Application de la vermimétrie de flux pour la quantification et l’analyse du microbiome intestinal de Caenorhabditis elegans

Le microbiome intestinal joue un rôle important dans la physiologie de l’hôte. Ce protocole, en particulier, permet d’évaluer à haut débit les niveaux de colonisation microbienne intestinale fluorescente chez des animaux cellulaires uniques à grande échelle. L’un des principaux avantages de cette méthode est la capacité de surveiller le microbiome intestinal des animaux vivants en temps réel, ce qui permet d’identifier et de corréler tout changement avec la physiologie de l’hôte.

Dana Blackburn, une associée de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par laver les vers de la pelouse bactérienne avec un à deux millilitres de M9-TX. Transférez les vers dans une plaque creuse stérilisée de deux millilitres à 96 puits.

Pelletez-les à 300 G pendant une minute et retirez le liquide à l’aide d’un collecteur d’aspiration. À l’aide d’une pipette multicanaux de 1,2 millilitre, ajoutez 1,8 millilitre de M9-TX dans chaque puits de la plaque à puits profonds mélangé en pipetant plusieurs fois et centrifugez à 300 G pendant une minute. Après le lavage final, portez le volume dans chaque puits à 100 microlitres, en utilisant le collecteur d’aspiration.

Ajoutez 100 microlitres de lévamisole de 10 millimolaires et de M9-T dans chaque puits, et laissez les vers se paralyser pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite une solution d’eau de Javel à 4 % dans chaque puits pendant deux minutes pour réduire les amas bactériens. Après le traitement à l’eau de Javel, ajoutez du M9-TX dans chaque puits de la plaque pour laver les vers.

Centrifuger la plaque et aspirer jusqu’à un volume final de 100 microlitres après le deuxième lavage. Transférez les vers dans une plaque à fond plat de 96 puits, contenant 150 microlitres de 10 millimoles de lévamisole et de M9-TX. Maintenez la densité de vers à 50 à 100 vers par puits et divisez les vers en plusieurs puits si la population est trop surpeuplée.

Allumez le compresseur d’air, l’ordinateur et l’instrument LPS. Vérifiez et videz le réservoir à déchets. Vérifiez et remplissez la gaine et les réservoirs d’eau si le volume est faible.

Assurez-vous que l’ensemble de noyau fluidique et optique de 250 micromètres est en place. Connectez et allumez l’échantillonneur automatique. Ouvrez le logiciel de l’échantillonneur automatique pour ouvrir l’échantillonneur automatique et le logiciel LPS.

Dans la fenêtre du logiciel LPS, accédez au fichier et cliquez sur nouvelle expérience, puis sélectionnez à nouveau le fichier et cliquez sur nouvelle vérification d’échantillon. Permettre aux lasers d’allumer des lasers de 488 et 561 nanomètres si cela n’a pas déjà été fait. Créez maintenant des modèles pour les diagrammes de points d’acquisition, en utilisant le temps de vol, l’extinction et les canaux fluorescents dans la fenêtre du logiciel LPS.

Cliquez avec le bouton droit de la souris dans le corps d’un graphique pour modifier la mise à l’échelle. Ensuite, chargez les échantillons de contrôle. Dans la fenêtre de l’échantillonneur automatique, sélectionnez principal, accédez au fichier, cliquez sur ouvrir le script pour sélectionner le script intégré approprié, puis cliquez sur OK.

Accédez au modèle de plaque dans le menu du logiciel de l’échantillonneur pour sélectionner les puits souhaités pour l’analyse. Après avoir chargé et fixé la plaque sur la platine de l’échantillonneur automatique, appuyez sur exécuter la plaque dans la fenêtre de l’échantillonneur automatique et enregistrez le fichier lorsque vous y êtes invité, puis cliquez sur le bouton Stocker les données actuelles sur le ruban supérieur de la fenêtre du logiciel LPS et enregistrez à nouveau les données. Ouvrez le logiciel LPS.

Accédez au fichier et sélectionnez Nouvelle expérience, puis revenez au fichier et cliquez sur nouvel exemple. Créez un diagramme à points avec le temps de vol sur l’axe X et l’extinction sur l’axe Y. Créez un autre diagramme à points avec le temps de vol sur l’axe X et le rouge sur l’axe Y.

Assurez-vous de vérifier que les lasers permettent d’activer les lasers 488 et 561 nanomètres. Positionnez le tube d’échantillon de contrôle sur l’orifice d’échantillonnage, puis cliquez sur Acquérir dans la boîte de dialogue d’acquisition et de distribution. Lorsque vous y êtes invité, assurez-vous d’enregistrer le fichier.

Une fois qu’un nombre suffisant de vers a été mesuré pour différencier les populations, sélectionnez l’abandon dans le diagramme à points indiquant le moment de la fuite par rapport à l’extinction. Dessinez une barrière autour de la zone représentant la population adulte. Accédez ensuite à la vue, cliquez sur la hiérarchie des portes et vérifiez que les portes fluorescentes sont correctement répertoriées sous la porte de la population adulte.

Dans le diagramme du temps de vol par rapport au point rouge, créez des portes autour des zones de valeur rouge élevée et faible pour mettre en évidence les régions d’intérêt montrant la colonisation du microbiome chez les vers adultes. Une fois les paramètres optimisés, passez au fichier et cliquez sur Enregistrer l’expérience, puis cliquez sur Fichier et sélectionnez Enregistrer l’échantillon. Pour charger l’appareil de prélèvement, sélectionnez la plaque de charge A pour permettre à la platine de prélèvement de se déplacer dans une position préparée pour le chargement d’un tube de prélèvement ou d’une plaque à 96 puits.

Pour la distribution sur une plaque à 96 puits, accédez à la section de configuration et sélectionnez les plaques, puis cliquez sur les plaques calibrées et choisissez la plaque à 96 puits. Ensuite, sélectionnez les puits dans lesquels les vers seront triés et entrez le nombre d’objets à trier dans chaque puits. Assurez-vous également de spécifier les zones d’intérêt fermées.

S’il y a plusieurs régions fermées triées dans la même plaque, assurez-vous de cocher la case marquée porte chaque puits. Cliquez sur OK pour enregistrer les modifications. Après avoir trié les numéros et attribué les emplacements, chargez l’échantillon sur l’orifice d’échantillonnage et cliquez sur les boutons de la plaque de remplissage dans la boîte de dialogue d’acquisition et de distribution pour lancer la distribution dans une plaque à 96 puits.

Des valeurs d’extension et de temps de vol plus élevées sont observées chez les adultes que chez les larves. Les descendants d’adultes âgés de deux jours étaient dominés par les stades L1 et L2, tandis que la plupart des descendants d’adultes âgés de trois jours atteignaient les stades L3 et L4. Lorsqu’il a été cultivé sur E. coli, les valeurs de temps de vol et de prolongation ont augmenté le troisième jour par rapport au deuxième jour.

Lorsqu’ils ont été cultivés sur des cultures ochrobactrum, BH trois et mixtes, les allegands cenor abdidas ont montré des différences dans le temps de vol et les valeurs d’extension. Une augmentation de la colonisation de l’ochrobactrum BH3 a été observée dans la condition mixte par rapport à l’ochrobactrum BH3 seul. En revanche, les valeurs vertes et fluorescentes indiquaient une colonisation OP50 plus faible dans l’état mixte que dans l’OP50 seul.

Les vers sont fortement inclinés vers l’axe Y, ce qui suggère que la colonisation par OP50 est faible chez la plupart des vers, tandis que les niveaux de colonisation par l’ochrobactrum et BH3 sont uniformément répartis dans la population. La relation entre l’ochrobactrum, les niveaux de colonisation de BH3 et le développement de l’hôte, comme la densité corporelle et les différences dans les modèles de reproduction, a également été observée. Les adultes âgés de trois jours cultivés sur le microbiome mixte à deux membres présentaient une large gamme d’intensité RFP, indiquant des variations individuelles dans la colonisation de l’ochrobactrum au sein du groupe.

Des images RFP des puits contenant 15 vers triés et individuels provenant de vannes RFP hautes et basses sont présentées. Le plus important est de ne pas oublier d’utiliser les contrôles appropriés pour toutes les étapes afin de s’assurer que le protocole et la machine fonctionnent correctement. En temps réel, des animaux présentant des caractéristiques spécifiques peuvent être utilisés pour isoler des souches de l’hôte ou des pools de mutants microbiens afin d’identifier les gènes qui régulent les interactions post-microbiennes.

Les animaux isolés peuvent également être utilisés pour des analyses en aval basées sur un seul animal ou un pool phénotypique enrichi, comme le séquençage de l’ARN ou autre. Vraiment, les possibilités sont vraiment infinies.