Propagation des virus et quantification colorimétrique cellulaire

Ce protocole permet d’identifier et de quantifier le virus Zika sans dépendre de l’effet cytopathique. Cela dépend de la reconnaissance par les anticorps du composant du virus. L’utilisation d’anticorps spécifiques au virus peut aider à identifier différents sérotypes de virus dans des populations mixtes.

Cette méthode présente des avantages par rapport aux tests classiques de formation de plaques. Il est plus rapide et compatible avec les applications à haut débit lors de l’application avec un système d’imagerie automatisé pour un comptage rapide des cellules. Le protocole proposé est très adaptable.

Avec les modifications appropriées, le protocole proposé peut être appliqué à différents types de cellules et cibles virales. Commencez par cultiver des cellules Vero dans un flacon de culture cellulaire de 75 carrés = centimètres qui contient 12 millilitres de DMEM complété par 10% FBS et deux millimoles de L-glutamine. Placez le flacon dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Pour infecter la monocouche cellulaire, utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour retirer le milieu de culture du flacon de culture cellulaire. À l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, rincez deux fois le flacon avec trois millilitres de DPBS. Ensuite, ajoutez deux millilitres de DMEM sans sérum et 20 microlitres d’inoculum du virus Zika dans le flacon de culture cellulaire.

Laissez le flacon incuber à température ambiante pendant une heure en le balançant doucement pour favoriser l’adsorption du virus. À la fin de l’incubation, à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, retirez et jetez soigneusement l’inoculum viral dilué du flacon de culture cellulaire. Rincez deux fois le flacon de culture cellulaire avec trois millilitres de DPBS.

Ensuite, ajoutez 12 millilitres de milieu d’entretien dans le flacon de culture cellulaire pour maintenir les cellules infectées. Incuber les cellules Vero infectées pendant trois jours dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après trois jours d’incubation, utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour prélever le surnageant de culture cellulaire contenant le virus Zika dans un tube à centrifuger de 50 millilitres.

Pour la quantification du virus, ensemencez les cellules Vero dans des plaques désignées et laissez-les se développer pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec une atmosphère de dioxyde de carbone de 5 %. Préparez six tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 millilitre pour chaque plaque afin d’effectuer une dilution en série dix fois, y compris un tube supplémentaire pour un contrôle négatif. Pour une configuration de plaque à 24 puits, ajoutez 450 microlitres de DMEM sans sérum dans les six tubes de microcentrifugation.

Pour une configuration de plaque à 96 puits, distribuez 135 microlitres de DMEM sans sérum dans six tubes supplémentaires. Pour effectuer une dilution en série pour l’expérience sur plaque à 24 puits, ajoutez 50 microlitres de stock de virus Zika dans le tube de 10 à moins un tube contenant 450 microlitres de DMEM sans sérum. Pour l’expérience sur plaque à 96 puits, ajoutez 15 microlitres de bouillon de virus Zika dans le tube de 10 à moins un tube contenant 135 microlitres de DMEM sans sérum.

Vortex chaque tube pour bien mélanger le virus et le milieu, assurant une répartition uniforme des particules virales dans la dilution. À l’aide d’un embout de pipette neuf, remettre en suspension le tube de 10 à moins un et transférer 50 et 15 microlitres de virus Zika dilué dans le tube de 10 à moins deux comme deuxième dilution dix fois pour les plaques à 24 et 96 puits, respectivement. Retirez et jetez le milieu d’état pour chaque puits de la plaque appropriée.

Rincez chaque puits avec DPBS deux fois pour éliminer les résidus. En commençant par la dilution la plus élevée, ajoutez l’inoculum de virus dilué en série dans les puits, en allant vers la dilution la plus faible. Après une heure d’incubation, retirez et jetez la suspension virale des puits, en commençant par la concentration la plus faible à la plus élevée.

Lavez les cellules infectées avec du DPBS deux fois pour éliminer toute trace de suspension virale. Recouvrir le puits de DMEM et de carboxyméthylcellulose à faible viscosité à 1,5 %. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.

Après l’incubation, retirez et jetez le milieu de recouvrement et lavez les cellules trois fois avec du PBS. Pour la plaque à 96 puits, utilisez une pipette multicanaux pour retirer et jeter le milieu de recouvrement, et lavez les cellules trois fois avec 60 microlitres de PBS par puits. Ajouter 4% de paraformaldéhyde pour fixer les cellules et incuber la plaque à température ambiante pendant 20 minutes.

Après 20 minutes, jetez le paraformaldéhyde et lavez les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez 3,3'diaminobenzidine peroxydase substrat et incubez la plaque pendant 30 minutes à l’obscurité. Après 30 minutes, arrêtez la réaction en lavant les puits avec de l’eau.

Faites sécher les plaques à l’air libre pendant la nuit et procédez au dénombrement des foyers. Comptez les foyers pour chaque répétition de la dilution sélectionnée et calculez le nombre moyen de foyers pour chacun. Les cellules Vero infectées ont été fixées à différents moments après l’infection.

Pour la plaque à 2 puits, la première apparition de foyers viraux a été observée 48 heures après l’infection, bien que la taille des foyers soit trop petite pour être comptée avec précision. Après 96 heures après l’infection, il n’y avait aucun signe de détachement cellulaire. À 60 heures après l’infection, la taille des foyers avait augmenté à un niveau optimal pour le comptage.

Par la suite, au fil du temps, les foyers sont devenus plus grands et ont commencé à fusionner ou à se chevaucher les uns avec les autres en intensité, formant des grappes qui se sont agrandies au fil du temps. Par conséquent, les foyers formés 60 heures après l’infection ont été choisis pour déterminer le titre du virus Zika dans une plaque à 24 puits. Pour la plaque à 96 puits, les cellules sont restées intactes 72 heures après l’infection.

L’apparition de foyers de virus a été observée pour la première fois 24 heures après l’infection. Cependant, jusqu’à 36 heures après l’infection, la taille des foyers était trop petite. La taille optimale des foyers a été atteinte 48 heures après l’infection.

À ces derniers moments, on a observé des foyers qui se chevauchaient ou qui se confondaient, et le nombre de foyers qui se chevauchaient augmentait avec le temps. Les foyers formés 48 heures après l’infection ont été choisis pour déterminer le titre viral des isolats du virus Zika. Ajoutez doucement du DPBS sur le côté de chaque puits et faites basculer les plaques d’avant en arrière une à trois fois pour éliminer les débris cellulaires et l’excès de média.

Cette technique profitera grandement aux chercheurs dans la recherche sur le virus Zika et peut également être largement adaptée pour quantifier d’autres virus cliniquement importants, ce qui en fait un outil précieux pour la surveillance et le diagnostic du virus.