Procédé d’homogénéisation rapide, simple et normalisé pour préparer des émulsions antigènes/adjuvants pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale ou EAE est un modèle animal utilisé pour développer des traitements nouveaux et améliorés pour les patients atteints de sclérose en plaques. L’induction de maladies dans EAE nécessite une émulsion d’huile et d’eau parfaite pour obtenir des résultats cohérents. La méthode de préparation de l’émulsion présentée ici est exempte d’influence humaine, limitant ainsi les incohérences d’une expérience à l’autre.

Même si la méthode a été optimisée pour EAE, elle peut également être utilisée pour d’autres modèles de maladies auto-immunes et également pour tester des vaccins contre le cancer. Pour préparer la boue CFA à 100 milligrammes de M tuberculosis H37 RA lyophilisée et cinq billes d’acier de 3,2 millimètres dans un tube de sept millilitres. Secouez le tube dans l’homogénéisateur pendant 60 secondes à la vitesse la plus élevée.

Ajouter cinq millilitres d’adjuvant IFA dans le tube et agiter à nouveau pendant 60 secondes à la vitesse la plus élevée. Ensuite, transférer la boue dans un tube frais avec une pipette en laissant les perles derrière et stocker à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour préparer une émulsion CFA/peptide, téléchargez le fichier supplémentaire un pour calculer la quantité nécessaire pour chaque réactif.

Placez ensuite le tube à vis et les réactifs à utiliser sur la glace. Ensuite, ajoutez les composants d’émulsion. D’abord le PBS, puis le peptide, la boue CFA.

Et enfin, l’IFA. Fermez fermement le tube avec le capuchon en le serrant et en le desserrant plusieurs fois. Secouez vigoureusement le tube pendant 5 à 10 secondes à la main pour prémélanger les réactifs.

Placez le tube dans l’homogénéisateur secouant et fixez-le avec la tige. Réglez la vitesse sur le paramètre le plus élevé et la durée sur 60 secondes. Une fois la course terminée, placez le tube sur la glace pendant trois minutes et répétez la course une ou deux fois de plus avec les mêmes réglages.

Centrifuger le tube à 300 G en une minute pour éliminer l’air emprisonné et compacter l’émulsion. Retirez le capuchon du tube. Insérez le piston dans le tube et poussez-le lentement jusqu’à ce qu’il atteigne le sommet de l’émulsion.

Retirez le boîtier à encliqueter au fond du tube en le tordant. Ensuite, retirez le piston de toutes les seringues d’injection et ajoutez une aiguille aux seringues d’injection. Ensuite, fixez l’arrière de la seringue d’injection à la serrure dédiée au bas du tube et verrouillez-la avec une courte torsion.

Transférer l’émulsion du tube à la seringue d’injection en poussant doucement le piston. Arrêtez lorsque l’émulsion atteint la graduation de 0,15 millilitre de la seringue d’injection. Séparez la seringue d’injection du tube et insérez soigneusement le piston en veillant à ce qu’aucun air ne pénètre dans cette seringue.

Poussez le piston jusqu’à ce que l’émulsion sorte de l’aiguille et répétez le processus pour le reste de l’émulsion présente dans le tube. Pour analyser la taille des particules d’eau et d’huile, ajoutez une minuscule goutte de l’émulsion à une lame de microscope, enduisez-la d’un couvercle, puis poussez fort dans un mouvement circulaire pour aplatir l’émulsion. Examinez l’émulsion étalée sous un microscope à contraste de phase avec un grossissement de 400 fois et concentrez-vous sur un champ avec une monocouche de l’émulsion.

Assurez-vous que les petites particules uniformes, grises ou blanches sont visibles. Les émulsions produites par la méthode d’homogénéisation présentaient des particules grises ou blanches en forme de haricot représentant de minuscules gouttelettes d’émulsions d’eau et d’huile. En revanche, les gouttelettes d’émulsion produites à l’aide de la méthode de la seringue étaient plus grosses et plus larges.

Dans la méthode du vortex, de grosses particules grises ou noires ont été observées correspondant à des bulles d’air piégées dans l’émulsion. Les changements dans la distribution granulométrique au fil du temps mesurés à l’aide d’un analyseur granulométrique à défraction laser pour les émulsions d’eau et d’huile n’ont montré aucun changement de la taille des particules sur une période de six semaines. Les émulsions fraîches âgées de 3 semaines et de 15 semaines ont toutes induit des maladies EAE similaires chez tous les animaux testés tout au long de l’expérience.

Les souris ont développé un schéma pathologique similaire dans toutes les expériences, révélant que la méthode d’homogénéisation présentée ici produisait des émulsions qui induisaient l’EAE de manière cohérente et reproductible. Avant de créer l’émulsion pour une expérience, téléchargez le fichier supplémentaire numéro un pour calculer la quantité de chaque composant nécessaire pour minimiser les déchets. La méthode présentée ici pourrait être utilisée pour normaliser la préparation de l’émulsion non seulement pour la recherche préclinique, mais aussi à l’avenir pour préparer des vaccins contre le cancer en clinique.