Reconstitution de la cytoarchitecture et de la fonction des tissus épithéliaux humains sur une puce organique à sommet ouvert

Les méthodes traditionnelles de culture diffuse échouent souvent à récapituler l’environnement complexe des organes vivants, ce qui entraîne la perte de marqueurs et de fonctions spécifiques aux tissus. Nous avons développé une puce à toit ouvert qui combine la culture diffuse et le principe microfluidique pour imiter étroitement le microenvironnement des tissus épithéliaux. En incluant des indices biochimiques et biomécaniques naturellement présents dans les organes vivants mais souvent négligés par les modèles in vitro traditionnels, la puce à toit ouvert représente une meilleure alternative entre les systèmes fermés.

La démonstration de la procédure sera Adya Panchal aujourd’hui, un étudiant chercheur dans mon laboratoire. Pour commencer, apportez les réactifs requis sous l’enceinte de biosécurité sur la glace. Cultivez des cellules mésenchymateuses spécifiques aux tissus pour obtenir une confluence de 80% à 90%, puis dissociez les cellules à l’aide de trypsine ou d’autres méthodes selon les recommandations du fabricant.

Enduire les cellules à 250 g pendant cinq minutes à 24 degrés Celsius. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 225 microlitres chacun de tampon EMEM et de reconstruction 10X glacé. Mélanger les cellules par pipetage et ajouter 1 800 microlitres de solution glacée de collagène 1.

Ensuite, mélangez la solution de prégel sur de la glace en pipetant de haut en bas cinq à six fois. Neutraliser la solution de prégel avec 18 microlitres d’un hydroxyde de sodium normal, mélanger doucement par pipetage, puis pipeter 150 microlitres d’hydrogel chargé de cellules dans la chambre centrale de la puce à dessus ouvert tout en évitant les bulles. Regroupez les copeaux dans des boîtes de Petri séparées, y compris un bouchon de tube centrifuge rempli de deux millilitres d’eau stérile à double distillation dans chaque boîte de Pétri, et incuber les boîtes de Petri à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Pour effectuer un micromodelage de surface de l’hydrogel stromal, pipeter 20 microlitres de la solution de pré-gel de collagène 1 neutralisée sur la surface à motifs d’un tampon stérile imprimé en 3D et insérer le tampon à l’intérieur de la chambre ouverte pendant que l’hydrogel stromal est encore sous forme liquide. Enlevez tout résidu d’hydrogel qui pourrait se répandre du haut de la chambre à ciel ouvert à l’aide d’un aspirateur. Regroupez toutes les copeaux dans des boîtes de Petri séparées avec un bouchon tubulaire conique rempli d’eau, comme démontré précédemment.

Et incuber toutes les boîtes de Petri à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 90 minutes. À la fin de l’incubation, ramenez les copeaux sous l’enceinte de biosécurité et retirez délicatement les tampons à l’aide d’une pince à épiler de précision pour réduire le risque d’endommager l’hydrogel. Une fois que les cellules cultivées atteignent 80% à 90% de confluence, dissocier les cellules en utilisant des procédures enzymatiques protéolytiques recommandées par le fournisseur de cellules.

Après dissociation, enduire les cellules par centrifugation et remettre en suspension les cellules épithéliales à la densité de fragments cellulaires appropriée décrite dans le manuscrit. Pour ensemencer la cellule épithéliale, transférer les copeaux de l’incubateur dans l’armoire de biosécurité et rincer la surface stromale trois fois avec 100 microlitres de milieu de culture cellulaire épithéliale frais pour éliminer tout excès de solution d’enrobage. Une fois le milieu de rinçage aspiré, ensemencez la surface de l’hydrogel avec 50 microlitres de suspension de cellules épithéliales en utilisant une densité cellulaire appropriée, puis transférez les copeaux dans l’incubateur pendant deux heures.

Pour éliminer les débris cellulaires, rincez doucement la surface d’hydrogel avec le milieu de culture cellulaire deux fois, rafraîchissez le milieu par autoclavage dans des récipients autoclavables scellés et connectez les copeaux à la pompe péristaltique. Mettez la pompe péristaltique en pause, débranchez soigneusement les copeaux de la pompe et extrayez le support du boîtier de la puce. Après avoir transféré les copeaux de l’incubateur à l’armoire de biosécurité, retirez le volume du milieu restant dans le réservoir supérieur.

Ensuite, aspirez doucement tout le fluide du canal microfluidique supérieur et serrez le tube microfluidique court connecté aux entrées supérieures à l’aide de clips liants pour réduire l’évaporation du média et le maintien de l’interface air-liquide, ou ALI. Replacez la puce ouverte sur le support de boîtier dans l’incubateur. Reconnectez les copeaux à la pompe péristaltique et reprenez le débit en démarrant la pompe péristaltique.

Rincer la chambre vasculaire avec le milieu de culture de cellules endothéliales, puis ensemencer 25 microlitres de suspension de cellules endothéliales. Retournez les copeaux à l’envers pour permettre aux cellules endothéliales de se fixer à la surface supérieure de la chambre microfluidique. Regroupez les chips dans des boîtes de Pétri.

Replacez-les dans l’incubateur comme démontré précédemment et laissez les cellules endothéliales se fixer pendant une heure. À la fin de l’incubation, transférer les puces de l’incubateur à l’armoire de biosécurité et rincer le canal vasculaire avec un milieu de culture cellulaire endothéliale deux fois pour éliminer les débris cellulaires. Posez les copeaux à plat pour faciliter l’adhésion des cellules endothéliales à la surface inférieure du canal vasculaire.

Remplir le réservoir du milieu vasculaire avec le milieu de culture cellulaire vasculaire dégazé sous l’armoire de biosécurité. Replacez les copeaux à l’intérieur du support de boîtier de puces et reconnectez les copeaux aux réservoirs de milieu à une extrémité et à la pompe péristaltique de l’autre. Inspectez les connexions microfluidiques pour vous assurer que toutes les puces sont correctement connectées et qu’aucune gouttelette visible de fluide ne coule.

Ensuite, reprenez l’écoulement du fluide en démarrant la pompe péristaltique. La surface du gel micromodelé avec et sans cellules est visualisée. L’analyse histologique a révélé un épiderme stratifié multicouche mature différencié sur puce.

L’image de dessus de la puce de la peau montrait la présence des fibroblastes à l’intérieur de la couche dermique. PECAM-1, VE-cadhérine et von Willebrand ont montré la différenciation des cellules endothéliales microvasculaires humaines co-cultivées dans la puce cutanée ouverte. La coloration fluorescente MUC5AC, alpha et bêta, la protéine chlorocellulaire 16, p63 et ZO-1 a montré un épithélium des voies respiratoires mature.

Les cils battants et l’épithélium pseudo-stratifié mature différencié ont été observés sur une puce des voies respiratoires à sommet ouvert. La coloration fluorescente de type I, de type II et E-cadhérine a montré la présence de pneumocytes matures sur la puce. La microscopie électronique a révélé la présence de microvillosités et de vésicules lysosomales, preuve d’un phénotype alvéolaire mature.

L’analyse histologique a montré la présence de cellules squameuses plates compatibles avec le phénotype de type I, de cellules cuboïdes ressemblant à des pavés cohérentes avec le phénotype de type II et de fibroblastes à l’intérieur de la couche dermique. La présence d’entérocytes et du gobelet mature a été confirmée par la coloration de la mucine 2 et de la E-cadhérine. Les fibroblastes à l’intérieur de la couche dermique ont confirmé la présence d’un épithélium cylindrique simple.

Tous les réactifs doivent être froids et les surfaces du gel doivent être correctement rincées pour obtenir une surface uniforme. Il est important d’enlever toutes les cellules et les débris non adhérents pour obtenir une adhésion cellulaire uniforme et une monocouche et une paroi vasculaire compactes et nauséabondes. Une approche similaire peut être utilisée pour générer d’autres types de modèles d’organes épithéliaux, tels que l’intestin et le poumon, afin d’évaluer comment des médicaments spécifiques ou des facteurs environnementaux peuvent affecter l’homéostasie des tissus humains, avec un accent particulier sur la fonction de barrière épithéliale et vasculaire.

Avec un accès facile à la phase d’efficacité du compartiment stroma, la recherche peut maintenant générer des motifs de visage spécifiques et reproduire une architecture tissulaire fonctionnelle, telle que les cryptviveoli, ce qui est difficile à réaliser avec d’autres dispositifs.