Name: Cartographie des interactions du génome 3D des mammifères avec Micro-C-XL (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Découvrez la cartographie de l'organisation tridimensionnelle du génome à résolution nucléosomique avec la technique Micro-C-XL. Cette méthode permet d'étudier les interactions chromatiniennes à courte distance avec un excellent rapport signal/bruit.

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Nous remercions Christl Gaubitz et Kathleen Stewart-Morgan pour leur lecture critique du manuscrit. Nous remercions Anja Groth et le laboratoire Groth pour leur soutien dans la création de notre laboratoire. Nous remercions le personnel de la plateforme de génomique CPR/reNEW pour son soutien : H. Wollmann, M. Michaut et A. Kalvisa. Le Centre de médecine des cellules souches de la Fondation Novo Nordisk (reNEW) est soutenu par la subvention numéro NNF21CC0073729 de la Fondation Novo Nordisk. Le Centre de recherche sur les protéines (CPR) de la Fondation Novo Nordisk est soutenu par la subvention numéro NNF14CC0001 de la Fondation Novo Nordisk. Nous remercions le laboratoire Brickman du Novo Nordisk Center for Stem Cell Medicine, reNEW Copenhagen, pour les cellules ES de souris.

<ol><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-C+XL%3A+Assaying+chromosome+conformation+from+the+nucleosome+to+the+entire+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-C XL: Assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome.</a> Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).</li>
<li>Hsieh, T. -H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nucleosome+resolution+chromosome+folding+in+yeast+by+Micro-C%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C.</a> Cell. 162 (1), 108-119 (2015).</li>
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<li>Hsieh, T. -H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+3D+landscape+of+transcription-linked+mammalian+chromatin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding.</a> Molecular Cell. 78 (3), 539-553 (2020).</li>
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<li>Goloborodko, A., Venev, S., Abdennur, N., Di Tommaso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirnylab%2Fdistiller-nf%3B+v033%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Mirnylab/distiller-nf; v033.</a> Zenodo. , (2019).</li>
<li>Venev, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open2c%2Fcooltools%3A+v0.4.1%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Open2c/cooltools: v0.4.1.</a> Zenodo. , (2021).</li>
<li>Abdennur, N., Mirny, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooler%3A+Scalable+storage+for+Hi-C+data+and+other+genomically+labeled+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cooler: Scalable storage for Hi-C data and other genomically labeled arrays.</a> Bioinformatics. 36 (1), 311-316 (2019).</li>
<li>Zhang, S., Übelmesser, N., Barbieri, M., Papantonis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer-promoter+contact+formation+requires+RNAPII+and+antagonizes+loop+extrusion%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Enhancer-promoter contact formation requires RNAPII and antagonizes loop extrusion.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
<li>Barshad, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II+and+PARP1+shape+enhancer-promoter+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II and PARP1 shape enhancer-promoter contacts.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
<li>Hansen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+classes+of+chromatin+loops+revealed+by+deletion+of+an+RNA-binding+region+in+CTCF%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct classes of chromatin loops revealed by deletion of an RNA-binding region in CTCF.</a> Molecular Cell. 76 (3), 395-411 (2019).</li>
<li>Hua, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+genome+architecture+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining genome architecture at base-pair resolution.</a> Nature. 595 (7865), 125-129 (2021).</li>
<li>Downes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+targeted+3C+interrogation+of+cis-regulatory+element+organization+at+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution targeted 3C interrogation of cis-regulatory element organization at genome-wide scale.</a> Nature Communications. 12, 531(2021).</li>
<li>Goel, V. Y., Huseyin, M. K., Hansen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region+capture+Micro-C+reveals+coalescence+of+enhancers+and+promoters+into+nested+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Region capture Micro-C reveals coalescence of enhancers and promoters into nested microcompartments.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le succès d’une expérience Micro-C dépend de quelques étapes critiques du protocole qui doivent être exécutées avec soin. Tout d’abord, la réticulation avec le réticulant supplémentaire DSG ou EGS peut conduire à l’agrégation de cellules, selon le type de cellule. L’ajout de 0,1 % à 0,5 % de BSA à la réaction de réticulation réduit considérablement l’agrégation sans affecter l’efficacité de la réticulation. Une réticulation inefficace peut entraîner une augmentation des taux d’interactions transchromosomiques qui indiquent des ligaturations aléatoires. La deuxième étape, mais la plus cruciale, de ce protocole est la digestion de la chromatine avec MNase. Une digestion sous-optimale de la chromatine entraîne une ligature de proximité inefficace (sur-digestion) ou une augmentation des taux de dinucléosomes non ligaturés de proximité (sous-digestion). L’efficacité de la réaction de ligature peut être évaluée par électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 1B) et est en outre mieux estimée par séquençage à faible entrée. Si le séquençage à faible niveau d’entrée révèle soit un taux de duplication élevé (ligature inefficace), soit une augmentation des taux de dinucléosomes, le degré de digestion de la MNase doit être réévalué. Notamment, la perte d’échantillon lors de l’exécution du protocole peut entraîner une réduction de la complexité de la bibliothèque. La concentration d’un échantillon est mieux évaluée après la purification de l’ADN (étape 5.3) ou par PCR minimale (étape 8). Le rendement total d’ADN de 5 x 106 cellules de mammifères après purification de l’ADN est généralement de >2 μg. La concentration d’ADN doit être contrôlée après la digestion de la MNase, la digestion de l’ExoIII et la purification de l’ADN. Les nucléases endogènes, dont l’abondance est spécifique au type cellulaire et à l’espèce, peuvent être une source de dégradation de l’ADN. De plus, la purification de l’ADN sur colonne peut entraîner une perte d’échantillon en raison de l’incompatibilité avec la SDS des réactions de déprotéination. La précipitation à l’éthanol peut être envisagée si la concentration d’ADN est faible à cette étape.
Étant donné que Micro-C nécessite un titrage MNase spécifique à l’échantillon, il est difficile d’appliquer Micro-C à des populations de petites cellules, telles que de petits organes provenant de divers organismes modèles, d’embryons et de cellules uniques, d’organoïdes ou de biopsies de patients. Ici, Hi-C 3.0 offre une alternative bien établie utilisant une réaction de point final par des endonucléases de restriction spécifiques à la séquence 8,9.
Micro-C est une technologie de conformation chromosomique à haute résolution largement applicable avec une plage dynamique élevée et un faible rapport signal/bruit, ce qui la rend particulièrement adaptée à l’étude des caractéristiques chromosomiques à courte portée 4,5,8, telles que les boucles chromosomiques. La résolution de Micro-C permet de capturer des boucles promoteur-amplificateur, qui sont au-delà de la limite de détection de Hi-C, permettant une analyse plus détaillée de la relation entre l’organisation du génome et la régulation13,14,15. De plus, des stratégies de capture de l’ADN ont récemment été combinées avec Micro-C pour augmenter la résolution spécifique au locus des loci génomiques ciblés à des niveaux sans précédent, révélant de nouvelles informations sur l’ultrastructure du génome 3D16,17,18. En résumé, nous envisageons que Micro-C et ses dérivés seront une technologie clé pour disséquer le rôle du génome 3D dans la régulation transcriptionnelle et, par conséquent, la différenciation et le maintien des types cellulaires.

Micro-C-XL est une technique à l’échelle du génome permettant de mesurer la conformation du génome en 3D avec une résolution de nucléosome. Micro-C-XL s’appuie sur la technologie Hi-C basée sur la ligature de proximité largement utilisée, qui a transformé notre compréhension de l’organisation des génomes 3D1. Micro-C-XL et sa première itération, Micro-C, ont été initialement développés dans Saccharomyces cerevisiae2,3 et ont ensuite été adaptés aux systèmes cellulaires de mammifères, pour lesquels le protocole a démontré tout son potentiel dans la détection de caractéristiques à courte portée du génome 3D, telles que les boucles chromosomiques et les sites d’isolation. Cette version est basée sur des publications récentes sur les mammifères Micro-C-XL 4,5. Comme Micro-C-XL remplace Micro-C, Micro-C-XL est désormais appelé Micro-C dans le manuscrit.
Les principales différences entre Micro-C et Hi-C6 sont les suivantes : 1) fragmentation du génome avec la nucléase micrococcique (MNase) par rapport aux enzymes de restriction et 2) réticulation supplémentaire avec un espacement atomique plus grand entre les groupes réactifs par rapport au formaldéhyde seul. Ces deux étapes contribuent de manière significative à l’amélioration du rapport signal/bruit du Micro-C par rapport au Hi-C conventionnel. La taille de la fragmentation limite la résolution à laquelle l’organisation du génome 3D peut être résolue au cours du protocole de ligature de proximité. La MNase est une nucléase qui digère préférentiellement l’ADN accessible et laisse intact l’ADN protégé par le nucléosome. L’empreinte des nucléosomes à l’aide du séquençage MNase a montré que les nucléosomes recouvrent entièrement la plupart des génomes eucaryotes7. Comme les nucléosomes sont distribués dans tout le génome avec un espacement moyen de 160 à 220 pb, selon l’espèce et le type de cellule, la MNase est l’enzyme idéale pour la cartographie à haute résolution de l’architecture du génome.
L’utilisation d’un agent de réticulation supplémentaire en combinaison avec du formaldéhyde (FA) dans la méthode Micro-C améliore en outre le rapport signal/bruit 2,8. Les agents de réticulation spécifiques aux amines avec des espaceurs atomiques plus longs entre les groupes réactifs facilitent les réticulations protéine-protéine. Il s’agit généralement de glutarate de disuccinimidyle (DSG) ou de succinium bis-succinimidyle d’éthylène glycol (EGS) avec des entretoises de 7,7 Å et 16,1 Å, respectivement. La réduction du bruit par l’EGS ou le DSG est particulièrement apparente dans les expériences avec des taux de fragmentation élevés, tels que Micro-C, et se produit probablement en raison d’une réduction du taux d’événements de ligature aléatoires8.
Un protocole Hi-C 3.0 récemment développé qui utilise la réticulation ESG/DSG et de multiples combinaisons d’enzymes de restriction réduit le bruit dans les expériences Hi-C et améliore considérablement la détection des boucles chromosomiques et des sites d’isolation 8,9. Néanmoins, une comparaison site par site de diverses caractéristiques des données d’interaction a révélé que Micro-C avait une détection supérieure des caractéristiques à courte portée, telles que les boucles chromosomiques et les sites d’isolation, par rapport à Hi-C 3.0 et Hi-C8 conventionnel. Cependant, Hi-C 3.0 améliore la détection des caractéristiques à courte portée et maintient une forte détection de la compartimentation du génome par rapport à Hi-C conventionnel. En résumé, le choix d’une méthode de capture de conformation chromosomique doit être déterminé par la question objective et biologique.
Ici, nous fournissons un protocole étape par étape pour des expériences Micro-C réussies qui peuvent démêler l’organisation du génome 3D.

<table><tbody><tr><td>1 mM de biotine dATP</td><td>Jenna Bioscience&nbsp ;</td><td>NU-835-Bio14-S</td><td></td></tr><tr><td>1 mM Biotine dCTP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-809-BioX-S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>NEB</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>N0443S</td><td></td></tr><tr><td>10 U/ml T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>100 U/L Exonucléase III</td><td>NEB</td><td>M0206L</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 1.1</td><td>NEB</td><td>B7001S</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2.1</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA Ligase buffer&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>B0202A</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS sans Mg2+ et Ca2+</td><td>ThermoFisher&nbsp ;</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>1x LIF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2_Mercaptoethanol 50 mM&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>0,1 mM de b-mercaptoéthanol</td></tr><tr><td>37 % Formaldéhyde&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td>Mise en garde. Voir les fabricants MSDS</td></tr><tr><td>400 U/ml T4 DNA Ligase&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>5 U/ml Klenow Fragment</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BIO-RAD</td><td>1613102</td><td>Attention. Voir fabricants MSDS</td></tr><tr><td>BSA 20mg/ml</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cell counter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Attention. Voir les fabricants MSDS</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Aimant</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Désigné comme : aimant aimant pour tubes de 1,5 ml</td></tr><tr><td>DynaMag-PCR Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>492025</td><td>référé comme : aimant aimant pour tubes PCR</td></tr><tr><td>EDTA Ultrapure 0,5M pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>EGTA Ultrapure 0,5 M pH 8,0</td><td>BioWorld</td><td>40121266-1</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 96 %&nbsp ;</td><td>VWR Chemicals</td><td>20824365</td><td>système de contrôle de la qualité</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS)</td><td>ThermoFisher</td><td>21565</td><td></td></tr><tr><td>Fetl Bovin Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>15 %</td></tr><tr><td>FBS Gel Colorant de chargement violet (6X)</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Glycine&nbsp ;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1067.0500</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la protéinase d’arrêt (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>78430</td><td>Mise en garde. Voir les fabricants MSDS IGEPAL</td></tr><tr><td>CA-630 (NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>18896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Nucléase micrococcique (MNase)</td><td>Cellules</td><td></td> souches embryonnaires de souris Worthington LS004798<td></td></tr><tr><td>.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos pour Illumina (amorces Dual Index)</td><td>NEB</td><td>E7600S</td><td>amorces d’amplification pour banques de séquençage</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit de préparation de bibliothèque d’ADN pour Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td>Kit de préparation de bibliothèque de séquençage&nbsp ;</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Q5 Master mix&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>M0544S</td><td>Mise en garde. Voir fabricants MSDS</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>1x NEAA</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td>1 % Pen-Strep</td></tr><tr><td>Proteinase K (40 mg/ml)</td><td>GoldBio</td><td>P-480-1</td><td>Attention. Voir les fabricants MSDS</td></tr><tr><td>QIAquick Kit d’extraction de gel</td><td>QIAgen</td><td>28706</td><td>référencé comme : Kit d’élution de gel d’ADN&nbsp ;</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de purification PCR</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>désigné comme : kit de purification d’ADN commercial&nbsp ;</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de dosage</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>instrument de quantification d’ADN haute sensibilité&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chargement rapide violet 1kb plus ADN échelle</td><td>NEB</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SPRIsélectionner la taille sélection perles</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23319</td><td>perles paramagnétiques&nbsp ;</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf&nbsp ;</td><td>5382000015</td><td>désigné comme : thermomélangeur</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapur 10 % SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td></td></tr><tr><td>Phénol Chloroforme Alcool isoamylique ultra-pur (PCI)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur</td><td></td><td></td><td></td> de fragments</tr></tbody></table>

cartographie des interactions du génome 3d des mammifères avec micro-c-xl

Mapping Mammalian 3D Genome Interactions with Micro-C-XL

L’organisation tridimensionnelle (3D) des chromosomes est un facteur majeur dans la régulation du génome et la spécification du type cellulaire. Par exemple, on pense que les éléments cis-régulateurs, connus sous le nom d’amplificateurs, régulent l’activité des promoteurs distaux via l’interaction dans l’espace 3D. Les technologies de capture de conformation chromosomique (3C) à l’échelle du génome, telles que Hi-C, ont transformé notre compréhension de la façon dont les génomes sont organisés dans les cellules. La compréhension actuelle de l’organisation du génome en 3D est limitée par la résolution avec laquelle l’organisation topologique des chromosomes dans l’espace 3D peut être résolue. Micro-C-XL mesure le repliement des chromosomes avec une résolution au niveau du nucléosome, l’unité de base de la chromatine, en utilisant la nucléase micrococcique (MNase) pour fragmenter les génomes pendant le protocole de capture de conformation chromosomique. Il en résulte une amélioration du rapport signal/bruit dans les mesures, facilitant ainsi une meilleure détection des sites d’isolation et des boucles chromosomiques par rapport à d’autres technologies 3D à l’échelle du génome. Un protocole visuellement détaillé, étape par étape, pour la préparation d’échantillons Micro-C-XL de haute qualité à partir de cellules de mammifères est présenté dans cet article.

La préparation réussie des bibliothèques Micro-C peut être évaluée en plusieurs étapes du protocole. L’étape la plus importante est le choix d’un bon degré de digestion MNase. Par conséquent, la concentration de MNase doit être titrée pour obtenir de manière constante 70 à 90 % de mononucléosomes par rapport aux dinucléosomes pour chaque échantillon. Il est important de noter que la digestion de la chromatine est différente pour l’eu- et l’hétérochromatine, la MNase digérant l’hétérochromatine moins efficacement. Ainsi, le degré de digestion optimal dépend de la région de chromatine d’intérêt et du type de cellule étudié, car la proportion relative d’eu- et d’hétérochromatine est spécifique au type de cellule. Par conséquent, il est conseillé de titrer soigneusement la concentration de MNase requise et d’évaluer d’abord le succès de l’expérience Micro-C par séquençage à faible niveau d’entrée.
La figure 1A montre un schéma de titrage typique de la chromatine traitée avec des quantités décroissantes de MNase. Ici, la chromatine de 250 000 cellules par réaction est digérée avec une dilution quadruple de MNase. La concentration la plus élevée (10 U de MNase, voie 2) montre une chromatine surdigérée presque exclusivement constituée d’ADN mononucléosomique (~150 pb). Notamment, le centre de la bande mononucléosomale est plus bas dans le gel d’agarose par rapport aux bandes correspondantes dans les échantillons avec des concentrations réduites de MNase, indiquant une surdigestion de l’ADN nucléosomal. Les nucléosomes trop digérés sont ligaturés de manière inefficace dans la réaction de ligature de proximité ; par conséquent, l’échantillon de la voie 2 n’est pas optimal pour les expériences Micro-C. La voie 3 (2,5 U de MNase) affiche un degré de digestion presque approprié pour les expériences Micro-C. Ici, la bande mononucléosomale est l’espèce dominante, et le frottis sous-nucléosomal, indiquant des nucléosomes trop digérés, est réduit ; cependant, il est toujours présent. Le degré de digestion dans la voie 4 (0,635 U de MNase) est une condition idéale pour une expérience Micro-C dans cet exemple de titrage. Une bande mononucléosomale transparente sans ADN sous-nucléosomique est présente. L’intensité de la bande pour l’ADN mononucléosome et dinucléosome est presque égale, ce qui indique un rendement mononucléosome de 66% ou plus. Il convient de noter que l’ADN di-nucléosomique est environ deux fois plus grand que l’ADN mono-nucléosomique (~320 pb contre ~150 pb), de sorte que son intensité de bande par mole d’ADN est deux fois plus élevée que son homologue mono-nucléosomal. Le degré de digestion dans la voie 5 (0,156 U de MNase) montre une chromatine sous-digérée avec presque pas d’ADN nucléosomique, ce qui représente donc un échantillon sous-optimal.
En conclusion, dans cet exemple, la digestion de 2,5 x 105 cellules ES de souris avec 0,625 U de MNase (correspondant à 2,5 U de MNase pour 1 x 106 cellules dans 200 μL) offre le point de départ le plus prometteur pour les digestions préparatives dans les expériences Micro-C. Cependant, une concentration intermédiaire de MNase entre les conditions utilisées pour les échantillons de la voie 3 et de la voie 4 (correspondant à 5 U de MNase pour 1 x 106 cellules dans 200 μL) doit également être envisagée. Il est important de noter que la digestion de la chromatine avec la MNase ne peut pas être mise à l’échelle linéairement et qu’il n’est pas recommandé d’augmenter la digestion préparative de plus de 4 fois. Pour préparer des banques Micro-C à partir de plus de 1 x 10 6 cellules, il est conseillé de digérer la chromatine en aliquotes de 1 x 106 cellules et de les regrouper après inactivation de la MNase.
Pour évaluer le succès du protocole de ligature de proximité, le témoin d’entrée, qui est digéré par la MNase et non ligaturé par proximité (étape 3.8), doit être comparé à l’échantillon ligaturé par proximité (étape 5.3) par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5 % (Figure 1B). La bande des mononucléosomes ligaturés par proximité a une taille approximative de 300 pb, similaire à celle des dinucléosomes. Par conséquent, le rapport du signal de bande mono- à dinucléosomique devrait passer de la prédominance des mono-nucléosomes (voie 1) aux di-nucléosomes (voie 3 et voie 4). Comme le gel d’agarose dans cette étape est l’ADN di-nucléosomique qui est excisé et purifié, il est conseillé de diviser les échantillons en plusieurs voies pour éviter la surcharge.
Il est recommandé d’évaluer la qualité et la quantité de la bibliothèque de séquençage préparée par PCR minimale. Ici, l’ADN de 1 μL de billes (1/20 de l’échantillon total) est amplifié pendant 16 cycles dans 10 μL de réaction PCR. La concentration totale de la banque de PCR minimale varie généralement de 50 à 500 ng après 16 cycles de PCR. En théorie, cela correspond à une bibliothèque de 1 à 10 μg à partir de l’échantillon de 19 μL restant si elle était également amplifiée pendant 16 cycles. Il est recommandé d’utiliser le nombre minimum de cycles de PCR nécessaires pour générer une bibliothèque d’environ 100 ng à partir de l’ADN total. En supposant une amplification logarithmique dans la PCR, la concentration théorique de l’ADN obtenue à partir de l’entrée de 19 μL à 16 cycles peut être divisée successivement par deux pour calculer le nombre de cycles de PCR nécessaires pour générer une bibliothèque de 100 ng. Par exemple, un rendement de 100 ng à partir de 1 μL après 16 cycles correspond à un rendement de 1 900 ng amplifié à partir de 19 μL. Dans ce scénario, 12 cycles devraient idéalement générer une bibliothèque de séquençage de 118 ng à partir de l’ADN total (1 900 ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng). L’échantillon restant de 9 μL provenant de la PCR minimale peut ensuite être utilisé pour évaluer la qualité de la bibliothèque par électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 1C). La visualisation doit montrer une bande distincte à 420 pb et aucune bande pour les dimères de l’adaptateur (120 pb). Des fragments plus petits peuvent également apparaître, et ceux-ci correspondent à des amorces PCR inutilisées.
Ensuite, il est recommandé d’analyser et de confirmer la réussite de la préparation d’échantillons Micro-C par séquençage à faible niveau d’entrée avant de s’engager dans un séquençage profond gourmand en ressources. En règle générale, les bibliothèques sont séquencées à une profondeur de lecture de 5 x 106 à 1 x 107 et évaluées en fonction des critères suivants : le taux de duplication de lecture de séquençage, le taux d’interaction cis- versus trans-chromosomique et la fréquence d’orientation de lecture de séquençage. Les bibliothèques Micro-C sont traitées avec Distiller, un pipeline à service complet qui traite les données du séquençage des fichiers de lecture (format Fastq) vers les fichiers de paires de lecture (format Bedpe) et les matrices d’interaction évolutives (formats Cool et Mcool) à l’aide de cooler, pairtools et cooltools10,11,12. Le pipeline génère également un fichier récapitulatif qui est idéal pour évaluer la qualité des bibliothèques Micro-C10 (https://github.com/open2c/distiller-nf). Le taux de duplication PCR fournit des informations sur la complexité de la bibliothèque de séquençage et peut être extrait du fichier *.stats généré. Les bibliothèques Micro-C de haute qualité ont des taux de duplication de PCR inférieurs à 5 à 10 % lorsqu’elles sont générées à partir de 5 millions de cellules ou plus. Notamment, certaines plates-formes de séquençage génèrent des doublons de PCR lors de la formation des clusters, indépendamment de la complexité de la bibliothèque de séquençage. La figure 2A montre les taux de duplication relatifs de deux expériences : l’une que nous considérons comme un bon échantillon et l’autre comme un mauvais échantillon. Dans cet exemple, les deux échantillons affichaient des taux de carte acceptables. Le critère suivant pour évaluer la qualité des bibliothèques Micro-C est le rapport cis versus trans et les fréquences d’orientation en lecture. À l’intérieur du noyau, les chromosomes habitent des territoires chromosomiques individuels et, par conséquent, interagissent rarement avec d’autres chromosomes. Un taux élevé d’interactions transchromosomiques détectées indique un taux élevé de ligatures aléatoires. Il est à noter qu’à ce niveau d’analyse, le mauvais échantillon présentait un taux élevé d’interactions transchromosomiques par rapport au bon échantillon (Figure 2B). Pour Micro-C, un taux d’interaction cis-chromosomique de 70 % ou plus est souhaitable.
Une banque Micro-C a une taille de fragment similaire à la bande d’ADN di-nucléosomique, qui peut co-purifier avec l’échantillon ligaturé de proximité et contaminer l’expérience. Ces contaminants sont toujours des interactions cis-chromosomiques. Par conséquent, il est important d’évaluer également les taux d’orientation de lecture. Le taux de contamination dinucléosomale peut être estimé par séquençage à faible niveau d’entrée. L’ADN dinucléosomique provient de deux nucléosomes voisins qui n’ont pas été clivés par MNase. Ainsi, les lectures de séquençage résultantes afficheront toujours une orientation de lecture avant-arrière (F et R), et la distance entre les paires lues sera d’environ 320 pb. Les fragments ligaturés par proximité, en comparaison, peuvent être ligaturés dans quatre orientations, ce qui donne des paires de lecture avec F-R, R-R, R-F et F-F, idéalement avec une abondance égale (Figure 2C). De plus, ils affichent différentes distances entre les deux paires de lecture. Pour estimer la quantité de contaminants dinucléosomales, la fréquence des orientations de lecture peut être calculée à partir des fichiers *stats générés par le distillateur (Figure 2D). Notamment, dans ce travail, la fraction des lectures F-R (en rouge) était plus élevée dans le mauvais échantillon que dans le bon échantillon, et cela est devenu plus évident lorsque les orientations lues ont été stratifiées en fonction de la distance (Figure 2E). La fraction F-R est dominée par les fragments di-nucléosomales par rapport aux banques Micro-C lorsque les paires de lecture sont stratifiées en lectures avec des distances de &lt;562 pb ou ≥562 pb. Ici, la fraction des lectures avec une distance de &lt;562 pb est dominée par les lectures F-R, tandis que la fraction avec des distances ≥562 pb affiche une distribution uniforme entre les quatre orientations possibles, ce qui indique que la surreprésentation globale des lectures F-R provient de contaminants dinucléosomales. Le choix de 562 pb comme seuil pour le sous-ensemble est défini par le binning dans le fichier *stats généré. Bien que cela ne soit pas nécessaire pour ce contrôle de qualité, il est possible d’obtenir un sous-ensemble plus défini en extrayant les distances du fichier *pairs, qui est également généré par le distillateur. Il est important de noter que les lectures dinucléosomales ne diminuent pas la qualité de l’échantillon Micro-C car elles peuvent être identifiées et ignorées lors du traitement des données. Cependant, ils ne contiennent pas d’informations précieuses sur les interactions 3D et diluent les lectures informatives.
Ainsi, un titrage minutieux de la MNase et un contrôle de qualité approfondi avec un séquençage à faible entrée sont les meilleurs outils pour optimiser la qualité des expériences Micro-C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig01.jpg"> Figure 1 : Etapes intermédiaires du protocole Micro-C. (A) Électrophorèse sur gel d’agarose de la chromatine à partir de 2,5 x 105 cellules ES de souris digérées avec des concentrations variables de MNase. Les bandes mono-, di- et tri-nucléosomales sont indiquées par des flèches. M : échelle d’ADN (couloir 1/6) ; 10 U de MNase pour 250 000 cellules (voie 2) ; 2,5 U de MNase par 250 000 cellules (voie 3) ; 0,625 U de MNase par 250 000 cellules (voie 4) ; 0,156 U de MNase pour 250 000 cellules (voie 2). (B) L’électrophorèse sur gel d’agarose à 1,0 % des échantillons préparés par Micro-C (voies 3 et 4) et le témoin d’entrée digéré par MNase (voie 1). Les voies 1 et 2 (M : échelle d’ADN) sont améliorées pour mettre l’accent sur le changement relatif de l’intensité des fragments mononucléosomales à dinucléosomiques. Les bandes mono- et di-nucléosomales sont indiquées par des flèches. La bande dinucléosomale de l’échantillon ligaturé à proximité combine l’ADN dinucléosomique et l’ADN de la bibliothèque Micro-C. (C) L’électrophorèse sur gel d’agarose à 1,0 % des banques de séquençage Micro-C amplifiée à partir d’un échantillon de 1 μL pour évaluer la qualité. Voie 1 (M) : échelle d’ADN ; Couloir 2 (S) : Bibliothèque Mirco-C. (D) Trace de l’analyseur de fragments de la bibliothèque Micro-C finale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig02.jpg"> Figure 2 : Statistiques de l’échantillon pour le séquençage à faible entrée d’un bon échantillon et d’un mauvais échantillon. (A) Graphique à barres du pourcentage mappé (vert) et non mappé (rouge). (B) Fraction normalisée des lectures cartographiant les interactions cis et trans-chromosomiques. Les ensembles de données ont été normalisés en fonction de la lecture de la cartographie cis. Les lectures de cis-mapping ont été stratifiées en fonction de la distance entre la première et la deuxième lecture des échantillons séquencés par paires : ≤1 kbp (jaune), &gt;1 kbp et ≤10 kbp (orange) et &gt;10 kbp (rouge). (C) Schéma des espèces moléculaires potentielles avec les tailles di-nucléosomiales. (D) Pourcentages d’orientations des paires de lecture de toutes les lectures du bon échantillon et du mauvais échantillon. (E) Identique au panneau (D) mais stratifié par les distances (gauche, &lt;562 pb et droite, ≥562 pb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composants</td>
			<td>1 fois</td>
			<td>4,4 fois</td>
		</tr><tr><td>10x NEBuffer 2.1,</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>2 μL 100 mM ATP</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>8,8 μL</td>
		</tr><tr><td>100 mM TNT</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>68 μL</td>
			<td>299,2 μL</td>
		</tr><tr><td>10 U/μL T4 PNK</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>Total</td>
			<td>90 μL</td>
			<td>396 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Mélange maître Micro-C 1. Composition du master mix pour la réaction de mastication finale.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composants</td>
			<td>1 fois</td>
			<td>4,4 fois</td>
		</tr><tr><td>1 mM de biotine-dATP</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>1 mM de biotine-dCTP</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>Mélange de 10 mM de dTTP et de dGTP</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>4,4 μL</td>
		</tr><tr><td>10x tampon ADN ligase T4</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>200x BSA</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>1,1 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>23,75 μL</td>
			<td>104,5 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Mixage maître Micro-C 2. Composition du mélange maître pour la réaction d’étiquetage final.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composants</td>
			<td>1 fois</td>
			<td>4,4 fois</td>
		</tr><tr><td>10x tampon de réaction NEB T4 Ligase</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>220 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>422,5 μL</td>
			<td>1859 μL</td>
		</tr><tr><td>ADN ligase T4</td>
			<td>25 μL</td>
			<td>110μL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 3 : Mélange maître Micro-C 3. Composition du mélange maître pour la réaction de ligature de proximité.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composants</td>
			<td>1 fois</td>
			<td>4,4 fois</td>
		</tr><tr><td>10x NEBuffer 1.1</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>88 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>180 μL</td>
			<td>792 μL</td>
		</tr><tr><td>Nucléase ExoIII</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 4 : Mélange maître Micro-C 4. Composition du mélange maître pour la réaction d’élimination de la biotine.

Un protocole de cartographie de l’organisation tridimensionnelle du génome avec la résolution des nucléosomes à l’aide de la méthode de capture de conformation chromosomique à l’échelle du génome Micro-C-XL est présenté ici.

Cartographie des interactions du génome 3D des mammifères avec Micro-C-XL

Three-dimensional (3D) chromosome organization is a major factor in genome regulation and cell-type specification. For example, cis-regulatory elements, ...

Ce protocole est important car il montre des boucles chromosomiques à haute résolution et d’autres caractéristiques d’interaction à courte portée. Le principal avantage de cette technique est la cartographie de l’organisation du génome en 3D avec une résolution de nucléosome avec un rapport signal/bruit élevé. Pour effectuer le titrage MNase, décongelez une pastille d’une fois 10 à la sixième cellule sur de la glace pendant 10 minutes, et remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de DPBS, et incubez la suspension cellulaire sur de la glace pendant 20 minutes.Prélever les cellules par centrifugation à 10 000 G pendant cinq minutes à température ambiante et retirer le surnageant. Remettre les cellules en granulés en suspension dans 500 microlitres de tampon MB Number one. Décongeler un flacon de 20 unités par microlitre de MNase, et le diluer avec 10 millimolaires de Tris pour les conditions de digestion décrites dans le texte.Avec des intervalles de temps appropriés de 10 à 20 secondes, ajoutez un microlitre de la première solution de digestion MNase dans l’un des quatre tubes d’échantillons, tourbillonnez et incubez dans un ThermoMixer à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes à 800 tr/min. Continuez à ajouter un microlitre des dilutions MNase restantes aux autres aliquotes cellulaires. Arrêtez la digestion de la MNase en ajoutant 200 microlitres de tampon d’arrêt fraîchement préparé dans chaque tube dans le même ordre et le même intervalle de temps que la MNase a été ajoutée.Incuber à 65 degrés Celsius pendant deux heures. Ajoutez 500 microlitres de PCI à chaque échantillon et mélangez soigneusement par vortex. Centrifuger à 19 800 g pendant cinq minutes à température ambiante pour séparer les phases.Et transférer la phase aqueuse sur de nouveaux tubes. Purifiez l’ADN à l’aide d’un kit de purification d’ADN commercial selon les instructions du fabricant et éluez les échantillons dans 12 microlitres de tampon d’élution. Ajoutez deux à cinq microlitres de colorant de chargement à l’échantillon d’ADN purifié.Analysez les échantillons sur un gel d’agarose à 1,5 % et choisissez le meilleur degré de digestion pour l’expérience. Un degré de digestion optimal présente peu ou pas de fragments sous-nucléosomales et un rapport mono/dinucléosome de 70 à 90 %. Dans cet échantillon représentatif, un degré de digestion intermédiaire entre les voies trois et quatre a été sélectionné pour les expériences de suivi.Sur la base du titrage de la MNase, digérer la chromatine en ajoutant la quantité appropriée de MNase à chaque aliquote de l’échantillon. Bien mélanger et incuber dans le ThermoMixer à 37 degrés Celsius, 800 tr/min pendant 10 minutes. Arrêtez la digestion de la MNase en ajoutant 1,6 microlitre d’EGTA de 0,5 molaire à chaque aliquote et incubez dans un ThermoMixer à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes avec une agitation de 800 tr/min.Prélever l’échantillon par centrifugation à 10 000 G pendant cinq minutes à température ambiante et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon NEB 1X 2.1. Regrouper des échantillons équivalant à une entrée de cinq fois 10 à la sixième cellule ou moins pour un traitement ultérieur.Avant de procéder à la ligature de proximité, transférez 10 % de l’échantillon en tant que témoin d’entrée pour surveiller le niveau de digestion de la MNase. Ajoutez 150 microlitres de Tris de 10 millimolaires, 25 microlitres de SDS à 10 % et 25 microlitres de protéinase K de 20 milligrammes par millilitre au contrôle de digestion et incubez toute la nuit à 65 degrés Celsius. Prélever l’échantillon restant par centrifugation à 10 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant.Remettre le granulé en suspension dans 90 microlitres de mélange maître Micro-C fraîchement préparé et incuber dans un ThermoMixer à 37 degrés Celsius, 800 tr/min pendant 15 minutes. Ajouter 10 microlitres de cinq unités par microlitre de fragment de Klenow et incuber dans un ThermoMixer. Ajoutez ensuite 100 microlitres de mélange maître Micro-C fraîchement préparé.Incuber pendant 45 minutes à 25 degrés Celsius, 800 tr/min, et éteindre la réaction enzymatique avec de l’EDTA comme décrit dans le texte. Incuber dans un mélangeur thermique pendant 20 minutes à 65 degrés Celsius, 800 tr/min. Prélever l’échantillon par centrifugation à 10 000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant.Remettre l’échantillon en suspension dans 500 microlitres de mélange maître Micro-C fraîchement préparé et incuber pendant 2,5 heures à température ambiante à 15 à 20 tr/min. Répétez la centrifugation et retirez le surnageant. Ensuite, remettre l’échantillon en suspension dans 200 microlitres de mélange maître Micro-C fraîchement préparé et incuber dans un ThermoMixer réglé à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes à 800 tr/min.Pour la réticulation inverse et la déprotéination, ajoutez 25 microlitres de 20 milligrammes par microlitre de protéinase K et 25 microlitres de 10 % de SDS à l’échantillon et incubez à 65 degrés Celsius pendant la nuit avec un mélange intermittent. Ajoutez 500 microlitres de PCI aux échantillons et au contrôle d’entrée, puis mélangez par vortex. Séparez les phases par centrifugation à 19 800 G pendant cinq minutes et transférez la phase aqueuse supérieure dans un tube frais.Concentrez l’ADN et éluez les échantillons dans 30 microlitres, et les contrôles d’entrée dans 15 microlitres. Appliquez un gel d’agarose à 1,5 % pour séparer les mononucléosomes et les dinucléosomes. Exciser les fragments d’ADN qui ont une taille dinucléosomale et extraire l’ADN comme décrit dans le texte.Ajouter 150 microlitres de billes pré-préparées à 150 microlitres de l’échantillon et incuber à température ambiante. Placez les tubes dans un aimant approprié et attendez que la solution se dégage. Retirez le surnageant et remettez les billes en suspension dans 300 microlitres de TBW 1X, et répétez cette étape.Répétez la séparation magnétique, et une fois la solution claire, retirez le surnageant et remettez les billes en suspension dans 100 microlitres de 0,1X TE. Répéter et remettre en suspension dans 50 microlitres de 0,1X TE. Transférez la solution dans des tubes PCR et effectuez la manipulation de l’ADN comme décrit dans le texte. Une fois la ligature de l’adaptateur terminée, laver l’échantillon dans 1X TBW, jeter le surnageant et remettre les billes en suspension dans 20 microlitres de 0,1X TE. Optimisez le nombre de cycles de PCR et amplifiez les bibliothèques de séquences comme décrit dans le texte. La chromatine de 250 000 cellules par réaction a été digérée avec une dilution quadruple de MNase.La concentration la plus élevée, 10 unités, a montré une chromatine surdigérée presque exclusivement constituée d’ADN mononucléosomique. La digestion de 250 000 cellules ES de souris avec 0,625 unité de MNase a offert le point de départ le plus prometteur pour les digestions préparatives dans les expériences Micro-C. Cependant, une concentration intermédiaire de MNase entre les conditions indiquées dans les voies trois et quatre, correspondant à cinq unités pour 1 million de cellules, devrait être envisagée.La bande des mononucléosomes ligaturés par proximité avait une taille approximative de 300 paires de bases, similaire à celle des dinucléosomes. Par conséquent, le rapport du signal de bande mono à dinucléosomique est passé de la prédominance des mononucléosomes aux dinucléosomes. La qualité et la quantité de la bibliothèque de séquençage préparée ont été évaluées à l’aide d’une PCR minimale.La visualisation a montré une bande distincte à 420 paires de bases, et aucune bande pour les dimères de l’adaptateur. Alors que les deux échantillons de cette étude présentaient des taux de cartographie élevés, le bon échantillon avait une fraction plus élevée de lectures cis. Un taux élevé d’interactions transchromosomiques indique des événements de ligature aléatoires, bien que certaines interactions transchromosomiques puissent être importantes.De plus, le bon échantillon présentait un taux modéré de paires de lecture de mappage avant-arrière, avec des distances inférieures à 500 paires de bases. Cela indique un faible taux de dinucléosomes non clivés par la MNase ayant une taille similaire à celle de deux nucléosomes ligaturés de proximité. Un bon degré de digestion de la MNase est crucial pour cette expérience.Les nucléosomes trop digérés sont ligaturés de manière inefficace, et la chromatine sous-digérée contient une grande fraction de dinucléosomes non digérés qui peuvent contaminer la bibliothèque de séquençage. Micro-C peut être combiné avec une approche de capture pour cartographier l’organisation du génome spécifique au locus avec une résolution extrêmement élevée.

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JoVE Journal

Genetics

Génétique

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