la protéomique et d’autres méthodes moléculaires. La libération de neurotransmetteurs ou des tests enzymatiques peuvent également être effectués pour aider à la viabilité métabolique du synaptosome.

L’isolement des structures synaptosomes était une technique de changement de paradigme pour l’analyse de la fonction et de la composition des synapses. Comme nous voyons un dysfonctionnement synaptique précoce dans la neurodégénérescence, la dissection minutieuse des changements moléculaires au niveau de la synapse nous aidera à explorer les mécanismes moléculaires de ces troubles.