Name: Quantification des complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test ELISA sandwich modifié (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Découvrez une méthode ELISA sandwich modifiée pour quantifier les complexes myéloperoxydase-ADN et élastase neutrophile-ADN issus des pièges extracellulaires neutrophiles. Cette technique sensible permet d'évaluer la sévérité de la sepsis et du SDRA.

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Les auteurs remercient le Dr Huq Muhammad Aminul pour leur aide dans la révision du manuscrit.

Cette étude a été menée conformément à la Déclaration d’Helsinki et a été approuvée par les comités d’examen institutionnels de l’Université de médecine d’Aichi (2017-H341, 2019-H137). Le consentement éclairé écrit de chaque participant a été obtenu.
1. Préparation des réactifs
REMARQUE : Pour effectuer le test ELISA sandwich, les réactifs sont préparés comme décrit ci-dessous.
<ol><li>Tampon de revêtement :<ol><li>Pour obtenir un tampon carbonate-bicarbonate de 0,1 mol/L, peser 10,6 g de carbonate de sodium anhydre (poids moléculaire, 106 g/mol) et 8,4 g de bicarbonate de sodium (poids moléculaire, 84 g/mol).</li>
		<li>Ajoutez-le à environ 900 ml d’eau distillée dans un bécher.</li>
		<li>Ajustez le pH du tampon à 9,6 en ajoutant la quantité requise d’acide chlorhydrique dilué ou d’hydroxyde de sodium.</li>
		<li>Vérifiez le pH à l’aide d’un pH-mètre.</li>
		<li>Ensuite, ajoutez le volume requis d’eau distillée pour obtenir un volume total de 1 000 ml.</li>
		<li>Conservez ce tampon carbonate-bicarbonate de 0,1 mol/L au réfrigérateur à 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Tampon de blocage :<ol><li>Ajouter environ 250 μL d’azoture de sodium à 20 % et 1 g d’albumine sérique bovine (BSA) à 70 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) composée de 137 mmol/L de NaCl, 8,1 mmol/L de Na 2HPO 4, 2,68 mmol/L de KCl et 1,47 mol/L de KH2PO 4 (pH7,4), et mélanger délicatement.</li>
		<li>Ajouter de l’eau distillée pour obtenir un volume total de 100 ml. Les concentrations finales d’albumine sérique bovine et d’azoture de sodium sont respectivement de 1 % et 0,05 %. Attendez 10 minutes, puis la solution est prête à l’emploi.</li>
	</ol></li>
	<li>Solution de lavage : Préparer 0,5 % de t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol, de polyéthylène glycol tert-octylphényléther (Triton X-100) dans de l’eau distillée.<ol><li>Diluer 100 % Triton X-100 à 10 % avec de l’eau distillée et laisser reposer la solution à 10 % pendant 1 jour avant utilisation.</li>
		<li>Ensuite, rediluez la solution de Triton X-100 à 10 % 20 fois avec de l’eau distillée pour obtenir une concentration de 0,5 %.</li>
	</ol></li>
	<li>Dilution des anticorps :<ol><li>Diluer l’anticorps de capture (anticorps anti-MPO [1 mg/mL] ou anticorps anti-NE [1 mg/mL]) à 1 :2 000 dans le tampon d’enrobage (pH 9,6) avant utilisation le jour 1 de l’essai (voir ci-dessous) et l’anticorps de détection (anticorps anti-ADN conjugué à la peroxydase) à 1 :40 avec PBS avant utilisation le jour 3 de l’essai (voir ci-dessous). REMARQUE : Pour l’expérience préliminaire, diluer les anticorps de type iso (IgG de lapin [5 mg/mL] et clone de souris IgG1 Ci4 [0,5 mg/mL]) à 1 :10 000 et 1 :1 000 dans le tampon d’enrobage (pH 9,6).</li>
	</ol></li>
	<li>Solution de substrat ABTS : Selon le nombre d’échantillons, dissoudre un, deux ou trois comprimés d’acide 2,2'-azino-bis(3 éthylbenzothiazoline-6-sulfonique (ABTS) dans 5 mL, 10 mL ou 15 mL de tampon ABTS (contenant du perborate de sodium, de l’acide citrique et de l’hydrogénophosphate disodique) ; 100 μL sont nécessaires par échantillon. Conservez la solution préparée à une température comprise entre 2 et 8 °C, à l’abri de la lumière. La solution est stable jusqu’à 3 mois.</li>
</ol>2. Collecte et stockage des échantillons
<ol><li>Isolement du plasma :<ol><li>Prélever 4 mL d’échantillons de sang périphérique dans un tube de prélèvement sanguin d’héparine de lithium par ponction veineuse avec une seringue de 22 G et centrifuger à 1 600 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
		<li>Transvaser le surnageant dans un tube d’échantillon de 2 mL à verrouillage sûr.</li>
		<li>Recentrer le surnageant à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les cellules résiduelles.</li>
		<li>Recueillir le surnageant dans un nouveau tube d’échantillon à verrouillage sûr sans perturber la pastille au fond du tube.</li>
		<li>Conservez le plasma obtenu à −80 °C jusqu’à une nouvelle utilisation. REMARQUE : Pour obtenir des résultats à haut débit avec ce test, des échantillons de bonne qualité sont nécessaires. Si des échantillons de plasma sont utilisés, effectuez une deuxième centrifugation pour éliminer les cellules résiduelles. Éviter les décongélations répétées des échantillons. Utilisez l’héparine comme anticoagulant car l’EDTA affecte l’activité de la DNase.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolement des polynucléaires neutrophiles<ol><li>Prélever les échantillons de sang périphérique dans un tube de prélèvement sanguin d’héparine au lithium par ponction veineuse à l’aide d’une seringue de 22 G.</li>
		<li>Déposer 6 mL de sang sur 6 mL de polymorphes en une étape et centrifuger les tubes à 1 000 x g pendant 45 min à température ambiante (RT).</li>
		<li>Récoltez la troisième couche de couche leucocytaire contenant des neutrophiles et lavez-la trois fois dans du rouge de phénol RPMI-1640 à 400 x g pendant 10 min à RT.</li>
		<li>Remettre les neutrophiles en suspension dans du RPMI-1640 sans rouge de phénol contenant 2 mM de L-glutamine complété par 6 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, et compter les cellules dans le champ du microscope à l’aide d’un hémocytomètre. REMARQUE : Cette méthode donne une pureté de 96% à 98% avec une viabilité supérieure à 95%, telle qu’évaluée par l’exclusion du colorant bleu trypan.</li>
	</ol></li>
	<li>Activation des polynucléologues, neutrophiles et NETosis in vitro
	<ol><li>Diluer les neutrophiles polymorphonucléaires fraîchement isolés à 1 × 105 cellules/mL dans du RPMI-1640 sans rouge de phénol contenant 2 mM de L-glutamine complété par 6 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, et les ensemencer dans des boîtes de culture de 35 mm.</li>
		<li>Pour induire des TNE, stimuler les polynucléaires neutrophiles avec 25 nM PMA pendant 4 h à 37 °C dans 5 % de CO2/95 % d’air.</li>
		<li>Après 4 h d’incubation, digérer partiellement les TNE en ajoutant 0,6 μg/mL de DNase I directement dans les boîtes de culture pendant 15 min à RT, et arrêter l’activité de la DNase I en ajoutant 5 mM d’EDTA.</li>
		<li>Prélever le milieu contenant les TNE synthétisées et centrifuger à 400 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires.</li>
		<li>Obtenir les surnageants de quatre témoins sains, mélanger et conserver à −80 °C jusqu’à utilisation. REMARQUE : Les neutrophiles stimulés par la PMA digérés par la DNase obtenus à partir de quatre témoins sains sont utilisés comme norme NET 1,14,15. Générez une courbe d’étalonnage à partir d’un étalon NET dilué en série avec PBS, et attribuez les valeurs de densité optique (OD) obtenues à partir d’un étalon NET non dilué comme 100 % NET.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Méthode d’analyse
REMARQUE : Les étapes pour effectuer le test sont décrites en détail ci-dessous.
<ol><li>Jour 1<ol><li>Appliquer un total de 100 μL d’anticorps anti-MPO ou anti-NE dilué contenant 0,05 μg d’anticorps sur chaque puits de la plaque, y compris le puits vierge. REMARQUE : Le tampon de revêtement ne doit contenir aucun type de détergent car, sinon, les anticorps risquent de ne pas se lier uniformément et en douceur aux parois de chaque puits. Pour éviter l’effet d’hameçon, la concentration en protéines de l’enrobage ne doit pas dépasser 20 μg/mL, car des concentrations supérieures à ce niveau saturent la plupart des sites disponibles sur la plaque de microtitration. La plage de concentration typique des solutions d’enrobage protéique est de 2 à 10 μg/mL. Pour l’expérience préliminaire, utiliser des anticorps de contrôle de type iso dilués de lapin IgG pour l’enrobage au lieu d’anticorps monoclonaux spécifiques contre le MPO. Utiliser un anticorps témoin de type iso dilué de souris IgG1 pour l’enrobage au lieu d’anticorps monoclonaux spécifiques contre l’EN.</li>
		<li>Recouvrez la plaque d’un couvercle en plastique adhésif pour éviter l’évaporation de l’échantillon, et incubez une nuit à 4 °C pour permettre la liaison des anticorps de capture.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 2<ol><li>Jetez la solution d’anticorps diluée des puits, puis pipetez 300 μL de solution de lavage par puits, et répétez cette procédure de lavage trois à quatre fois.</li>
		<li>Retirez l’excédent de PBS en tapotant l’assiette sur une serviette en papier.</li>
		<li>Bloquez chaque puits de la plaque ELISA avec 200 μL de tampon de blocage.</li>
		<li>Couvrez étroitement la plaque avec un couvercle en plastique adhésif et incubez-la pendant 1,5 à 2 h à RT pour obstruer les puits.</li>
		<li>Éliminez complètement la solution de blocage des puits, puis pipetez 300 μL de solution de lavage par puits, et répétez cette procédure de lavage trois à quatre fois.</li>
		<li>Retirez l’excédent de PBS en tapotant l’assiette sur une serviette en papier.</li>
		<li>Appliquer un total de 25 μL de plasma ou de milieu dans chaque puits, à l’exception du puits vide, et ajouter 75 μL de PBS comme diluant pour obtenir un volume final de 100 μL ; ajouter 100 μL de PBS dans le puits vierge.</li>
		<li>Ensuite, mixez les échantillons à RT pendant 10 s en plaçant la plaque sur un shaker à 250 tr/min.</li>
		<li>Appliquer 2 μL de DNase I diluée 100 fois (0,03 mg/mL) dans chaque puits, y compris le puits vierge (concentration finale de DNase I dans le mélange réactionnel : 0,6 μg/mL).</li>
		<li>Scellez la plaque avec un couvercle en plastique adhésif et mélangez soigneusement les échantillons à RT pendant 10 s en plaçant la plaque sur un agitateur à 250 tr/min. REMARQUE : Pour évaluer les conditions optimales de digestion de l’ADN, lors de la mise au point du test, nous avons incubé des échantillons contenant de l’ADN associé à la MPO provenant de patients atteints de COVID-19 avec 0-0,9 μg/mL DNase I pendant 15 minutes à RT et utilisé des plaques recouvertes d’un anticorps de capture spécifique pour la MPO ou d’un anticorps témoin de type iso apparié selon l’espèce.</li>
		<li>Incuber les échantillons pendant 15 min à RT.</li>
		<li>Retirez le couvercle en plastique adhésif et appliquez 1 μL d’EDTA 0,5 M sur chaque puits pour arrêter la réaction de la DNase.</li>
		<li>Refermez la plaque avec un couvercle en plastique adhésif et secouez-la à RT pendant 15 s en la plaçant sur un shaker à 250 tr/min.</li>
		<li>Ensuite, incubez la plaque pendant la nuit à 4 °C pour permettre aux composants protéiques des TNE de se fixer aux anticorps de capture.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 3<ol><li>Retirez le couvercle en plastique adhésif et jetez la solution des puits.</li>
		<li>Éliminez complètement la solution des puits, puis pipetez 300 μL de solution de lavage par puits, et répétez cette procédure de lavage trois à quatre fois.</li>
		<li>Appliquer un total de 100 μL d’anticorps anti-ADN conjugué à la peroxydase diluée dans chaque puits.</li>
		<li>Scellez hermétiquement la plaque avec un couvercle en plastique adhésif et incubez-la pendant 1,5 h à RT.</li>
		<li>Éliminez complètement la solution des puits, puis pipetez 300 μL de solution de lavage par puits, et répétez cette procédure de lavage trois à quatre fois.</li>
		<li>Retirez délicatement la solution résiduelle.</li>
		<li>Appliquez un total de 100 μL de solution de substrat ABTS sur chaque puits et recouvrez la plaque d’un couvercle en plastique adhésif.</li>
		<li>Incuber la plaque dans l’obscurité à RT pendant 20-30 min sur un shaker à 250 tr/min. REMARQUE : Surveillez la plaque à des intervalles de 5 minutes jusqu’à ce que les lectures de diamètre extérieur souhaitées soient obtenues.</li>
		<li>Ajouter un total de 50 μL d’acide sulfurique 2 M pour arrêter la réaction.</li>
		<li>Mélangez le contenu liquide des puits en tapotant soigneusement le côté de la plaque.</li>
		<li>Allumez le lecteur de microplaques et connectez-le à l’ordinateur.</li>
		<li>Ouvrez l’application logicielle sur l’ordinateur.</li>
		<li>Dans la barre d’état, créez un nouveau test et nommez-le.</li>
		<li>Réglez tous les paramètres suivants pour la lecture de la plaque : Type de lecture, Absorbance ; Mode de lecture, point de terminaison ; Longueurs d’onde, 2 ; Lm-1, 405 nm ; Lm-2, 490 nm ; Mélange automatique et suppression avant, Désactivé ; Plaque de pré-lecture, Éteint ; Calibrage automatique, activé ; Bandes, Lire toute la plaque ; Priorité à la longueur d’onde de la colonne, Priorité à la colonne ; Vitesse de chariot, Normal ; et Lecture automatique, Désactivé.</li>
		<li>Ensuite, placez la plaque à 96 puits contenant les échantillons dans le tiroir et fermez-la.</li>
		<li>Enfin, sélectionnez le bouton Lire pour que la plaque soit lue immédiatement.</li>
		<li>Lisez l’absorbance de chaque puits à une longueur d’onde de 405 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (à ce stade, utilisez une longueur d’onde de 490 nm comme référence).</li>
		<li>Effectuez une soustraction automatique de la valeur d’absorbance du milieu d’essai seul à partir de tous les échantillons inconnus et enregistrez les données. NOTA : Utiliser une courbe étalon obtenue à partir d’un étalon NET dilué en série pour calculer la concentration relative de NET dans l’échantillon 1,14,15. Ici, les résultats finaux sont présentés sous la forme de « complexes d’ADN MPO ou NE (% de la norme NET) ». La limite de détection (LOD) a été calculée à partir de l’écart-type (ET) et de la pente de la courbe d’étalonnage (S) comme suit : LOD = 3,3 (SD/S).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Statistiques
<ol><li>Effectuer toutes les analyses statistiques à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique approprié. Ici, SigmaPlot v14.5 a été utilisé. Les pourcentages et les variables continues sont représentés par la médiane de l’intervalle interquartile en raison de la distribution asymétrique de la plupart des paramètres.</li>
	<li>Comparez les taux plasmatiques d’ADN-MPO et d’ADN-E entre les patients atteints de COVID-19 et les témoins sains à l’aide du test de somme des rangs de Wilcoxon. Utilisez l’analyse de corrélation pour explorer la relation entre la densité optique et le pourcentage de norme NET.</li>
</ol>

<ol><li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779(2016).</li>
<li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li>
<li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes%3A+Friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li>
<li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li>
<li>Sørensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li>
<li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li>
<li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).</li>
<li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li>
<li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Techniques+in+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196(2016).</li>
<li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497(2022).</li>
<li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+extracellular+trap+%28NET%29+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587(2017).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li>
<li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li>
<li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424(2020).</li>
<li>Thålin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+citrullinated+histones%3A+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li>
<li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999(2020).</li>
<li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+%28COVID-19%29+patients%3A+A+case+series+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li>
<li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587(2020).</li>
<li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li>
</ol>

Toutes les données générées et/ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié. Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Nous avons décrit une méthode ELISA sandwich dans laquelle MPO ou NE se lie à un site de l’anticorps de capture lors de l’incubation initiale d’échantillons contenant des complexes MPO-ADN ou NE-ADN. Après le lavage, le « sandwich » est complété par l’incubation des échantillons avec un anticorps monoclonal anti-ADN associé à la peroxydase. Après l’élimination de l’anticorps secondaire non lié, le conjugué peroxydase lié est détecté par l’ajout d’un substrat chromogène ABTS peroxydase, ce qui donne un produit final solub...

Cet article décrit une méthode permettant de quantifier la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (NET) dans les fluides biologiques en utilisant le test immuno-enzymatique sandwich (ELISA) pour détecter les complexes de myéloperoxydase (MPO) et d’élastase neutrophile (NE) avec l’ADN 1,2. Les TNE sont composées d’un squelette d’ADN décoré de protéases antimicrobiennes provenant de granules de neutrophiles 3,4. Les complexes MPO-ADN et ADN-E sont tous deux des composants importants et spécifiques des TNE et sont libérés dans l’espace extracellulaire en tant que produits de dégradation des TNE 3,4.
Outre leur rôle physiologique important dans la défense antimicrobienne3, les TNE ont également divers effets pathologiques4,5, notamment la promotion de la thrombogenèse6 et l’aggravation de la septicémie7. Par conséquent, les TNE ont récemment attiré l’attention. Néanmoins, la quantification in vivo des TNE s’est avérée difficile en raison de l’absence d’une méthode de dosage quantitative sensible et fiable.
Quelques méthodes sont disponibles, notamment la mesure directe des TNE par microscopie à fluorescence8,9 et cytométrie en flux 10 et la mesure indirecte de l’ADN acellulaire circulant, des nucléosomes et de l’histone H3 citrulliée, mais chaque méthode a ses propres avantages et limites11. Bien que la méthode microscopique d’immunofluorescence soit spécifique aux TNE et montre clairement la localisation et le degré de formation des TNE, les échantillons sont limités aux tissus de biopsie et aux matériaux sécrétés. De plus, cette méthode doit être réalisée par des chercheurs qualifiés et nécessite beaucoup de temps pour obtenir des résultats. La mesure des niveaux circulants de composants liés aux TNE par cytométrie en flux est facile et fournit des résultats rapidement ; cependant, la méthode n’est pas spécifique aux TNE12.
Nous13 et al. 1,2 avons mis au point un test très sensible et fiable pour mesurer les composants TNE circulants, l’ADN conjugué MPO ou l’ADN conjugué NE, dans le plasma humain avec une technique ELISA modifiée qui utilise des anticorps spécifiques pour MPO ou NE comme anticorps de capture et un anticorps de détection spécifique à l’ADN. Ce test peut également être utilisé ex vivo pour identifier les composants TNE dans les surnageants de culture cellulaire libérés par les neutrophiles activés en réponse à la stimulation du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA).

<table><tbody><tr><td>Polymorphes en 1 étape</td><td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td>Isolement des PMN à partir de sang humain.</td></tr><tr><td>Plaque de microtitration à 96 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>467466</td><td></td></tr><tr><td>solution tampon ABTS</td> à fond plat <td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 530 001</td><td>Contient du perborate de sodium, de l’acide citrique et de l’hydrogénophosphate disodique.</td></tr><tr><td>Comprimés ABTS</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 521 001&nbsp ;</td><td>Chaque comprimé contient 5 mg de substrat ABTS et 60 mg de substances véhiculantes.</td></tr><tr><td>Couvercle en plastique adhésif, Axygen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14222348</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-MPO</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>&nbsp ; 07-496-I</td><td>Conserver à 2-8 °C stable pendant 1 an. L’espèce hôte est le lapin.</td></tr><tr><td>Anticorps anti-NE, clone AHN-10</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>MABS461</td><td>Se conserver à 2-8 &deg ;C. stable pendant 1 an. L’espèce hôte est la souris.</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Biomedical Science</td><td>BR-220700081</td><td>Albumine de la fraction bovine V. Conserver à 2&ndash ; 8 &deg ;C. stable depuis 2 ans.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303M</td><td>Magasin à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>IgG, lapin, contrôle des isotypes</td><td>GENETEX, Inc.</td><td>GTX35035</td><td>Conserver sous forme de solution concentrée à 2&ndash ; 8 &deg ;C.</td></tr><tr><td>IgG1, contrôle de l’isotype de la souris, clone Ci4</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>MABC002</td><td>Conserver sous forme de solution concentrée à 2&ndash ; 8 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Tube de prélèvement sanguin d’héparine de lithium</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur de microplaques</td><td>En tant que société</td><td>NS-P</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>SpectraMax 190&nbsp ;</td><td>Tout lecteur de microplaques capable de lire les longueurs d’onde de 405&ndash ; 490 nm peut utiliser.</td></tr><tr><td>Application de lecteur de microplaques</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>SoftMax pro</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-ADN conjugué à la peroxydase, Détection de la mort cellulaire ELISA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1154467500</td><td>&nbsp ; Bouteille 2. Magasin à 2&ndash ; 8 &deg ;C. stable depuis 1 an.</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acétate</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>P8139</td><td>Activation des PMN à partir du sang humain.</td></tr><tr><td>Solution tamponnée phosphate</td><td>Takara Bio</td><td>T9181</td><td>Conserver à température ambiante. Stable pendant 6 mois.</td></tr><tr><td>SigmaPlot v14.5</td><td>&nbsp ; Systat Software Inc. San Jose, CA, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>190-14901</td><td>Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>t-Octylphénoxypolyéthoxyéthanol, Polyéthylène glycol tert-octylphényléther</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>9002-93-1</td><td>Conserver à température ambiante.</td></tr></tbody></table>

quantification des complexes myéloperoxydase-adn et neutrophile élastase-adn à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test elisa sandwich modifié

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Certains stimuli, tels que les micro-organismes, amènent les neutrophiles à libérer des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), qui sont essentiellement des structures en forme de toile composées d’ADN avec des protéines granulaires, telles que la myéloperoxydase (MPO) et l’élastase neutrophile (NE), et des protéines cytoplasmiques et cytosquelettiques. Bien que l’intérêt pour les TNE ait augmenté récemment, il n’existe pas de méthode de dosage sensible et fiable pour mesurer les TNE en milieu clinique. Cet article décrit un test immuno-enzymatique sandwich modifié pour mesurer quantitativement deux composants des TNE circulantes, l’ADN-MPO et les complexes ADN-NE, qui sont des composants spécifiques des TNE et qui sont libérés dans l’espace extracellulaire en tant que produits de dégradation des TNE. Le test utilise des anticorps monoclonaux spécifiques pour MPO ou NE comme anticorps de capture et un anticorps de détection spécifique de l’ADN. MPO ou NE se lie à un site de l’anticorps de capture lors de l’incubation initiale d’échantillons contenant des complexes MPO-ADN ou NE-ADN. Ce test montre une bonne linéarité et une grande précision inter-essais et intra-essais. Nous l’avons utilisé chez 16 patients atteints de COVID-19 avec le syndrome de détresse respiratoire aiguë qui l’accompagne et avons constaté que les concentrations plasmatiques de MPO-ADN et d’ADN-NE étaient significativement plus élevées que dans le plasma obtenu à partir de témoins sains. Ce test de détection est une méthode fiable, très sensible et utile pour étudier les caractéristiques des TNE dans le plasma humain et les surnageants en culture.

Cette méthode a utilisé un test ELISA sandwich avec des anticorps monoclonaux anti-MPO, anti-NE et anti-ADN pour mesurer l’ADN associé au MPO et l’ADN associé à l’EN (Figure 1). Dans cette méthode, les puits d’une plaque de microtitration ont été recouverts d’un anticorps monoclonal spécifique ou spécifique de l’ON pour capturer le MPO associé à l’ADN et l’ON associé à l’ADN, ainsi que le MPO et l’EN non associés à l’ADN. Pour calculer le coefficient de variabilité (CV) intra-essai, des mesu...

Nous présentons un protocole pour une technique modifiée de dosage immuno-enzymatique sandwich permettant de mesurer quantitativement deux composants des restes de pièges extracellulaires neutrophiles, l’ADN conjugué myéloperoxydase et les complexes ADN conjugués à l’élastase neutrophile, dérivés de neutrophiles activés.

Quantification des complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test ELISA sandwich modifié

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Les TNE ont récemment attiré l’attention, mais la quantification des TNE in vivo s’est avérée difficile. Ce protocole fournit une méthode souhaitable, très sensible et précieuse pour étudier les caractéristiques des TNE en milieu clinique. Cette technique devrait s’étendre à l’évaluation de la sévérité de la septicémie ou du SDRA septique, du syndrome de détresse respiratoire aiguë.Il est largement admis que la régulation des décharges ou des modèles moléculaires associés aux dommages est essentielle pour améliorer l’état clinique de la septicémie. Le plus grand avantage de cette méthode est la quantification précise des restes de TNE circulants tels que l’ADN myéloperoxydase et l’ADN élastase neutrophile en peu de temps. Il est conseillé de faire tourner les échantillons avant le dosage et d’éviter les décongélations répétées.Il est important de respecter les temps d’incubation indiqués dans le protocole. Commencez par diluer les neutrophiles polymorphonucléaires fraîchement isolés à 10 000 cellules par millilitre dans du RPMI 1640 sans rouge de phénol. Tamisez-les dans des boîtes de culture de 35 millimètres.Pour induire des pièges extracellulaires neutrophiles ou NET, stimulez d’abord les polynunucléaires neutrophiles avec 25 nanomolaires PMA. Ensuite, digérez partiellement les pièges extracellulaires en ajoutant 0,6 microgramme par millilitre de DNase I, et incubez le mélange pendant 50 minutes à température ambiante. Maintenant, ajoutez de l’EDTA de cinq millimolaires pour arrêter l’activité de la DNase et collectez le milieu contenant les TNE synthétisées.Centrifugeuse pour éliminer les débris cellulaires. Collectez les surnageants de quatre témoins sains. Mélangez-les à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.Pipeter 100 microlitres d’anti-myéloperoxydase diluée contenant 0,05 microgramme de l’anticorps dans une plaque ELISA. Maintenant, couvrez la plaque avec un couvercle en plastique adhésif pour empêcher l’évaporation de l’échantillon et incubez l’échantillon pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour permettre la liaison des anticorps de capture. Le lendemain, jetez la solution d’anticorps diluée des puits et pipetez 300 microlitres de solution de lavage dans chaque puits.Séchez l’assiette sur une serviette en papier pour enlever l’excédent de PBS. Bloquez chaque puits de la plaque avec 200 microlitres de tampon de blocage. Couvrez-le d’un couvercle en plastique adhésif et obstruez les puits en l’incubant.Après avoir éliminé la solution de blocage des puits et lavé la plaque trois à quatre fois, séchez-la sur une serviette en papier. Ensuite, pipetez 25 microlitres de plasma dans tous les puits, à l’exception du blanc. Et diluez-le avec 75 microlitres de PBS, ce qui donne le volume final du puits à 100 microlitres.Ajoutez ensuite 100 microlitres de PBS dans le puits vierge. Mélangez les échantillons en plaçant la plaque sur un shaker pendant 10 secondes à 250 tr/min à température ambiante. Ajouter deux microlitres de DNase I diluée à 100 dans tous les puits et placer la plaque scellée sur l’agitateur pendant 10 secondes pour bien mélanger les échantillons.Incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Ajoutez un microlitre d’EDTA de 0,5 molaire dans chaque puits pour arrêter la réaction de DNase. Placez ensuite la plaque scellée sur le shaker pendant 15 secondes pour bien mélanger les échantillons.Enfin, incubez la plaque pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour permettre aux composants protéiques des TNE de se fixer aux anticorps de capture. Le lendemain, jetez la solution des puits. Après plusieurs lavages de puits, pipeter 100 microlitres d’anticorps de détection anti-ADN conjugué à la peroxydase diluée dans chaque puits.Incubez la plaque pendant 1 1/2 heure, puis jetez la solution dans les puits. Après avoir lavé les puits trois fois, pipetez 100 microlitres de solution de substrat ABTS dans chaque puits et incubez la plaque scellée sur un agitateur dans l’obscurité. Arrêtez la réaction en ajoutant 50 microlitres d’acide sulfurique à deux molaires.Mélangez le contenu du puits en tapotant soigneusement les côtés de l’assiette. Ensuite, connectez le lecteur de microplaques à l’ordinateur et lancez l’application logicielle. Dans la barre d’état, créez un nouveau test et nommez-le.Définissez ensuite les paramètres de lecture de la plaque en sélectionnant Absorbance comme type de lecture, Endpoint comme mode de lecture et deux comme longueurs d’onde. Ensuite, définissez lambda un sur 405 nanomètres, lambda deux sur 490 nanomètres. Maintenant, sélectionnez l’état Désactivé pour le mélange automatique et l’effacement tout en gardant l’étalonnage automatique sur Activé.Sélectionnez ensuite Lire la plaque entière sous Bandes.Enfin, définissez la priorité de longueur d’onde de la colonne avec Normal comme vitesse de chariot, puis sélectionnez Désactivé sous Lecture automatique. Placez bien la plaque dans le tiroir à instruments et fermez-le. Cliquez sur Lire pour que la plaque soit lue immédiatement.Lisez l’absorbance de chaque puits à 405 nanomètres et soustrayez automatiquement l’absorbance du milieu d’analyse de tous les échantillons inconnus. Des courbes d’étalonnage standard fiables ont été obtenues pour l’ADN-MPO et l’ADN-E lorsque les valeurs d’absorbance ne dépassaient pas 0,93 et 0,9, respectivement. La dose d’OD la plus élevée a été obtenue lorsque 0,6 microgramme par millilitre de DNase I a été appliqué.Les coefficients de variabilité inter-essais pour les complexes chez les témoins sains étaient respectivement de 1,871 et 0,987, tandis que les patients atteints de COVID-19 présentaient des coefficients de variabilité de 2,532 et 2,010, respectivement. Les coefficients moyens de variabilité inter-essais pour l’ADN-MPO et l’ADN-E étaient respectivement de 6,524 et 4,389. La spécificité des anticorps de capture aux complexes MPO-ADN et NE-ADN a montré que les anticorps témoins de type iso réagissaient peu aux complexes.Le pourcentage des deux complexes était plus élevé dans le plasma des patients atteints de COVID-19 par rapport aux témoins sains. Le temps de digestion de la DNase doit être optimisé, sinon une digestion excessive réduira l’absorbance.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Neutrophiles pièges extracellulaires (NET) sont un important mécanisme immunitaire inné pour combattre les bactéries pathogènes, champignons et parasites. Nous décrivons ici les méthodes d'isoler granulocytes neutrophiles dans le sang humain et de les activer pour former NET. Nous présentons les techniques de préparation de visualiser NET en microscopie optique et électronique.

Neutrophiles pièges extracellulaires: Comment générer et de les visualiser

Cette vidéo montre l’induction et la visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles ou TNE dans des neutrophiles pré-marqués à l’aide de sérum de patient contenant des anticorps cytoplasmiques anti-neutrophiles. De plus, l’utilisation d’un colorant d’ADN imperméable et la microscopie à fluorescence permettent de visualiser les TNE.

Induction et visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans des neutrophiles pré-marqués

Des dosages à haut débit sont présentés qui, combinés, fournissent d’excellents outils pour quantifier la libération de TNE par les neutrophiles humains.

High Throughput Mesure de l&#39;ADN extracellulaire de sortie et quantitative Formation NET dans les neutrophiles humains<em&gt; In vitro</em

Lipides sont connus pour jouer un rôle important dans les fonctions cellulaires. Nous décrivons ici une méthode pour déterminer la composition lipidique des neutrophiles, en mettant l'accent sur le taux de cholestérol, en utilisant à la fois HPTLC et HPLC pour obtenir une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents de la formation de piège extracellulaire neutrophile.

Méthodes d&#39;étude Les modifications lipidiques de neutrophiles et de la formation subséquente des neutrophiles pièges extracellulaires

pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont des réseaux d'ADN, les histones et les protéines de neutrophiles. Bien qu'une composante de la réponse immunitaire innée, TNE sont impliqués dans l'auto-immunité et de la thrombose. Ce protocole décrit une méthode simple pour l'isolement des cellules neutrophiles canins et la quantification de TNE en utilisant un dosage de fluorescence de microplaque.

A Fluorescence Assay simple pour Quantification de Canine neutrophiles extracellulaires Piège sortie

Nous décrivons des méthodes pour isoler canines neutrophiles du sang total et de visualiser la formation nette des neutrophiles vivants à l’aide de la microscopie de fluorescence. Également décrites sont des protocoles pour quantifier la formation nette et citrullinés histone H3 (citH3) expression à l’aide de la microscopie par immunofluorescence.

In Vitro Formation canine piège extracellulaire neutrophiles : Analyse dynamique et Quantitative par microscopie de Fluorescence

Ici, nous présentons un protocole pour générer des pièges extracellulaires neutrophiles (NET) et l'exploitation de NETQUANT, une option logicielle entièrement automatique pour la quantification des NET dans les images d'immunofluorescence.

Quantification automatisée basée sur l'image des pièges extracellulaires neutrophiles à l'aide de NETQUANT

Ce protocole décrit un dosage très sensible et très haut débit de neutrophiles piège extracellulaire (NET) pour la quantification semi-automatisé des ex vivo NET formation par microscopie confocale tridimensionnelle par immunofluorescence. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer la formation nette et dégradation après différents stimuli et peut être utilisé pour l’étude des thérapies potentielles axés sur le NET.

Un test haut débit pour évaluer et quantifier les neutrophiles piège extracellulaire Formation

Un protocole pour l’induction et l’analyse de pièges extracellulaires (TNE) in vitro est présenté. La quantification de l’ADN, de la cathélicidine (LL37) et de l’activité enzymatique a fourni des données qui montrent la variabilité de la composition et de la morphologie des TNE induites par des stimuli microbiens et chimiques dans des conditions contrôlées similaires.

Analyse morphologique et compositionnelle des pièges extracellulaires neutrophiles induits par des stimuli microbiens et chimiques

Nous présentons une méthode automatisée à haut débit pour quantifier les pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles en utilisant le système d’analyse de cellules vivantes, couplée à une approche à double colorant dépendant de la perméabilité membranaire.

Technique à haut débit en temps réel pour quantifier la formation de pièges extracellulaires à neutrophiles dans les neutrophiles humains

Ce protocole définit une approche de microscopie à haut débit en temps réel pour visualiser et quantifier la libération de pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles humains in vitro. La méthode reproductible permet d’étudier les caractéristiques et la cinétique de la libération de TNE lors de la stimulation avec des inducteurs de NETosis distincts et permet d’évaluer la pharmacologie des antagonistes de NETosis.

Quantification microscopique en temps réel et à haut débit de la libération de pièges extracellulaires de neutrophiles humains et évaluation de la pharmacologie des antagonistes

Découvrez une méthode ELISA sandwich modifiée pour quantifier les complexes myéloperoxydase-ADN et élastase neutrophile-ADN issus des pièges extracellulaires neutrophiles. Cette technique sensible permet d'évaluer la sévérité de la sepsis et du SDRA.

Quantification des complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test ELISA sandwich modifié (Vidéo) | JoVE Journal

Quantification des complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test ELISA sandwich modifié

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