Imagerie 3D en accéléré de la dynamique de la paroi cellulaire à l’aide de calcofluor dans les patens de Physcomitrium de mousse

L’imagerie accélérée avec microscopie à fluorescence permet d’observer les changements dynamiques de croissance et de développement aux niveaux cellulaire et subcellulaire. Ce protocole simple pour l’imagerie 3D time-lapse peut étudier directement la dynamique de la paroi cellulaire sur une longue période. Ce protocole utilise un colorant calcofluor pour marquer la dynamique de l’épaisseur de la paroi cellulaire, et ne nécessite donc pas de transformation d’une protéine fluorescente.

Les signaux de calcofluor sont stables et peuvent durer plus d’une semaine. Cette méthode peut être appliquée à de nombreux autres systèmes avec des structures simples contenant des parois cellulaires et peut être colorée par le calcofluor comme dans les plantes à fleurs. Dans ce protocole, les signaux de calcofluor sont stables lorsque ce colorant est mélangé dans le milieu pendant tout le processus d’imagerie accélérée.

Pour commencer, dispersez le tissu de mousse vieux de sept jours dans un microtube de 1,5 millilitre contenant 20 microlitres d’eau stérilisée. Pour le type sauvage, utilisez des pinces pour séparer les protonèmes. Pour le mutant ggb, séparer le protonemata à l’aide d’une pipette AP-1000.

Ajoutez 10 microlitres de calcofluor-blanc stérilisé dans le microtube et laissez le tube debout dans le capot pendant deux minutes pour le colorer. Immédiatement après la coloration, mélanger les plantes avec 200 microlitres de BCDATG refroidi contenant un milieu BCDAT en pipetant cinq fois avec une pipette P1000 et transférer le mélange dans un plat à base de verre de 27 millimètres. S’assurer que les 200 microlitres de BCDATG avec les échantillons sont répartis uniformément sur la surface de la plaque de fond en verre de 27 millimètres pour produire une fine couche de film afin que les échantillons soient à la distance de travail objective pendant l’imagerie.

Après avoir solidifié pendant deux minutes à température ambiante, couvrir la couche mince de trois millilitres de BCDATG refroidi et laisser reposer pendant 10 minutes pour solidifier à nouveau. Sur le fond du plat, tracez neuf lignes chacune dans des directions parallèles et perpendiculaires et marquez les rangées avec des caractères de A à H, et les colonnes avec des nombres de un à huit. Utilisez le haut, le bas, la droite, le milieu et la gauche pour marquer les positions dans chaque carré.

Par exemple, si une plante se trouve dans un carré dans la deuxième ligne, dans la sixième colonne et est positionnée dans la partie supérieure gauche du carré, alors cette plante reçoit le nom de b6 en haut à gauche. Placez le plat à fond en verre sous lumière blanche pendant un à deux jours avant d’être soumis à une imagerie accélérée tous les jours, jusqu’à trois jours. Pour reconstruire les images 3D, ouvrez le fichier ND2 et cliquez sur volume.

Reconstruisez la paroi cellulaire au jour zéro, au premier jour, au troisième jour et au quatrième jour. Après avoir pris chaque image, remettez le plat à base de verre dans la chambre de culture. Les changements dynamiques dans les parois transversales ont été montrés par coloration calcofluor-blanc dans le type sauvage, et les mutants ggb.

Pour les mutants ggb, les lignes pointillées blanches sous chaque image indiquent la paroi cellulaire de surface brisée dans les cellules en expansion et les lignes orange indiquent les cellules sous la surface de la paroi cellulaire en ggb. Les différences de signal calcofluor-blanc peuvent être détectées sur les positions superficielles des cellules et les régions moins densément colorées indiquent une expansion cellulaire chez les mutants ggb ou les sites nouvellement ramifiés dans le type sauvage. Pour la préculture de type sauvage, les plantes en faible lumière rouge du haut pendant cinq jours sont nécessaires pour induire les réponses phototropes des protonèmes afin que les plantes puissent être attachées au fond des plats et que les plantes puissent émerger à la distance de travail objectif pendant l’imagerie, car le blanc de calcofluor peut être utilisé avec d’autres colorants tels que la microsphère.

Des informations supplémentaires sur l’expansion cellulaire peuvent également être étudiées. La dynamique de la paroi cellulaire végétale est essentielle pour une croissance et un développement efficaces ainsi que pour la réponse au signal environnemental. Ce protocole permet la division directe des changements dans les signaux de paroi cellulaire et l’intégration.