Quantification des complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test ELISA sandwich modifié

Les TNE ont récemment attiré l’attention, mais la quantification des TNE in vivo s’est avérée difficile. Ce protocole fournit une méthode souhaitable, très sensible et précieuse pour étudier les caractéristiques des TNE en milieu clinique. Cette technique devrait s’étendre à l’évaluation de la sévérité de la septicémie ou du SDRA septique, du syndrome de détresse respiratoire aiguë.

Il est largement admis que la régulation des décharges ou des modèles moléculaires associés aux dommages est essentielle pour améliorer l’état clinique de la septicémie. Le plus grand avantage de cette méthode est la quantification précise des restes de TNE circulants tels que l’ADN myéloperoxydase et l’ADN élastase neutrophile en peu de temps. Il est conseillé de faire tourner les échantillons avant le dosage et d’éviter les décongélations répétées.

Il est important de respecter les temps d’incubation indiqués dans le protocole. Commencez par diluer les neutrophiles polymorphonucléaires fraîchement isolés à 10 000 cellules par millilitre dans du RPMI 1640 sans rouge de phénol. Tamisez-les dans des boîtes de culture de 35 millimètres.

Pour induire des pièges extracellulaires neutrophiles ou NET, stimulez d’abord les polynunucléaires neutrophiles avec 25 nanomolaires PMA. Ensuite, digérez partiellement les pièges extracellulaires en ajoutant 0,6 microgramme par millilitre de DNase I, et incubez le mélange pendant 50 minutes à température ambiante. Maintenant, ajoutez de l’EDTA de cinq millimolaires pour arrêter l’activité de la DNase et collectez le milieu contenant les TNE synthétisées.

Centrifugeuse pour éliminer les débris cellulaires. Collectez les surnageants de quatre témoins sains. Mélangez-les à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.

Pipeter 100 microlitres d’anti-myéloperoxydase diluée contenant 0,05 microgramme de l’anticorps dans une plaque ELISA. Maintenant, couvrez la plaque avec un couvercle en plastique adhésif pour empêcher l’évaporation de l’échantillon et incubez l’échantillon pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour permettre la liaison des anticorps de capture. Le lendemain, jetez la solution d’anticorps diluée des puits et pipetez 300 microlitres de solution de lavage dans chaque puits.

Séchez l’assiette sur une serviette en papier pour enlever l’excédent de PBS. Bloquez chaque puits de la plaque avec 200 microlitres de tampon de blocage. Couvrez-le d’un couvercle en plastique adhésif et obstruez les puits en l’incubant.

Après avoir éliminé la solution de blocage des puits et lavé la plaque trois à quatre fois, séchez-la sur une serviette en papier. Ensuite, pipetez 25 microlitres de plasma dans tous les puits, à l’exception du blanc. Et diluez-le avec 75 microlitres de PBS, ce qui donne le volume final du puits à 100 microlitres.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de PBS dans le puits vierge. Mélangez les échantillons en plaçant la plaque sur un shaker pendant 10 secondes à 250 tr/min à température ambiante. Ajouter deux microlitres de DNase I diluée à 100 dans tous les puits et placer la plaque scellée sur l’agitateur pendant 10 secondes pour bien mélanger les échantillons.

Incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Ajoutez un microlitre d’EDTA de 0,5 molaire dans chaque puits pour arrêter la réaction de DNase. Placez ensuite la plaque scellée sur le shaker pendant 15 secondes pour bien mélanger les échantillons.

Enfin, incubez la plaque pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour permettre aux composants protéiques des TNE de se fixer aux anticorps de capture. Le lendemain, jetez la solution des puits. Après plusieurs lavages de puits, pipeter 100 microlitres d’anticorps de détection anti-ADN conjugué à la peroxydase diluée dans chaque puits.

Incubez la plaque pendant 1 1/2 heure, puis jetez la solution dans les puits. Après avoir lavé les puits trois fois, pipetez 100 microlitres de solution de substrat ABTS dans chaque puits et incubez la plaque scellée sur un agitateur dans l’obscurité. Arrêtez la réaction en ajoutant 50 microlitres d’acide sulfurique à deux molaires.

Mélangez le contenu du puits en tapotant soigneusement les côtés de l’assiette. Ensuite, connectez le lecteur de microplaques à l’ordinateur et lancez l’application logicielle. Dans la barre d’état, créez un nouveau test et nommez-le.

Définissez ensuite les paramètres de lecture de la plaque en sélectionnant Absorbance comme type de lecture, Endpoint comme mode de lecture et deux comme longueurs d’onde. Ensuite, définissez lambda un sur 405 nanomètres, lambda deux sur 490 nanomètres. Maintenant, sélectionnez l’état Désactivé pour le mélange automatique et l’effacement tout en gardant l’étalonnage automatique sur Activé.Sélectionnez ensuite Lire la plaque entière sous Bandes.

Enfin, définissez la priorité de longueur d’onde de la colonne avec Normal comme vitesse de chariot, puis sélectionnez Désactivé sous Lecture automatique. Placez bien la plaque dans le tiroir à instruments et fermez-le. Cliquez sur Lire pour que la plaque soit lue immédiatement.

Lisez l’absorbance de chaque puits à 405 nanomètres et soustrayez automatiquement l’absorbance du milieu d’analyse de tous les échantillons inconnus. Des courbes d’étalonnage standard fiables ont été obtenues pour l’ADN-MPO et l’ADN-E lorsque les valeurs d’absorbance ne dépassaient pas 0,93 et 0,9, respectivement. La dose d’OD la plus élevée a été obtenue lorsque 0,6 microgramme par millilitre de DNase I a été appliqué.

Les coefficients de variabilité inter-essais pour les complexes chez les témoins sains étaient respectivement de 1,871 et 0,987, tandis que les patients atteints de COVID-19 présentaient des coefficients de variabilité de 2,532 et 2,010, respectivement. Les coefficients moyens de variabilité inter-essais pour l’ADN-MPO et l’ADN-E étaient respectivement de 6,524 et 4,389. La spécificité des anticorps de capture aux complexes MPO-ADN et NE-ADN a montré que les anticorps témoins de type iso réagissaient peu aux complexes.

Le pourcentage des deux complexes était plus élevé dans le plasma des patients atteints de COVID-19 par rapport aux témoins sains. Le temps de digestion de la DNase doit être optimisé, sinon une digestion excessive réduira l’absorbance.