Name: Différenciation et imagerie des adipocytes bruns de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux interscapulaire de souris nouveau-nées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Découvrez la différenciation des adipocytes bruns à partir du tissu adipeux interscapulaire de souris nouveau-nées. Cette méthode permet d'étudier la biologie des adipocytes et les mécanismes de thermogenèse.

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Le financement a été apporté par FONDECYT (1181214 et 1221146) et Anillos (ACT210039) à des bourses de VC et de doctorat, ANID 21171743 à l’AMF et ANID 21150665 à FS. Nous remercions Alejandro Munizaga pour son aide dans le traitement des échantillons et ses conseils techniques pour la microscopie électronique à transmission. Les illustrations ont été produites à l’aide de BioRender.

Les procédures pour les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Des souris nouveau-nées P0,5 des deux sexes, issues d’un mélange de souches C57BL/6J et 129J, ont été utilisées pour cette étude.
1. Extraction tissulaire
<ol><li>Nettoyez et désinfectez l’établi avec une solution d’éthanol à 70 % et utilisez du matériel chirurgical stérile.</li>
	<li>Euthanasier les nouveau-nés P0.5 par décapitation avec des ciseaux chirurgicaux conformément au protocole approuvé par l’établissement.</li>
	<li>Placez la souris en position couchée (face vers le bas) et faites une incision de 1 cm de long dans la peau au milieu du dos de l’animal à l’aide de ciseaux tranchants. Retirez la peau avec précaution. REMARQUE : Cette étape est essentielle car si la peau n’est pas bien enlevée, elle peut déchirer et endommager l’iBAT et empêcher la préparation optimale du SVF.</li>
	<li>Détachez chirurgicalement l’iBAT de la carcasse à l’aide de petits ciseaux. REMARQUE : L’iBAT est visualisé comme deux lobules graisseux qui peuvent être retirés indépendamment.</li>
	<li>Récoltez les deux lobes iBAT à l’aide d’une pince à pointe incurvée pour retirer les lobes indépendamment.</li>
	<li>Placez les deux lobes dans un tube en plastique contenant 1,5 mL de PBS stérile à température ambiante. Conservez les tissus dans leurs tubes individuels jusqu’à ce que l’extraction des tissus soit terminée pour tous les petits nécessaires.</li>
</ol>2. Digestion des tissus
<ol><li>Aliquote 300 μL de tampon de digestion de collagénase de type II (0,2 % de collagénase de type II dans le tampon [25 mM KHCO3, 1,2 mM MgSO4, 120 mM de NaCl, 5 mM de glucose, 12 mM de KH2PO4, 4,8 mM de KCl, 1,2 mM de CaCl2, 2,5 % de BSA et 1 % de pénicilline/streptomycine, à un pH de 7,4]) (tableau 1) dans des tubes de 1,5 mL dans une enceinte de biosécurité. REMARQUE : Préparez suffisamment de tubes pour le nombre de tissus individuels à extraire. Dans la présente étude, sept tubes ont été utilisés, ce qui correspond à une portée de sept petits.</li>
	<li>Déplacez-vous vers le paillasse et placez les lobes de l’iBAT dans un tampon de digestion de collagénase de type II pour dégrader la matrice extracellulaire.</li>
	<li>Incuber les tissus iBAT pendant 45 min à 37 °C en secouant doucement et continuellement à 800 tr/min (Figure 1).</li>
</ol>3. Traitement des tissus
REMARQUE : Après la digestion, effectuez toutes les étapes suivantes dans une hotte de culture tissulaire à flux laminaire de classe II.
<ol><li>Préparez et étiquetez deux ensembles de tubes en plastique de 1,5 mL pour chaque échantillon.</li>
	<li>Perturber mécaniquement la suspension tissulaire dans le tampon de digestion de la collagénase de type II en pipetant de haut en bas à l’aide d’une micropipette P1 000 et d’embouts filtrés. Utilisez une nouvelle astuce pour chaque échantillon. REMARQUE : Il s’agit d’une étape critique. Assurez-vous de désagréger mécaniquement le tissu avec la pointe et la pipette de haut en bas jusqu’à ce que l’homogénéisation macroscopique soit complète.</li>
	<li>Faites passer les tissus désagrégés à travers des filtres cellulaires individuels de 100 μm (voir le tableau des matériaux) dans de nouveaux tubes de 1,5 mL.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de tampon ACK (voir le tableau des matériaux) aux échantillons de tissus filtrés, retourner les tubes 4 à 5 fois et incuber à température ambiante pendant 4 min. REMARQUE : Ne dépassez pas le temps d’incubation, car cela pourrait endommager les cellules d’intérêt.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons de tissus à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Jeter le surnageant en inversant le tube et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu de culture (DMEM-F12 avec 10 % de FBS, 1 % d’antibio-antimycosique, pH 7,2) (voir le tableau des matières).</li>
	<li>Passez les suspensions à travers une crépine de 40 μm dans de nouveaux tubes de 1,5 ml à l’aide d’une micropipette P1 000 et d’embouts filtrés.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. REMARQUE : La pastille correspond à la FVS contenant des préadipocytes.</li>
	<li>Jeter le surnageant en inversant le tube et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu de culture par pipetage.</li>
	<li>Préparez un tube de 15 ml pour chaque échantillon en ajoutant 5 ml de milieu de culture.</li>
	<li>Ajouter chaque pastille remise en suspension dans le tube de 15 mL correspondant contenant 5 mL de milieu de culture. Retournez le tube 4 à 5 fois pour mélanger le contenu de la cellule.</li>
	<li>Ensemencer chaque échantillon dans six puits d’une plaque de culture à 24 puits en ajoutant 1 mL de suspension dans chaque puits (figure 1).</li>
</ol>4. Culture de fraction vasculaire stromale (SVF)
<ol><li>Changez le milieu de culture tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 100 % de confluence. REMARQUE : Au cours de cette période, les cellules adhérentes non plastiques sont retirées, ce qui donne une culture primaire enrichie d’un SVF contenant des préadipocytes.</li>
	<li>Lorsque les cellules deviennent confluentes à 100 %, retirez le milieu de culture et lavez les cellules avec 800 μL de PBS stérile.</li>
	<li>Ajouter 150 μL de trypsine-EDTA à 0,25 % (voir le tableau des matières) dans chaque puits, et placer la plaque de culture pendant 3 min dans l’incubateur pour le détachement des cellules. REMARQUE : Vérifiez que les cellules sont détachées à l’aide d’un microscope optique à contraste de phase.</li>
	<li>Inactiver la trypsine en ajoutant 850 μL de milieu de culture dans chaque puits.</li>
	<li>Prélevez les cellules des six puits ensemencés à l’étape 3.12 et transférez-les dans un tube de 15 ml.</li>
	<li>Augmentez le volume total jusqu’à 12 ml en ajoutant 6 ml de milieu de culture. Retournez le tube 4 à 5 fois pour mélanger le contenu.</li>
	<li>Ensemez 1 mL de l’échantillon dans chaque puits d’une plaque de 12 puits. Changez le milieu de culture tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent la confluence.</li>
	<li>Lorsque les cellules deviennent confluentes à 100 %, détachez-les avec 150 μL de trypsine-EDTA à 0,25 % en suivant les mêmes conditions d’incubation qu’à l’étape 4.3, et ensemencez-les en fonction de la surface du puits requise pour l’expérience.</li>
	<li>Effectuez une imagerie haute résolution après avoir fixé les cellules en suivant l’étape 8. REMARQUE : Une densité de 35 000 cellules/cm² est recommandée pour d’autres expériences (extraction de protéines et d’ARN totaux, 330 000 cellules [un puits d’une plaque à 6 puits] ; immunofluorescence [FI], 10 500 cellules [un puits d’une plaque à 96 puits]).</li>
</ol>5. Différenciation adipogénique
<ol><li>Incuber les cellules avec un milieu d’induction (DMEM-F12 avec 10 % de FBS, 1 % d’antimycosique antibiotique, pH 7,2, complété par 500 nM de dexaméthasone, 125 nM d’indométacine, 0,5 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine [IBMX], 5 μM de rosiglitazone, 1 nM T3 et 20 nM d’insuline) (tableau 1) pendant 72 h (du jour 0 au jour 2) (figure 2). REMARQUE : Le milieu de culture doit être changé tous les deux jours ; Ainsi, le premier changement de milieu doit se produire le jour 2 après l’induction initiale.</li>
	<li>Passer au milieu d’entretien (DMEM-F12 avec 10 % de FBS, 1 % d’antimycosique antibiotique, pH 7,2, complété par 5 μM de rosiglitazone, 1 nM T3 et 20 nM d’insuline) (tableau 1) au jour 3, et maintenir ce milieu d’entretien jusqu’au jour 7 (figure 2). REMARQUE : Le support d’entretien doit être changé le jour 5 et le jour 7. De petites gouttelettes lipidiques peuvent être visualisées par microscopie à contraste de phase dès le 3e jour de différenciation. De grosses gouttelettes lipidiques sont évidentes au jour 7 de la différenciation. Les procédures de différenciation de plus de 7 jours entraînent une perte de cellules par détachement, probablement en raison de la grande flottabilité des cellules chargées de lipides.</li>
</ol>6. Préparation de l’homogénat cellulaire
<ol><li>Retirer le milieu de culture au jour 0 et au jour 7 de la différenciation, et laver les cellules 3 fois avec du PBS stérile.</li>
	<li>Après le dernier nettoyage, ajoutez 1,3 ml de PBS stérile dans chaque puits. REMARQUE : Maintenez les cellules dans la glace jusqu’au nettoyage de la dernière plaque.</li>
	<li>Récoltez les cellules mécaniquement à partir d’un puits d’une plaque à 6 puits (~330 000 cellules) à l’aide d’un grattoir cellulaire, et mettez la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 2 800 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirez le PBS à l’aide d’une micropipette et maintenez les tubes sur de la glace.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un tampon RIPA avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase (voir le tableau des matériaux), et incuber pendant 30 min sur de la glace. REMARQUE : Pour lyser la pastille cellulaire, 70-80 μL suffisent.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 21 000 x g pendant 15 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirer délicatement le surnageant dans un tube de 1,5 mL et jeter la pastille. REMARQUE : Le surnageant représente l’homogénat cellulaire.</li>
	<li>Déterminer la concentration en protéines de l’homogénat cellulaire à l’aide de l’acide bicinchoninique (ACB) pour la détection colorimétrique et la quantification de la protéine totale18,19.</li>
</ol>7. Transfert Western
<ol><li>Préparez 30 μg d’homogénat cellulaire (à partir de l’étape 6.8) et ajoutez un tampon de chargement d’échantillon SDS-PAGE disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Résoudre en électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS20 (PAGE-SDS) en fonction du poids moléculaire de chaque protéine. REMARQUE : Utilisez 10 % de PAGE-SDS pour PPARγ, C/EBPα, PLIN1, CD36 et UCP1, 12 % de PAGE-SDS pour OXPHOS et 15 % de PAGE-SDS pour TOM20 (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Électrotransférez les protéines sur la membrane PVDF (voir le Tableau des matériaux) à 350 mA pendant 2 h. REMARQUE : Le récipient à glace doit être changé après 1 h. Pendant tout le processus, maintenez la chambre sur la glace.</li>
	<li>Bloquer les membranes avec du BSA à 5 % ou du lait écrémé dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS) 0,1 % Tween 20 (TBS-T) pendant 2 h en suivant les recommandations des fiches techniques des anticorps.</li>
	<li>Incuber avec les anticorps primaires (les anticorps utilisés dans cette étude sont détaillés dans la table des matières) pendant la nuit à 4 °C. REMARQUE : Tous les anticorps utilisés dans cette étude ont été dilués à 1:1 000 dans une solution bloquante.</li>
	<li>Laver les membranes 3 fois avec 0,1 % de TBS-T et les incuber avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (voir le tableau des matières) pendant 2 h à température ambiante.</li>
	<li>Lavez les membranes 3 fois avec 0,1 %. (SCT-T. Effectuez un dernier lavage avec 1x TBS. Rangez les membranes dans 1x TBS jusqu’à visualisation. Il est recommandé de le conserver pendant 1 h maximum.</li>
	<li>Visualisez les membranes par chimiluminescence20 ou toute autre méthode préférée.</li>
</ol>8. Imagerie haute résolution
<ol><li>Effectuez le test d’immunofluorescence en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Ensemencer et différencier les cultures primaires de préadipocytes bruns de souris nouveau-nées P0.5 (après l’étape 4.8) dans des plaques de 96 puits à fond optique (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Fixer les cellules au jour 0 et au jour 7 de différenciation avec 4% de PFA pendant 20 min, et laver 3 fois avec du PBS stérile.</li>
		<li>Perméabiliser les cellules avec 0,1% de Triton X-100 pendant 15 min, et les bloquer avec de la gélatine de poisson à 3% (voir le tableau des matières) pendant 1 h à température ambiante.</li>
		<li>Laver 3 fois avec du PBS stérile et incuber avec l’anticorps PLIN1 (1:400, voir le tableau des matériaux) dans 1% de BSA/PBS pendant une nuit à 4 °C dans une chambre humide.</li>
		<li>Laver 3 fois avec du PBS stérile et incuber avec des anticorps secondaires conjugués au fluorophore à 1:1 000 (1 % BSA/PBS) (voir le tableau des matériaux) pendant 1 h à température ambiante.</li>
		<li>Teindre les noyaux avec 1 μg/mL de Hoechst 33342 et les gouttelettes lipidiques avec 1 μg/mL de BODIPY pendant 30 min à température ambiante. REMARQUE : Les images de fluorescence ont été acquises à l’aide d’un système d’imagerie cellulaire (voir le Tableau des matériaux). Au total, 9 à 16 photos par puits ont été acquises avec deux à trois canaux avec un grossissement de 20x.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuez la microscopie électronique à transmission en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Cultivez et différenciez les préadipocytes bruns dans des boîtes de culture cellulaire de 35 mm x 10 mm.</li>
		<li>Au jour 0 et au jour 7 de la différenciation, retirer le milieu et fixer les cellules pendant 1 h avec 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M, pH 7,0 (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Laver les cellules 3 fois avec un tampon de cacodylate de sodium 0,05 M pendant 10 min et les traiter avec du tétroxyde d’osmium aqueux à 1 % (voir le tableau des matières) pendant 15 min.</li>
		<li>Laver les cellules 3 fois avec de l’eau bi-distillée pendant 5 min, et les traiter avec de l’acétate d’uranyle aqueux à 1% (voir le tableau des matières) pendant 15 min.</li>
		<li>Déshydratez les cellules avec un gradient d’éthanol de 30 %, 50 %, 70 %, 95 % et 100 % pendant 5 minutes à chaque fois.</li>
		<li>Pré-encastrer les cellules dans epon/ethanol 1:1 pendant 30 min puis dans epon pendant 1 h (voir le tableau des matériaux). REMARQUE : L’inclusion des cellules est effectuée directement dans la boîte en ajoutant de l’épon frais pour couvrir toute la monocouche de culture cellulaire. Laissez l’epon polymériser dans un four à 60 °C pendant 24 h.</li>
		<li>Plongez la boîte de culture cellulaire dans de l’azote liquide pendant 2 min, puis fracturez-la à l’aide d’une pince pour détacher l’inclusion plastique.</li>
		<li>Coller les segments d’inclusion avec des cellules sur un bloc de résine pour obtenir des découpes fines (80 nm) parallèles à la surface dans un ultramicrotome (voir la Table des matériaux).</li>
		<li>Teindre les incisions avec de l’acétate d’uranyle aqueux à 1 % pendant 4 minutes et du citrate de plomb pendant 5 minutes, selon Reynolds et al.21.</li>
		<li>Visualisez les grilles au microscope électronique (voir la Table des matériaux).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole actuel est une procédure de différenciation en deux phases simple et reproductible (Figure 2) pour générer des cellules présentant les caractéristiques moléculaires et morphologiques des adipocytes bruns matures. Le prélèvement chirurgical de l’iBAT est la première étape critique, car la déchirure tissulaire limite considérablement la viabilité du matériau de départ. Le traitement des tissus est également essentiel, car une suspension cellulaire homogène et exempte de débris aug...

Les tissus adipeux blancs et bruns diffèrent par leur emplacement anatomique, leur origine cellulaire, leur fonction, leur morphologie et leur masse totale. Le tissu adipeux blanc (WAT) est le principal réservoir d’énergie physiologique du corps et stocke de grandes quantités de triacylglycérol (TAG) dans des cellules hautement spécialisées qui ont une seule gouttelette lipidique géante occupant la majeure partie de leur volume cellulaire1. La lipolyse TAG libère des acides gras libres, qui entrent dans la circulation systémique pour répondre aux besoins énergétiques pendant le jeûne ou d’autres états de bilan énergétique négatif. De plus, le WAT sécrète des protéines et des produits lipidiques, appelés respectivement adipokines et lipokines, qui ont des fonctions régulatrices métaboliques, immunitaires et reproductives, faisant ainsi du WAT le plus grand tissu endocrinien du corps2.
Le tissu adipeux brun (MTD) est un organe beaucoup plus petit dont la fonction physiologique principale est la thermogenèse sans frissons pour prévenir l’hypothermie. Chez les souris et les nouveau-nés, la MTD est un organe bien défini situé dans l’espace interscapulaire. Les humains adultes n’ont pas de BAT interscapulaire (iBAT) ; néanmoins, ils développent des amas de cellules brunes de type adipocytaire intégrées dans des dépôts qui comprennent autrement principalement du WAT. Ces adipocytes « brun en blanc » (brite) partagent des caractéristiques morphologiques et moléculaires avec les adipocytes iBAT classiques, mais ils ont une origine cellulaire différente 3,4.
Contrairement aux adipocytes blancs, les adipocytes bruns ont plusieurs petites gouttelettes lipidiques et des mitochondries abondantes5. La protéine de découplage 1 (UCP1, également connue sous le nom de thermogénine) est exprimée de manière unique par les adipocytes bruns et brites et médie la fuite de protons dans la membrane mitochondriale interne (IMM), découplant ainsi le transport d’électrons de la synthèse de l’ATP et générant de la chaleur. La thermogenèse non frissonnante dans la MTD est activée par la noradrénaline (NE), qui est libérée par les terminaisons sympathiques de la MTD en réponse à la stimulation par le froid6. L’NE se lie aux récepteurs bêta-adrénergiques (principalement bêta-3) à la surface des adipocytes bruns et déclenche une cascade de signalisation intracellulaire médiée par l’AMPc. Il en résulte une lipolyse TAG, la bêta-oxydation des acides gras mitochondriaux et une génération de chaleur lors de l’activation d’UCP13. La relation fonctionnelle étroite entre les gouttelettes lipidiques et les mitochondries dans les adipocytes bruns présente des parallèles structurels, tels que l’interaction entre ces organites dans des zones qui sont grandes et ont un contact physique très étroit 7,8.
iBAT a des vaisseaux sanguins abondants et des terminaisons sympathiques9. Ces structures, ainsi que les préadipocytes, les cellules immunitaires, les fibroblastes et les molécules de la matrice extracellulaire, composent la fraction vasculaire stromale adipeuse (SVF)10. De nombreux protocoles ont permis de générer des adipocytes matures à partir des préadipocytes 11,12,13,14,15 (tableau supplémentaire 1) ; Néanmoins, ils présentent des variations extrêmes dans le traitement des tissus et la composition des milieux de culture de différenciation. Le protocole décrit ici permet la différenciation efficace et reproductible des adipocytes bruns qui (1) expriment les facteurs de transcription adipogéniques clés PPARγ (PPARγ) et la protéine alpha de liaison à l’amplificateur (C/EBPα), (2) expriment les marqueurs adipocytaires matures périlipine1 (PLIN1) et le déterminant du cluster 36 (CD36), (3) accumulent des gouttelettes lipidiques abondantes, (4) ont une masse mitochondriale élevée et une grande abondance de complexes OXPHOS, (5) ont un potentiel thermogénique, tel que déterminé par des niveaux élevés d’UCP1, et (6) présentent des changements morphologiques mitochondriaux associés au phénotype des adipocytes bruns matures. Cette méthodologie est utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la lipodystrophie généralisée 15,16,17.

<table><tbody><tr><td>10x tampon tris/glycine</td><td>BioRad</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>16 % paraformaldéhyde Solution aqueuse</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>35 mm traité TC Easy-Grip Style</td><td>Plat de</td> culture cellulaire Falcon <td>353001</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX)</td><td>Calbiochem</td><td>410957</td><td></td></tr><tr><td>40 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td><td>BioRad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>plaque à 6 puits&nbsp ;</td><td>SPL Sciences de la Vie&nbsp ;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>96 puits optique noir avec couvercle culture cellulaire stérile</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>AccuRuler RGB Plus Échelle de protéines pré-colorée&nbsp ;</td><td>Maestrogen</td><td>02102-250</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse ACK&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium&nbsp ;</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-antimycosique</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td></td><td></td>15240062</tr><tr><td>IgG anti-souris, signalisation cellulaire d’anticorps liée à HRP</td><td></td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-lapin, anticorps liés à HRP&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueur de type transfert</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>C/EBP&alpha</td> ; <td>anticorps Signalisation cellulaire</td><td>2295</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Calbiochem&nbsp ;</td><td></td><td></td>208291</tr><tr><td>Anticorps CD36</td><td>Invitrogen</td><td>PA1-16813</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 &micro ; m, nylon</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à cellules 40 & micro ; m, nylon</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type II</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Lecteur multimode</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, poudre</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td></td></tr><tr><td>EMBed-812 KIT D’ENROBAGE (Epon)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>100983&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau de poisson d’eau froide</td><td>Sigma</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde 25 % Solution aqueuse</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-lapin de chèvre (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteur de phosphatase Halt 100X&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78427</td><td></td></tr><tr><td>Halt Cocktail d’inhibiteurs de protéase 100X&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Invitrogen</td><td>H1398</td><td></td></tr><tr><td>Membrane PVDF Immun-Blot&nbsp ;</td><td>BioRad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Indométacine&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>I7378&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Insuline&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Calbiochem&nbsp ;</td><td></td><td></td>529552</tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Calbiochem</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>60339</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’échantillon réducteur de marqueur de voie&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>39000</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ stérile à l’eau&nbsp ;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mitoprofile Total OXPHOS Rongeur Anticorps WB Cocktail</td><td>Abcam&nbsp ;</td><td>MS604</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck&nbsp ;</td><td></td><td></td>1064041000</tr><tr><td>OmniPur&nbsp ; 10x Concentré liquide PBS</td><td>Calbiochem</td><td>6505-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium&nbsp ;</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Perilipin 1</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9349</td><td></td></tr><tr><td>PPAR&gamma ; (81B8) anticorps</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>2443</td><td></td></tr><tr><td>Lyse tampon RIPA&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Merck</td><td>557366</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Cacpdylate</td><td>de sodium Microscopie électronique Sciences</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium&nbsp ;</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Talos F200C G2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED&nbsp ;</td><td>BioRad</td><td>1610800</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps TOM20</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>42406</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>12498</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20, Biologie moléculaire Grade</td><td>Promega&nbsp ;</td><td>H5152</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps UCP1</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>14670</td><td></td></tr><tr><td>Ultracut R</td><td>Leica&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Westar Sun&nbsp ;</td><td>Cyanagen</td><td>XLS063</td><td></td></tr><tr><td>Westar Supernova&nbsp ;</td><td>Cyanagène</td><td>XLS3</td><td></td></tr></tbody></table>

différenciation et imagerie des adipocytes bruns de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux interscapulaire de souris nouveau-nées

Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

Le tissu adipeux brun (MTD) n’est présent que chez les mammifères et a une fonction thermogénique. Les adipocytes bruns sont caractérisés par un cytoplasme multiloculaire avec de multiples gouttelettes lipidiques, un noyau central, un contenu mitochondrial élevé et l’expression de la protéine de découplage 1 (UCP1). La MTD a été proposée comme une cible thérapeutique potentielle pour l’obésité et ses troubles métaboliques associés en raison de sa capacité à dissiper l’énergie métabolique sous forme de chaleur. Pour étudier la fonction et la régulation des MTD, la culture des adipocytes bruns est indispensable. Le protocole actuel optimise le traitement des tissus et la différenciation cellulaire pour la culture d’adipocytes bruns à partir de souris nouveau-nées. De plus, des procédures d’imagerie d’adipocytes différenciés par immunofluorescence confocale et microscopie électronique à transmission sont présentées. Dans les adipocytes bruns différenciés avec les techniques décrites ici, les principales caractéristiques déterminantes de la BAT classique sont préservées, notamment des niveaux élevés d’UCP1, une augmentation de la masse mitochondriale et un contact physique très étroit entre les gouttelettes lipidiques et les mitochondries, faisant de cette méthode un outil précieux pour les études de BAT.

L’adipogenèse est régulée par un réseau de facteurs de transcription qui sont responsables à la fois de l’expression de protéines clés qui induisent la formation et le fonctionnement des adipocytes bruns22, y compris les régulateurs adipogéniques classiques tels que PPARγ et C/EBPα 23,24,25, ainsi que les marqueurs des adipocytes matures 26,27. En...

Les préadipocytes sont isolés de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux brun interscapulaire de souris nouveau-nées et différenciés en cellules qui accumulent des gouttelettes lipidiques, expriment des marqueurs moléculaires et montrent la morphologie mitochondriale des adipocytes bruns matures. Ces cellules sont analysées par immunofluorescence et microscopie électronique à transmission.

Différenciation et imagerie des adipocytes bruns de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux interscapulaire de souris nouveau-nées

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

Ce protocole permet la différenciation efficace et reproductible des adipocytes bruns qui expriment les principaux facteurs de transcription adipogéniques, les marqueurs adipocytaires matures, et qui ont un potentiel thermogénique et un phénotype morphologique des adipocytes bruns matures. Il s’agit d’une procédure de différenciation en deux phases simple et reproductible permettant d’obtenir des cellules présentant des caractéristiques d’adipocytes bruns matures à partir de tissu adipeux brun interscapulaire de souris nouveau-nées. Ce protocole permet d’étudier les mécanismes d’activation du tissu adipeux brun comme cible pour le traitement de l’obésité.Il a été un modèle pour déterminer les mécanismes impliqués dans la physiopathologie de la lipodystrophie. Effectuer cette technique pour la première fois s’annonce difficile. Il est essentiel d’avoir un protocole détaillé et de mettre l’accent sur les points critiques pour avoir des résultats réussis.Pour commencer, placez la souris euthanasiée en position couchée et faites une incision cutanée d’un centimètre de long au milieu du dos de l’animal à l’aide de ciseaux tranchants. Retirez la peau avec précaution, détachez chirurgicalement l’iBAT de la carcasse à l’aide de petits ciseaux. Récoltez les deux lobes iBAT à l’aide d’une pince à pointe incurvée pour retirer les lobes indépendamment.Placez les deux lobes dans un tube en plastique avec 1,5 millilitre de PBS stérile à température ambiante. Incuber les tissus iBAT dans un tampon de digestion de type collagénase deux pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius avec une légère agitation continue à 800 tr/min. Perturber mécaniquement la suspension tissulaire dans le tampon de digestion de la collagénase de type deux en pipetant de haut en bas à l’aide d’une micropipette P1000 et d’embouts filtrants.Utilisez une nouvelle astuce pour chaque échantillon. Faites passer les tissus désagrégés à travers des crépines individuelles de 100 micromètres dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre. Ajoutez 500 microlitres de tampon ACK aux échantillons de tissus filtrés.Retournez les tubes quatre à cinq fois et incubez à température ambiante pendant quatre minutes. Ensuite, passez les suspensions à travers une crépine à cellules de 40 micromètres dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre à l’aide d’une micropipette P1000 et d’embouts filtrés. Centrifusion remet la pastille en suspension comme décrit dans le manuscrit du texte.Ensuite, ensemencez chaque échantillon dans six puits d’une plaque de culture de 24 puits en ajoutant un millilitre de suspension dans chaque puits. Les préadipocytes indifférenciés présentaient des niveaux très faibles ou indétectables de ppar-gamma, C/ebp-alpha, perilipin 1 et CD36. En revanche, ces marqueurs étaient significativement plus élevés au septième jour de différenciation.L’accumulation de plusieurs gouttelettes lipidiques dans les préadipocytes bruns était cohérente avec les résultats précédemment publiés. Une augmentation significative a été observée des niveaux de marqueur de masse mitochondriale TOM 20 et de protéine du complexe de phosphorylation oxydative au septième jour de la différenciation. UCP1, un marqueur de bonne foi de ce type de cellule, n’a pas été détecté dans les préadipocytes indifférenciés alors qu’il était substantiellement exprimé dans les adipocytes bruns matures au septième jour de la différenciation.Les mitochondries ont évolué d’une forme tubulaire allongée au jour zéro à une forme arrondie ou semblable à un haricot au septième jour. La structure interne mitochondriale a également été modifiée par l’adipogenèse, ce qui a entraîné une densité plus élevée des cristaux empilés parallèles. Il est important de noter que les mitochondries étaient intimement associées aux gouttelettes lipidiques dans les adipocytes bruns différenciés, de sorte qu’aucune distance discernable entre la membrane externe des mitochondries et les surfaces des gouttelettes lipidiques n’a pu être détectée, même avec la microscopie électronique à transmission à haute résolution.L’ablation chirurgicale du tissu adipeux interscapulaire est essentielle. Une quantité inefficace de tissu limite la disponibilité des cellules qui seront différenciées. Cette technique d’imagerie permet de caractériser la morphologie des adipocytes bruns différenciés in vitro.Il est possible d’effectuer des tests pour la fonction mitochondriale, l’activation bêta-androgène et l’inhibition autophagique.

differentiation-imaging-brown-adipocytes-from-stromal-vascular

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Une méthode d'imagerie fonctionnelle du tissu adipeux brun de la souris (BAT) est décrit dans lequel froide stimulée par l'absorption de 18F-fluorodésoxyglucose (FDG) dans la MTD est non-invasive évaluée avec un protocole standardisé micro-PET/CT. Cette méthode est robuste et sensible pour détecter des différences dans les activités de BAT dans des modèles murins.

Imagerie fonctionnelle de la graisse brune chez les souris avec FDG micro-PET/CT

Préadipocytes primaires blanches isolées à partir de tissus adipeux blancs chez la souris peuvent être différenciées en cellules beige / brite. Présenté ici est un système modèle cellulaire fiable pour étudier la régulation moléculaire de "brunissement" de graisse blanche.

L&#39;isolement et la différenciation des cellules stromales vasculaires de cellules Beige / Brite

Dans ce reportage vidéo, nous montrons l’application de l’imagerie par luminescence Cerenkov (CLI) pour le tissu adipeux brun interscapulaire chez des souris dans des conditions activées et déprimées.

Cerenkov Luminescence imagerie de Interscapular le tissu adipeux brun

La méthode présentée ici utilise 18 F-fluorodésoxyglucose (18 F-FDG) par émission de positons / tomodensitométrie (TEP-TDM) et l'imagerie graisse eau séparée résonance magnétique (IRM), chaque numérisé suivante 2 exposition h à thermoneutre (24 ° C ) et froid (17 ° C) dans le but de cartographier le tissu adipeux brun (BAT) chez des sujets humains adultes.

Dépôts de tissus humains adipeux brun segmentés automatiquement par tomographie par émission de positons / informatisée et la résonance magnétique images enregistrées

Ce rapport décrit un protocole pour l’isolement simultané des preadipocytes bruns et blancs primaires des souris nouveau-nées. Les cellules isolées peuvent être cultivées en culture et induites pour se différencier en adipocytes blancs et bruns complètement matures. La méthode permet la caractérisation génétique, moléculaire et fonctionnelle des cellules graisseuses primaires en culture.

Isolement et différenciation des préadipocytes primaires blancs et bruns de souris nouveau-nées

Cette étude décrit une nouvelle méthode d’isolement des adipocytes bruns murins pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines.

Isolement des adipocytes bruns du tissu adipeux brun interscapulaire murin pour l’analyse de l’expression génique et protéique

Imagerie fonctionnelle et quantification des dépôts adipeux thermogéniques chez la souris à l’aide d’une approche basée sur l’imagerie micro-TEP/IRM.

Visualisation et quantification des tissus adipeux bruns et beiges chez la souris à l’aide de l’imagerie micro-PET/MR [18F]FDG

Nous présentons ici un protocole de mesure de l’activité du tissu adipeux brun après un repas chez l’homme et les animaux de laboratoire.

Thermographie infrarouge pour la détection des changements dans l’activité du tissu adipeux brun

Ce protocole décrit l’isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin pour obtenir des préadipocytes et obtenir une différenciation adipocytaire in vitro. L’utilisation d’un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase réduit la variation expérimentale et augmente la reproductibilité.

Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire

Ici, nous fournissons une procédure pratique pour disséquer et effectuer des analyses histologiques et d’expression génique du tissu adipeux brun supraclaviculaire murin.

Dissection, traitement histologique et analyse de l’expression génique du tissu adipeux brun supraclaviculaire murin

Découvrez la différenciation des adipocytes bruns à partir du tissu adipeux interscapulaire de souris nouveau-nées. Cette méthode permet d'étudier la biologie des adipocytes et les mécanismes de thermogenèse.

Différenciation et imagerie des adipocytes bruns de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux interscapulaire de souris nouveau-nées (Vidéo) | JoVE Journal

Différenciation et imagerie des adipocytes bruns de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux interscapulaire de souris nouveau-nées

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