Name: Utilisation de la microscopie accélérée et de l’épuisement nucléaire spécifique au stade des protéines pour étudier la méiose chez S. cerevisiae (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Découvrez une méthode de microscopie accélérée pour étudier la méiose chez Saccharomyces cerevisiae en synchronisant les cellules et en épuisant spécifiquement les protéines. Cette approche révèle les fonctions distinctes des protéines.

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Nous remercions le Light Microscopy Imaging Center de l’Université de l’Indiana. Ce travail a été soutenu par une subvention des National Institutes of Health (GM105755).

<ol><li>Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+checkpoint+protein+Mad2+regulates+APC%2FC+activity+during+prometaphase+and+metaphase+of+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).</li>
<li>Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirement+for+Bub1+and+Bub3+in+regulation+of+meiotic+versus+mitotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136(2020).</li>
<li>van Werven, F. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+entry+into+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of entry into gametogenesis.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).</li>
<li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li>
<li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li>
<li>Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDT80%2C+a+meiosis-specific+gene+required+for+exit+from+pachytene+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).</li>
<li>Chu, S., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametogenesis+in+yeast+is+regulated+by+a+transcriptional+cascade+dependent+on+Ndt80%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80.</a> Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).</li>
<li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anchor-away+technique%3A+rapid%2C+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li>
<li>Borek, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteomic+landscape+of+centromeric+chromatin+reveals+an+essential+role+for+the+Ctf19%28CCAN%29+complex+in+meiotic+kinetochore+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly.</a> Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).</li>
<li>Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+kinetochore+protein%2C+Ctf19+in+meiosis+I%3A+an+implication+of+differential+impact+of+Ctf19+on+the+assembly+of+mitotic+and+meiotic+kinetochores+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).</li>
<li>Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+protein+complex+consisting+of+Ctf19%2C+Mcm21%2C+and+Okp1+represents+a+missing+link+in+the+budding+yeast+kinetochore%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore.</a> Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).</li>
<li>Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctf19p%3A+A+novel+kinetochore+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+a+potential+link+between+the+kinetochore+and+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle.</a> Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).</li>
<li>Fernius, J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+cohesion+at+the+pericentromere+by+the+Ctf19+kinetochore+subcomplex+and+the+replication+fork-associated+factor%2C+Csm3%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000629(2009).</li>
<li>Meyer, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipl1%2FAurora-B+is+necessary+for+kinetochore+restructuring+in+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).</li>
<li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).</li>
<li>Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+mapped+to+single-nucleotide+resolution+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast.</a> Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).</li>
<li>Ben-Ari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+linked+genes+participate+in+controlling+sporulation+efficiency+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast.</a> PLoS Genetics. 2 (11), 195(2006).</li>
<li>Primig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+meiotic+transcriptome+in+budding+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The core meiotic transcriptome in budding yeasts.</a> Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).</li>
<li>Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+transmission+fidelity+mutants+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).</li>
<li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).</li>
<li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+pachytene+arrest+of+Saccharomyces+cerevisiae+at+elevated+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature.</a> Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).</li>
<li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sum1%2FNdt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Robinett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+al.+In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).</li>
<li>Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+tagging+of+budding+yeast+chromosomes+reveals+that+protein-protein+interactions+can+mediate+sister+chromatid+cohesion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion.</a> Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).</li>
<li>Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZIP1+is+a+synaptonemal+complex+protein+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 72 (3), 365-378 (1993).</li>
<li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+mobility+during+meiotic+prophase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Ce protocole combine le système NDT80-in pour synchroniser les cellules, la technique d’ancrage pour épuiser les protéines du noyau et la microscopie accélérée à fluorescence pour imager les cellules de levure bourgeonnantes pendant la méiose. Le système NDT80-in est une méthode de synchronisation du cycle cellulaire méiotique qui utilise un arrêt et une libération 4,8 de la prophaseI. Bien que le temps passé dans chacune des étapes méiotiques s...

La microcopie à fluorescence accélérée est un outil précieux pour étudier la dynamique de la ségrégation des chromosomes méiotiques chez la levure bourgeonnante 1,2. Les cellules de levure bourgeonnantes peuvent être induites à subir une méiose par la famine de nutriments clés3. Au cours de la méiose, les cellules subissent un cycle de ségrégation chromosomique suivi de deux divisions pour créer quatre produits méiotiques qui sont emballés dans des spores (Figure 1). Les cellules individuelles peuvent être visualisées à chaque étape de la méiose, ce qui génère des données spatiales et temporelles qui peuvent facilement être manquées par l’imagerie à cellules fixes. Ce protocole montre comment la combinaison de la microscopie à fluorescence time-lapse avec deux méthodes précédemment établies, le système NDT80 inductible (NDT80-in) et la technique d’ancrage, peut être utilisée pour étudier la fonction de protéines spécifiques à des stades méiotiques distincts.
Le système NDT80-in est un outil puissant de synchronisation du cycle cellulaire méiotique qui repose sur l’expression inductible du facteur de transcription de la méiose moyenne NDT80 4,5. L’expression de NDT80 est requise pour la sortie 6,7 de la prophaseI. Avec le système NDT80-in, NDT80 est sous le contrôle du promoteur GAL1-10 dans les cellules exprimant le facteur de transcription Gal4 fusionné à un récepteur d’œstrogènes (Gal4-ER)4,5. Parce que Gal4-ER ne pénètre dans le noyau que lorsqu’il est lié au β-estradiol, les cellules NDT80-in s’arrêtent dans la prophase I en l’absence de β-estradiol, ce qui permet la synchronisation des cellules dans la prophase I (Figure 1). β’ajout de -estradiol favorise la translocation du facteur de transcription Gal4-ER dans le noyau, où il lie GAL1-10 pour conduire l’expression de NDT80, conduisant à une entrée synchrone dans les divisions méiotiques. Bien que la microscopie accélérée puisse être réalisée sans synchronisation, l’avantage de l’utilisation de la synchronisation est la possibilité d’ajouter un inhibiteur ou un médicament alors que les cellules sont à un stade spécifique de la méiose.
La technique de l’ancrage est un système inductible par lequel une protéine peut être épuisée du noyau avec l’ajout de rapamycine8. Cette technique est idéale pour étudier les protéines nucléaires lors de la division cellulaire dans la levure bourgeonnante car les cellules de levure subissent une mitose fermée et une méiose, dans lesquelles l’enveloppe nucléaire ne se décompose pas. De plus, cette technique est très utile pour les protéines qui ont de multiples fonctions tout au long de la méiose. Contrairement aux délétions, aux allèles mutants ou aux allèles nuls méiotiques, l’élimination d’une protéine cible du noyau à un stade spécifique ne compromet pas l’activité de la protéine cible aux stades antérieurs, ce qui permet une interprétation plus précise des résultats. Le système d’ancrage utilise la navette des sous-unités ribosomales entre le noyau et le cytoplasme qui se produit lors de la maturation ribosomique8. Pour épuiser la protéine cible du noyau, la protéine cible est marquée avec le domaine de liaison à la rapamycine (FRB) FKBP12 dans une souche dans laquelle la sous-unité ribosomique Rpl13A est marquée avec FKBP12. Sans rapamycine, FRB et FKBP12 n’interagissent pas, et la protéine marquée FRB reste dans le noyau. Lors de l’ajout de rapamycine, la rapamycine forme un complexe stable avec FKBP12 et FRB, et le complexe est évacué du noyau en raison de l’interaction avec Rpl13A (Figure 1). Pour prévenir la mort cellulaire lors de l’ajout de rapamycine, les cellules hébergent la mutation tor1-1 du gène TOR1 . De plus, ces cellules contiennent fpr1Δ , un allèle nul de la protéine S. cerevisiae FKBP12, qui empêche Fpr1 endogène de supplanter Rpl13A-FKBP12 pour la liaison FRB et rapamycine. Les mutations de fond d’ancrage, tor1-1 et fpr1Δ, n’affectent pas les moments méiotiques ou la ségrégation chromosomique2.
Pour démontrer l’utilité de cette technique, la protéine kinétochore Ctf19 a été épuisée à différents moments de la méiose. Ctf19 est un composant de la kinétochore qui est dispensable en mitose mais nécessaire pour une ségrégation chromosomique appropriée dans la méiose 9,10,11,12,13. Dans la méiose, la kinétochore est éliminée dans la prophase I, et Ctf19 est importante pour le réassemblagede kinétochore 9,14. Pour ce protocole, les cellules avec le système NDT80-in ont été synchronisées, et la technique d’ancrage loin a été utilisée pour épuiser la protéine cible Ctf19 du noyau avant et après la libération de la prophase I, et après la ségrégation du chromosome I de la méiose (Figure 1). Ce protocole peut être adapté pour épuiser d’autres protéines d’intérêt à n’importe quel stade de la méiose et de la mitose.

<table><tbody><tr><td>&beta ;-estradiol</td><td>Millipore Sigma</td><td>E8875</td><td>Faire 1mM de stocks à 95 % EtOH</td></tr><tr><td>0,22 uM Filtre fileté sur bouteille</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>100 % EtOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td>Diluer 1:10 à utiliser comme solvant pour ConA</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm lamelle n° 1.5</td><td>VWR Lames de microscope nord-américaines</td><td>48393241</td><td></td></tr><tr><td>25 mm x 75 mm</td><td>VWR Amérique du Nord</td><td>48300-026</td><td></td></tr><tr><td>Sel d’hémisulfate d’adénine</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9126</td><td>Pour compléter SC, SCA et 1 % Kac</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Concanavialin A</td><td>Mllipore Sigma</td><td>C2010</td><td>Obtenir comme 1mg/mL dans 1X caméra</td></tr><tr><td>CCD PBS CoolSNAP HQ2</td><td>Photométrie</td><td></td><td>utilisée dans la section 4.3</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Base d’azote de levure Difco sans acides aminés</td><td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde (DMSO)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2 micrscope à objectif inversé</td><td>Nikon</td><td></td><td>Utilisé dans la section 4.4</td></tr><tr><td>Fidji</td><td>NIH</td><td></td><td>Télécharger à partir de https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>GE Personal DeltaVision Microscope</td><td>Applied Precision</td><td></td><td>utilisé dans la section 4.3</td></tr><tr><td>L-Tryptophane&nbsp ;</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0254</td><td>Pour compléter SC, SCA et 1 % de</td></tr><tr><td>pâte à modeler</td> Kac <td>Crayola</td><td>&nbsp ; 2302880000</td><td>Pour fixer la lamelle dans le porte-diapositive</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 5.30.04 Logiciel d’imagerie</td><td>Nikon</td><td></td><td>Utilisé dans la section 4.4</td></tr><tr><td>ORCA-Fustion BT Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C15440-20UP</td><td>Utilisé dans la section 4.4</td></tr><tr><td>Porte-pointe de pipette en plastique</td><td>Dot Scientific</td><td>LTS1000-HR</td><td>Coupez une section carrée de 4 x 4 carrée de la partie rack de ce produit.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acétate de pottassium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP29631</td><td>Fabriquer des stocks de 1 mg/mL de</td></tr><tr><td>mastic silicone</td><td>DMSO Aqueon</td><td>100165001</td><td>Également connu sous le nom de colle d’aquarium.</td></tr><tr><td>SoftWorx7.0.0&nbsp ; Logiciel d’imagerie</td><td>Applied Precision</td><td></td><td>utilisé dans la section 4.3</td></tr><tr><td>Mélange synthétique complet (Kaiser)&nbsp ;</td><td>Pour huile</td><td>d’immersion DSCK2500</td><td></td></tr><tr><td>moyenne de type N&nbsp ;</td><td>Nikon</td><td>MXA22166</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de la microscopie accélérée et de l’épuisement nucléaire spécifique au stade des protéines pour étudier la méiose chez s. cerevisiae

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

La microscopie à fluorescence accélérée a révolutionné la compréhension des événements du cycle cellulaire méiotique en fournissant des données temporelles et spatiales qui ne sont souvent pas vues par imagerie des cellules fixes. La levure bourgeonnante s’est avérée être un organisme modèle important pour étudier la ségrégation des chromosomes méiotiques, car de nombreux gènes méiotiques sont hautement conservés. La microscopie accélérée de la méiose chez la levure bourgeonnante permet de surveiller différents mutants méiotiques pour montrer comment la mutation perturbe les processus méiotiques. Cependant, de nombreuses protéines fonctionnent à plusieurs points de la méiose. L’utilisation de mutants nuls méiotiques ou de perte de fonction peut donc perturber un processus précoce, bloquant ou perturbant le processus ultérieur et rendant difficile la détermination des phénotypes associés à chaque rôle individuel. Pour contourner ce défi, ce protocole décrit comment les protéines peuvent être épuisées conditionnellement du noyau à des stades spécifiques de la méiose tout en surveillant les événements méiotiques à l’aide de la microscopie accélérée. Plus précisément, ce protocole décrit comment les cellules sont synchronisées dans la prophase I, comment la technique d’ancrage est utilisée pour épuiser les protéines du noyau à des stades méiotiques spécifiques et comment l’imagerie accélérée est utilisée pour surveiller la ségrégation chromosomique méiotique. À titre d’exemple de l’utilité de la technique, la protéine kinétochore Ctf19 a été épuisée du noyau à différents moments de la méiose, et le nombre de masses de chromatine a été analysé à la fin de la méiose II. Dans l’ensemble, ce protocole peut être adapté pour épuiser différentes protéines nucléaires du noyau tout en surveillant les divisions méiotiques.

Pour surveiller la ségrégation de la chromatine, la protéine histones Htb2 a été marquée avec mCherry. Dans la prophase I, la chromatine apparaît comme une masse unique de Htb2. Après la ségrégation des chromosomes homologues dans la première division méiotique, la chromatine apparaît comme deux masses distinctes (Figure 3A). Après la ségrégation des chromatides sœurs, la chromatine apparaît sous la forme de quatre masses. Si certains chromosomes ne parviennent pas à se fixer aux microtubule...

La microscopie time-lapse est un outil précieux pour étudier la méiose chez la levure bourgeonnante. Ce protocole décrit une méthode qui combine la synchronisation du cycle cellulaire, la microscopie accélérée et l’épuisement conditionnel d’une protéine cible pour démontrer comment étudier la fonction d’une protéine spécifique pendant la ségrégation chromosomique méiotique.

Utilisation de la microscopie accélérée et de l’épuisement nucléaire spécifique au stade des protéines pour étudier la méiose chez S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

En synchronisant les cellules dans la prophase un, puis en épuisant la protéine cible à un stade particulier, cette méthode peut identifier des fonctions temporairement distinctes de protéines spécifiques. L’épuisement conditionnel des protéines à des stades spécifiques de la myose empêche les effets résiduels qu’un mutant myotique traditionnel peut avoir sur les stades ultérieurs. Cette méthode pourrait être utilisée pour étudier la mitose de levure bourgeonnante et d’autres organismes qui ne subissent pas de dégradation de l’enveloppe nucléaire.En outre, cette méthode peut être utilisée dans d’autres organismes pour étudier les événements du cycle cellulaire avant la rupture de l’enveloppe nucléaire. Pour commencer, fabriquez un tampon de gélose qui sera utilisé pour créer une monocouche de cellules pour l’imagerie. Coupez et jetez le bouchon et le tiers inférieur d’un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre pour créer un cylindre qui servira de moule pour le tampon de gélose.Placez le cylindre coupé du tube de microcentrifugeuse sur une lame de verre propre avec le haut du tube à l’envers, assis sur la glissière. Fabriquez six millilitres d’une solution de gélose à 5% dans un bécher de 50 millilitres. Coupez l’extrémité de la pipette pour faire une plus grande ouverture et pipette environ 500 microlitres de gélose fondue dans le tube de microcentrifugeuse.Laisser reposer à température ambiante jusqu’à ce que la gélose se solidifie. Pour préparer les cellules de levure, faites tourner 200 microlitres de la culture de sporulation à 800 G pendant deux minutes dans des tubes microcentrifugés d’un millilitre. Jetez 180 microlitres du surnageant.Remettez en suspension la pastille dans le surnageant restant en remuant et en agitant le tube. Pipeter six microlitres des cellules concentrées sur le couvercle glissant au milieu de la chambre sur place avec ConA. Tenez le cylindre avec le tampon de gélose et faites-le glisser délicatement hors de la lame de verre.Assurez-vous que la gélose est complètement plate en bas et, à l’aide du bas de l’embout de la pipette, appliquez une légère pression sur le moule de microcentrifugeuse de sorte que le tampon de gélose soit poussé légèrement au-dessus de la limite du tube. Ensuite, inversez le moule de telle sorte que le tampon de gélose soit orienté vers le bas vers la chambre. Utilisez une pince pour placer doucement le tampon de gélose sur le dessus des cellules et l’embout de la pipette pour faire glisser doucement le tampon de gélose autour de la chambre 10 à 20 fois pour créer une monocouche de cellules sur le couvercle.Gardez le tampon de gélose dans la chambre pendant 12 à 15 minutes. Ensuite, transférez deux millilitres de culture de sporulation dans deux tubes microcentrifuges et faites tourner à 15, 700 G pendant deux minutes. Après avoir transféré le surnageant dans des tubes à microcentrifugeuses propres, tourner à nouveau dans le même état et recueillir le surnageant pour nettoyer les tubes de microcentrifugation.Ajouter deux millilitres du surnageant goutte à goutte dans la chambre contenant le tampon d’agar. Une fois que le liquide a atteint le sommet de la chambre, le tampon de gélose flottera très probablement. Retirez doucement le tampon de gélose avec une pince et jetez-le.Placez un couvercle de 24 millimètres sur 50 millimètres sur le dessus de la chambre pour éviter l’évaporation pendant l’imagerie. Pour configurer le film sur le microscope, insérez le couvercle à l’intérieur du support de lame. Collez la pâte à mouler sur le côté de la glissière de couvercle pour la maintenir en sécurité dans le support de glissière.Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images. Utilisez des boutons de réglage grossiers et fins pour concentrer les cellules à l’aide de DIC ou de champ clair. Dans le menu principal du logiciel d’acquisition d’images, cliquez sur Fichier, sélectionnez Acquérir et quatre fenêtres apparaîtront.Dans la fenêtre Resolve 3D, cliquez sur l’icône du flacon Erlenmeyer. Cela ouvrira une fenêtre intitulée Design Run Experiment, qui contient les contrôles permettant de configurer une expérience pour configurer un film accéléré. Sous l’onglet Conception, accédez à l’onglet intitulé Sectionnement.Cochez la case en regard de Découpe Z et définissez l’espacement des sections optiques sur un micromètre et le nombre de sections optiques sur cinq. Ensuite, sous l’onglet Canaux, cliquez sur l’icône plus et sélectionnez le canal approprié. Ensuite, cochez la case en regard de Référence de l’image et définissez la position Z au milieu de l’échantillon dans le menu déroulant.Sélectionnez une valeur de transmittance et de temps d’exposition dans le menu déroulant. Sous l’onglet Time-lapse, cochez la case en regard de Time-lapse et entrez des valeurs pour minutes et heures afin d’identifier l’intervalle de temps d’acquisition d’image. Cochez la case en regard de Maintenir la mise au point avec la mise au point ultime pour éviter la dérive de la scène pendant le film.Et sous l’onglet Points, cochez la case en regard de Liste des points de visite. Dans le menu principal, cliquez sur Afficher et sélectionnez Liste de points. Déplacez la scène vers une zone de la chambre qui montre une monocouche de cellules.Cliquez sur Marquer le point dans la fenêtre Liste des points. Déplacez la scène pour sélectionner 25 à 30 points sans aucun chevauchement pour éviter de surexposer les cellules et d’imager chaque champ au cours de chaque cours de temps. Dans la fenêtre Liste des points, sélectionnez Calibrer tout pour définir la mise au point ultime pour chaque point.Sous l’onglet Exécuter, enregistrez le fichier à la destination appropriée sur l’ordinateur. Dans la fenêtre Exécuter une expérience, sélectionnez le bouton Lecture pour démarrer le film. Ouvrez le logiciel Fiji.Ouvrez les canaux DIC et mCherry. Obtenez une seule projection d’intensité maximale du canal mCherry en cliquant sur Image, puis sur Piles et Projet Z et sélectionnez Intensité maximale dans le menu déroulant. Pour fusionner les canaux DIC et mCherry en une seule image, cliquez sur Image, Couleur et sélectionnez Fusionner les canaux.Suivez une seule cellule à travers la méiose. Après l’achèvement de la méiose II, notez le nombre de masses d’ADN. Dans les cellules de type sauvage avec l’ancrage éloigné, il y a généralement quatre masses d’ADN à la fin de la méiose II, représentant les quatre produits de la méiose.Dans une petite fraction des cellules, seules trois masses sont visibles après la méiose II.Lorsque Ctf19-FRB est ancré au moment de la libération de la prophase I, environ 47% des cellules présentent plus de quatre masses d’ADN à la fin de la méiose, suggérant un défaut de fixation des kinétochores et des microtubules. Avec l’ancrage loin de Ctf19-FRB, soit après l’assemblage de kinétochore mais avant la méiose I, soit après la méiose II, environ 16% des cellules présentent des masses d’ADN supplémentaires. L’une des parties les plus importantes de ce protocole est d’ajouter le surnageant goutte à goutte à votre chambre pour éviter de perturber votre monocouche.En outre, notez le temps nécessaire pour se préparer à l’imagerie afin d’en tenir compte dans votre analyse. En changeant les protéines emballées par fluorescence, cette procédure peut être utilisée pour répondre aux questions concernant la durée du cycle cellulaire, la ségrégation chromosomique, l’abondance des protéines et la localisation des protéines.

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