Procédé d’homogénéisation rapide, simple et normalisé pour préparer des émulsions antigènes/adjuvants pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale
December 9th, 2022
Pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de sclérose en plaques, les souris sont immunisées avec une émulsion eau dans huile contenant un autoantigène et un adjuvant de Freund complet. Bien qu’il existe plusieurs protocoles pour la préparation de ces émulsions, un protocole d’homogénéisation rapide, simple et standardisé pour la préparation de l’émulsion est présenté ici.
L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale ou EAE est un modèle animal utilisé pour développer des traitements nouveaux et améliorés pour les patients atteints de sclérose en plaques. L’induction de maladies dans EAE nécessite une émulsion d’huile et d’eau parfaite pour obtenir des résultats cohérents. La méthode de préparation de l’émulsion présentée ici est exempte d’influence humaine, limitant ainsi les incohérences d’une expérience à l’autre.
Même si la méthode a été optimisée pour EAE, elle peut également être utilisée pour d’autres modèles de maladies auto-immunes et également pour tester des vaccins contre le cancer. Pour préparer la boue CFA à 100 milligrammes de M tuberculosis H37 RA lyophilisée et cinq billes d’acier de 3,2 millimètres dans un tube de sept millilitres. Secouez le tube dans l’homogénéisateur pendant 60 secondes à la vitesse la plus élevée.
Ajouter cinq millilitres d’adjuvant IFA dans le tube et agiter à nouveau pendant 60 secondes à la vitesse la plus élevée. Ensuite, transférer la boue dans un tube frais avec une pipette en laissant les perles derrière et stocker à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour préparer une émulsion CFA/peptide, téléchargez le fichier supplémentaire un pour calculer la quantité nécessaire pour chaque réactif.
Placez ensuite le tube à vis et les réactifs à utiliser sur la glace. Ensuite, ajoutez les composants d’émulsion. D’abord le PBS, puis le peptide, la boue CFA.
Et enfin, l’IFA. Fermez fermement le tube avec le capuchon en le serrant et en le desserrant plusieurs fois. Secouez vigoureusement le tube pendant 5 à 10 secondes à la main pour prémélanger les réactifs.
Placez le tube dans l’homogénéisateur secouant et fixez-le avec la tige. Réglez la vitesse sur le paramètre le plus élevé et la durée sur 60 secondes. Une fois la course terminée, placez le tube sur la glace pendant trois minutes et répétez la course une ou deux fois de plus avec les mêmes réglages.
Centrifuger le tube à 300 G en une minute pour éliminer l’air emprisonné et compacter l’émulsion. Retirez le capuchon du tube. Insérez le piston dans le tube et poussez-le lentement jusqu’à ce qu’il atteigne le sommet de l’émulsion.
Retirez le boîtier à encliqueter au fond du tube en le tordant. Ensuite, retirez le piston de toutes les seringues d’injection et ajoutez une aiguille aux seringues d’injection. Ensuite, fixez l’arrière de la seringue d’injection à la serrure dédiée au bas du tube et verrouillez-la avec une courte torsion.
Transférer l’émulsion du tube à la seringue d’injection en poussant doucement le piston. Arrêtez lorsque l’émulsion atteint la graduation de 0,15 millilitre de la seringue d’injection. Séparez la seringue d’injection du tube et insérez soigneusement le piston en veillant à ce qu’aucun air ne pénètre dans cette seringue.
Poussez le piston jusqu’à ce que l’émulsion sorte de l’aiguille et répétez le processus pour le reste de l’émulsion présente dans le tube. Pour analyser la taille des particules d’eau et d’huile, ajoutez une minuscule goutte de l’émulsion à une lame de microscope, enduisez-la d’un couvercle, puis poussez fort dans un mouvement circulaire pour aplatir l’émulsion. Examinez l’émulsion étalée sous un microscope à contraste de phase avec un grossissement de 400 fois et concentrez-vous sur un champ avec une monocouche de l’émulsion.
Assurez-vous que les petites particules uniformes, grises ou blanches sont visibles. Les émulsions produites par la méthode d’homogénéisation présentaient des particules grises ou blanches en forme de haricot représentant de minuscules gouttelettes d’émulsions d’eau et d’huile. En revanche, les gouttelettes d’émulsion produites à l’aide de la méthode de la seringue étaient plus grosses et plus larges.
Dans la méthode du vortex, de grosses particules grises ou noires ont été observées correspondant à des bulles d’air piégées dans l’émulsion. Les changements dans la distribution granulométrique au fil du temps mesurés à l’aide d’un analyseur granulométrique à défraction laser pour les émulsions d’eau et d’huile n’ont montré aucun changement de la taille des particules sur une période de six semaines. Les émulsions fraîches âgées de 3 semaines et de 15 semaines ont toutes induit des maladies EAE similaires chez tous les animaux testés tout au long de l’expérience.
Les souris ont développé un schéma pathologique similaire dans toutes les expériences, révélant que la méthode d’homogénéisation présentée ici produisait des émulsions qui induisaient l’EAE de manière cohérente et reproductible. Avant de créer l’émulsion pour une expérience, téléchargez le fichier supplémentaire numéro un pour calculer la quantité de chaque composant nécessaire pour minimiser les déchets. La méthode présentée ici pourrait être utilisée pour normaliser la préparation de l’émulsion non seulement pour la recherche préclinique, mais aussi à l’avenir pour préparer des vaccins contre le cancer en clinique.
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Aperçu
Cet article présente une méthode standardisée pour préparer une émulsion eau-dans-huile pour induire l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), un modèle animal de sclérose en plaques. La méthode vise à réduire la variabilité des résultats en minimisant l'influence humaine pendant la préparation de l'émulsion.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Immunologie
- Recherche sur les maladies auto-immunes
Contexte
- L'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est utilisée pour étudier la sclérose en plaques.
- Une préparation d'émulsion cohérente est cruciale pour des résultats expérimentaux fiables.
- Les méthodes actuelles peuvent varier considérablement, affectant la reproductibilité.
- Cette étude introduit un protocole d'homogénéisation rapide et simple.
Objectif de l'étude
- Présenter une méthode standardisée pour la préparation d'émulsion.
- Réduire la variabilité dans l'induction de l'EAE.
- Fournir un protocole applicable à d'autres modèles auto-immuns et au test de vaccins contre le cancer.
Méthodes utilisées
- Préparation d'un mélange CFA en utilisant du M tuberculosis H37 RA lyophilisé.
- Utilisation de billes en acier et d'un homogénéisateur pour la préparation de l'émulsion.
- Optimisation du temps et de la vitesse d'agitation pour la cohérence.
- Application de la méthode à l'EAE et à d'autres modèles.
Principaux résultats
- La méthode a produit une émulsion stable, adaptée à l'induction de l'EAE.
- La réduction de l'influence humaine a conduit à des résultats expérimentaux plus cohérents.
- L'applicabilité démontrée à d'autres modèles de maladies auto-immunes.
- Utilisation potentielle dans le test de vaccins contre le cancer a été notée.
Conclusions
- La méthode standardisée de préparation d'émulsion améliore la reproductibilité dans les études EAE.
- Cette approche peut être adaptée à diverses applications de recherche.
- Les futures études pourraient bénéficier de ce protocole pour améliorer les résultats expérimentaux.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Standardized antigen/adjuvant emulsion preparation is critical for reproducible induction of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a key preclinical model for multiple sclerosis drug discovery. This homogenization-based method minimizes operator variability, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Reliable emulsion quality directly impacts predictive confidence and portfolio triage for autoimmune and immunotherapy programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent EAE induction for functional target validation in neuroimmunology.
- Reduces mechanistic ambiguity by standardizing antigen delivery and immune activation.
- Supports predictive confidence in disease-relevant preclinical models.
- Facilitates portfolio triage by ensuring reproducible biological outcomes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated emulsions for downstream immunization workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization across studies.
- Enables quantitative assessment of emulsion particle size and stability.
- Supports scalable and transferable protocols for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EAE model induction with disease-relevant translational endpoints.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by minimizing batch-to-batch variability.
- De-risks advancement decisions by providing robust, reproducible disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This homogenization method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification.
- Discovery Biology: Standardizes antigen/adjuvant delivery for hypothesis-driven immune activation studies.
- Screening: Provides reproducible emulsions for reliable compound or biologic evaluation in EAE models.
- Analytics: Enables quantitative particle size analysis and stability monitoring for quality control.
- Translational Research: Maintains disease model fidelity for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, operator-independent protocol adaptable to other autoimmune and immunotherapy models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in autoimmune model studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable emulsion preparation across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by minimizing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunology and neuroinflammation assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in homogenizer operation and emulsion quality assessment.
- Needs access to shaking homogenizers, phase contrast microscopy, and particle size analyzers for QC.
- Demands cross-team standardization of reagent calculations and handling protocols.
- Adaptable to various antigens and adjuvants for different autoimmune or immunotherapy models.
- Practical limitations include initial equipment investment and protocol adherence for reproducibility.
