Name: Le système Tol2 du poisson zèbre : une approche de transgénèse modulaire et flexible basée sur une passerelle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Découvrez le système Tol2 pour la transgénèse modulaire chez Danio rerio. Cette méthode par clonage gateway permet de générer rapidement des poissons zèbres transgéniques pour l'étude des troubles du spectre alcoolique fœtal.

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La recherche présentée dans cet article a été soutenue par une subvention des National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 à CBL.

Tous les embryons de poisson zèbre utilisés dans cette procédure ont été élevés et élevés conformément aux protocoles IACUCétablis 12. Ces protocoles ont été approuvés par l’Université de Louisville.
NOTE: La souche de poisson-zèbre de type sauvage, AB, et la lignée double mutante bmp4st72;smad5b1100 ont été utilisées dans cette étude. Toute l’eau utilisée dans cette procédure était de l’eau stérile par osmose inverse. Les images confocales ont été prises au microscope confocale à balayage laser. Les mesures de l’endoderme ont été effectuées à l’aide de l’outil de mesure d’ImageJ. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide d’un logiciel statistique.
1. Faire les solutions et les médias
<ol><li>Milieu bactérien: Dissoudre le bouillon LB ou la gélose selon les instructions du fabricant et l’autoclave. Avant de verser le média dans des boîtes de Petri de 100 mm, ajouter de l’ampicilline (50 μg/mL), de la kanamycine (50 μg/mL) ou une combinaison ampicilline/chloramphénicol (50 μg/mL et 30 μg/mL, respectivement).</li>
	<li>Pour obtenir 20x le milieu embryonnaire, dissoudre les éléments suivants dans 1 L d’eau : 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl2, 0,41 g de K2HPO 4, 0,142 g de Na2HPO 4 et4,9 g de MgSO4·7H2O. Filtrer-stériliserla solution mère à l’aide d’un système de filtration sous vide de 0,22 μm, et conserver à 4 °C. REMARQUE: Ignorez le précipité blanc qui se forme; Cela n’aura pas d’impact sur les médias.</li>
	<li>Dans 19 L d’eau, dissoudre 1,2 g de NaHCO3 et ajouter 1 L du milieu embryonnaire 20x pour générer la solution de milieu embryonnaire fonctionnel, et maintenir cette solution à 28 °C.</li>
	<li>Pour une solution de rouge de phénol à 2 %, dissoudre 20 mg de sel de sodium rouge de phénol dans 1 mL d’eau exempte de RNase et conserver à température ambiante.</li>
</ol>2. Moules d’injection d’embryons
<ol><li>Pour fabriquer la plaque d’injection d’agarose, dissoudre l’agarose dans le milieu embryonnaire jusqu’à une concentration finale de 3% en chauffant à ébullition.</li>
	<li>Versez 50 ml d’agarose dans des boîtes de Petri de 100 mm et, pendant que l’agarose est encore liquide, placez doucement le moule d’injection dans l’agarose pour éviter la formation de bulles sous le moule.</li>
	<li>Laissez refroidir les plaques d’agarose. Une fois que l’agarose est solide, retirez le moule d’injection et conservez à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.</li>
</ol>3. Pipettes d’injection
<ol><li>Tirer des capillaires de 1,0 mm (OD) contenant un filament dans des aiguilles à l’aide d’un extracteur de pipette vertical avec le solénoïde réglé sur 2,5 et l’élément chauffant réglé sur 14,6. REMARQUE: Tout extracteur chauffé fonctionnera s’il tire les capillaires en deux aiguilles proprement et uniformément, mais les aiguilles d’injection doivent être tirées dans la semaine 1 suivant l’injection des embryons de poisson zèbre pour des résultats d’injection cohérents.<ol><li>Placez le capillaire dans l’extracteur, serrez la pince à chaque extrémité, puis activez l’élément chauffant.</li>
		<li>Tirez les capillaires pour créer deux aiguilles d’injection.</li>
		<li>Retirez les capillaires de l’extracteur et rangez-les dans une boîte de Petri vide avec une bande de pâte à modeler qui sert de porte-aiguille.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Préparation de l’ARNm de la transposase
<ol><li>Linéariser le plasmide Tol2Kit contenant la transposase avec une endonucléase de restriction NotI en combinant les éléments suivants dans un tube microcentrifuge de 0,5 mL : 10 μL de plasmide de transposase (150 ng/μL), 1,5 μL de tampon de réaction de l’endonucléase de restriction, 0,3 μL d’endonucléase NotI.</li>
	<li>Remplir la réaction jusqu’à 20 μL avec de l’eau sans RNase, puis mélanger et digérer à 37 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Arrêtez la digestion par transposition en ajoutant 1 μL de 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μL de 5 M NH4OAc et 80 μL d’EtOH à 100% à la réaction de digestion, puis mélangez et refroidissez à -20 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Centrifuger la solution à 14 000x g pendant 20 min à 4 °C, puis aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille d’ADN dans de l’eau sans RNase.</li>
	<li>Déterminer la concentration plasmidique linéaire en nanogrammes par microlitre (ng/μL) à l’aide d’un fluoromètre en faisant d’abord couler 2 μL d’un blanc d’eau sans RNase, puis 2 μL du plasmide linéarisé. REMARQUE: Les concentrations plasmidiques varient généralement entre 100 et 200 ng / μL</li>
	<li>Configurez la production d’ARNm SP6 en combinant les composants suivants dans l’ordre dans un tube microcentrifuge de 0,5 mL : 10 μL de 2x NTP/CAP, 2 μL de tampon de réaction 10x, 0,1-1 μg de matrice d’ADN linéaire et 2 μL de mélange d’enzymes SP6.</li>
	<li>Remplir la réaction jusqu’à 20 μL avec de l’eau sans RNase, puis mélanger et incuber à 37 °C pendant 2 h.</li>
	<li>Après 2 h d’incubation, ajouter 1 μL de DNase, bien mélanger et incuber pendant 15 minutes supplémentaires à 37 °C.</li>
	<li>Pour arrêter la réaction SP6, ajouter 30 μL de solution de précipitation LiCl dans le tube de réaction, puis mélanger et refroidir à -20 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Centrifuger la solution à 14 000 x g pendant 20 min à 4 °C pour enduire l’ARNm, puis aspirer le surnageant et laver la pastille d’ARNm avec 1 mL d’EtOH à 80% (dilué avec de l’eau sans RNase).</li>
	<li>Centrifuger la solution à 14 000 x g pendant 20 min à 4 °C pour granuler l’ARNm, puis aspirer le surnageant. Laissez le granulé sécher à l’air.</li>
	<li>Resuspendre la pastille d’ARNm dans 20 μL d’eau exempte de RNase, déterminer la concentration d’ARNm en nanogrammes par microlitre (ng/μL) à l’aide d’un fluoromètre comme décrit à l’étape 4.5 (doit être d’au moins 100 ng/μL), aliquote 100 ng d’ARNm par tube à usage unique, et conserver à −80 °C. REMARQUE: Pour s’assurer que l’ARNm n’est pas dégradé, 2 μL d’ARNm peuvent être rapidement exécutés sur un gel d’électrophorèse d’ADN pour confirmer une seule bande à 1 950 bps.</li>
</ol>5. Clonage de passerelle multisite pour créer des vecteurs d’entrée pour la transgénèse
REMARQUE : Ce protocole est modifié à partir de Kwan et coll.10, la réaction LR étant écrite comme une réaction demi-LR et avec un volume total de 5 μL. Pour générer de nouveaux éléments d’entrée, les réactions BP utilisant des vecteurs donneurs 5', milieu et 3' doivent être utilisées10,13.
<ol><li>Pour effectuer la réaction, recueillir 10 fmol de p5E, pME et p3E et 20 fmol du vecteur de destination (pDest). REMARQUE: La recombinaison LR multisite utilise quatre vecteurs plasmidiques différents: un vecteur d’entrée 5' (p5E), un vecteur d’entrée intermédiaire (pME), un vecteur d’entrée 3' (p3E) et un vecteur de destination (pDest), pour générer une construction transgénique unique flanquée de répétitions Tol2 prêtes à être injectées dans des embryons de poisson zèbre.<ol><li>Identifiez la taille des quatre vecteurs dans les paires de bases à partir de la source plasmidique (Tableau 1, Tol2Kit Wiki page14 ou Addgene11; voir le Tableau des matériaux). REMARQUE: Pour les nouveaux vecteurs, le séquençage plasmidique complet via des sociétés de séquençage commerciales peut fournir la taille exacte du plasmide en bps.</li>
		<li>Déterminer la concentration des quatre vecteurs en nanogrammes par microlitre (ng/μL) à l’aide d’un fluoromètre, comme décrit à l’étape 4.5.</li>
		<li>En utilisant le poids de l’ADN comme 660 g / mol et la taille du plasmide (en bps), calculer le total des nanogrammes (ng) de plasmide nécessaires pour atteindre 10 fmol (vecteurs d’entrée) ou 20 fmol (vecteur de destination). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq01.jpg" style="margin: auto;"> REMARQUE: Le laboratoire Mosimann de l’Université du Colorado, Anschutz Medical Campus, a généré une feuille de calcul disponible gratuitement pour calculer la quantité de plasmide nécessaire (en ng) et le volume (en μL) des vecteurs nécessaires dans la réaction LR15.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour générer la construction décrite ci-dessous, sox17: EGFPCAAX, utilisez les vecteurs suivants : un vecteur p5E contenant le promoteur sox17 du poisson zèbre, dontla taille est de 6 918 pb ; un vecteur pME contenant l’EGFP prénylé, d’une taille10 de 3 345 pb; un vecteur p3E contenant la séquence de signaux poly A tardifs SV40, d’une taille10 de 2 838 pb; et le pDest, qui est de 5 883 pb en taille10.</li>
	<li>À l’aide de la concentration plasmidique déterminée à l’étape 5.1.2 et de la quantité en nanogrammes (ng) pour chaque vecteur (étape 5.1.3), calculer les microlitres totaux (μL) de chaque plasmide nécessaires pour atteindre 10 fmol (vecteurs d’entrée) ou 20 fmol (vecteur de destination), puis diviser cela par deux pour une utilisation dans les réactions demi-LR de 5 μL (toutes les valeurs énumérées ci-dessous sont énumérées dans le tableau 2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq02v2.jpg" style="margin: auto;"><ol><li>Pour générer 10 fmol de p5E-sox17, utilisez 45,66 ng (à une concentration de 140,3 ng/μL) et diluez avec de l’eau stérile d’un facteur 4 pour obtenir 0,65 μL.</li>
		<li>Pour générer 10 fmols de pME-EGFPCAAX, utiliser 22,08 ng (à une concentration de 213,5 ng/μL) et diluer avec de l’eau stérile par un facteur de 10 pour obtenir 0,52 μL.</li>
		<li>Pour générer 10 fmol de p3E-poly A, utiliser 15,73 ng (à une concentration de 276,1 ng/μL) et diluer avec de l’eau stérile par un facteur de 20 pour obtenir 0,57 μL.</li>
		<li>Pour 20 fmol du vecteur de destination, utiliser 77,66 ng de pDest (à une concentration de 307,3 ng/μL) et diluer avec de l’eau stérile par un facteur de 5 pour obtenir 1,63 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour mettre en place une réaction demi-LR de 5 μL, combinez les volumes de p5E, pME, p3E et pDest déterminés à l’étape 5.3 dans un tube microcentrifuge de 0,5 mL, puis ajoutez de l’eau stérile pour atteindre un volume de réaction total de 4 μL.</li>
	<li>Tourbillonner vigoureusement le mélange d’enzymes LR 2x pendant 1 min chacun pour assurer un mélange approprié, puis ajouter 1 μL à la réaction et bien mélanger.</li>
	<li>Incuber à 25 °C pendant la nuit (16+ h).</li>
	<li>Arrêter la réaction LR en ajoutant 0,5 μL de protéinase K (2 μg/μL), incuber à 37 °C pendant 10 min, puis refroidir à température ambiante.</li>
	<li>Transformez 3-4 μL de plasmide en cellules décongelées et chimiquement compétentes en ajoutant le plasmide et en laissant les cellules reposer sur la glace pendant 25-30 min.</li>
	<li>Pendant que les cellules reposent sur de la glace, réchauffer deux plaques de gélose LB-ampicilline à température ambiante.</li>
	<li>Choc thermique des cellules dans un bain-marie à 42°C pendant 30 s précises.</li>
	<li>Après le choc thermique, ajouter 250 μL de milieux liquides riches et sans antibiotiques aux cellules, et incuber en agitant à 37 °C pendant 1,5 h.</li>
	<li>Étaler 300 μL de bactéries sur une plaque d’ampicilline et incuber à 37 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Le lendemain matin, examiner les colonies pour détecter la présence de deux phénotypes, clair et opaque, choisir les colonies claires (comme décrit dans Kwan et al.10) une à la fois, inoculer la culture liquide, puis agiter à 37 °C pendant la nuit. REMARQUE: Les colonies claires contiennent presque toujours la bonne colonie LR (&gt;85% du temps).</li>
	<li>À l’aide d’une trousse commerciale conforme aux instructions du fabricant, effectuer une préparation plasmidique sur chaque culture liquide et digérer diagnostiquement chaque plasmide pour confirmer la taille appropriée de la construction transgénique, ce qui indique que la réaction de la passerelle LR a fonctionné correctement.</li>
	<li>Retransformez les constructions transgéniques correctes en utilisant le protocole de transformation bactérienne standard décrit aux étapes 5.4-5.12 en utilisant 0,5-1 μL du plasmide, et incuber seulement à 37 °C pendant 1 h.</li>
	<li>Resemer les colonies et confirmer que chacune a la construction transgénique LR comme à l’étape 5.14.</li>
	<li>Déterminer la concentration plasmidique comme décrit à l’étape 4.5 (au moins 150 ng/μL est nécessaire pour l’injection d’embryons).</li>
</ol>6. Injection du transgène dans les embryons
<ol><li>Décongeler un échantillon d’ARNm transposase à usage unique et une construction transgénique Tol2 sur de la glace et avertir une plaque d’injection d’agarose à température ambiante.</li>
	<li>Combinez les éléments suivants sur la glace : 150 ng de plasmide, 100 ng d’ARNm de transposase et 2 % de rouge de phénol (0,3 μL). Ensuite, ajoutez de l’eau sans ARN pour compléter le volume à 3 μL.</li>
	<li>Transférer un embryon au stade cellulaire à l’aide de pipettes de transfert sur la plaque d’injection (décrite à l’étape 2) remplie de ME recouvrant complètement l’agar-agar, puis presser doucement environ 50 à 75 embryons par fente de la plaque d’injection.</li>
	<li>Ajouter le mélange ARNm/plasmide/rouge phénol à l’extrémité ouverte d’une aiguille d’injection capillaire, placer l’aiguille capillaire dans l’armature de la plate-forme d’injection et allumer la plate-forme d’injection. REMARQUE:La plate-forme d’injection utilise du gaz comprimé, tel que de l’air, pour pulser le volume souhaité (décrit à l’étape 6.5) du mélange ARNm/plasmide/rouge phénol dans l’embryon lorsqu’il est activé.</li>
	<li>Abaissez l’aiguille capillaire dans l’EM de la plaque d’injection et brisez l’embout à l’aide d’une pince pour permettre à seulement une petite quantité de mélange ARNm/plasmide/rouge phénol d’être pompée par la plate-forme d’injection.</li>
	<li>Injecter les embryons avec un petit bolus de 3 nL du mélange ARNm/plasmide/rouge phénol dans le corps cellulaire de l’embryon. REMARQUE: Un bolus de 3 nL est un volume de mélange d’ARNm / plasmide / rouge phénol auquel sept bolus peuvent théoriquement s’adapter également à travers la ligne médiane de l’embryon.</li>
	<li>Lorsque l’injection des embryons est terminée, retirez-les de la plaque d’injection en les sortant doucement de la fente et en les transférant-pipetage dans une boîte de Petri de 100 mm avec EM frais (environ 40 ml), puis incuber à 28,5 °C pour permettre aux embryons de se développer.</li>
</ol>7. Dépistage des embryons en vue de leur insertion transgénique
<ol><li>Pour l’expression des protéines fluorescentes, choisir le stade de développement approprié où le transgène fluorescent doit être exprimé et rechercher la présence de fluorescence au microscope à dissection fluorescente. NOTE: Ces embryons seront en mosaïque dans leur expression et montreront une insertion génomique de la construction transgénique.</li>
	<li>Dépister les transgènes non fluorescents par criblage d’un marqueur transgénique fluorescent (tel que décrit à l’étape 7.1), tel que la GFP pilotée par le promoteur cardiaque spécifique du gène cmlc2 ou mCherry piloté par le promoteur spécifique du cristallin de l’αcyrstalline, qui sont contenus dans des vecteurs de destination distincts.</li>
	<li>Permettre aux embryons positifs pour l’insertion transgénique de se développer pleinement jusqu’aux stades de poisson-zèbre adulte.</li>
	<li>Une fois que les poissons transgéniques potentiels atteignent l’âge de reproduction, les dépister individuellement pour la transmission germinale et l’expressivité transgénique en les élevant à des poissons-zèbres de type sauvage.</li>
	<li>Les adultes dont les embryons se développent normalement et donnent l’expression transgénique la plus forte et la plus appropriée sont conservés comme des lignées uniques de poissons-zèbres transgéniques pour les travaux et analyses futurs. REMARQUE : Comme approche alternative au dépistage de l’insertion génomique de constructions transgéniques, concevoir des amorces de PCR qui amplifient uniquement la construction transgénique et non l’ADN de type sauvage.</li>
</ol>

<ol><li>Denny, L., Coles, S., Blitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome+and+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders.</a> American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).</li>
<li>Popova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comorbidity+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).</li>
<li>Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+spectrum+disorders%3A+Characteristics%2C+complications%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Mental+Health+Journal%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment.</a> Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).</li>
<li>Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+presentation%2C+diagnosis%2C+and+management+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder.</a> The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).</li>
<li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).</li>
<li>Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gene-alcohol+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of gene-alcohol interactions.</a> Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).</li>
<li>Fernandes, Y., Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Genesis. 59 (11), 23460(2021).</li>
<li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis%3A+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li>
<li>Choe, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+fluorescent+zebrafish+lines+that+have+revolutionized+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research.</a> Lab Animal Research. 37 (1), 26(2021).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+A+multisite+gateway-based+construction+kit+forTol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Don, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tol2+gateway-compatible+toolbox+for+the+study+of+the+nervous+system+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease.</a> Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).</li>
<li>Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols">https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols</a> (2017).</li>
<li>The Tol2Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page">http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</a> (2007).</li>
<li>Mosimann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+gateway+calculations%3A+Excel+spreadsheet%5BTitle%5D)+AND+%22protocols.io%22%5BJournal%5D)">Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet.</a> protocols.io. , (2022).</li>
<li>Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-endodermal+interactions+are+required+for+pancreatic+%CE%B2+cell+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction.</a> Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).</li>
<li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharyngeal+pouches+and+clefts%3A+Development%2C+evolution%2C+structure+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).</li>
<li>Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp+signaling+mediates+endoderm+pouch+morphogenesis+by+regulating+Fgf+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish.</a> Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).</li>
<li>Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+an+emerging+model+system+in+ecotoxicology+and+toxicology%3A+Historical+review%2C+recent+advances%2C+and+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends.</a> Science of The Total Environment. 848, 157665(2022).</li>
<li>Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+the+toxicant+screening+model%3A+Transgenic+and+omics+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches.</a> Aquatic Toxicology. 234, 105813(2021).</li>
<li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109 (3), 577-584 (1988).</li>
<li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication%2C+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103 (2), 403-412 (1990).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2-mediated+transgenesis%2C+gene+trapping%2C+enhancer+trapping%2C+and+Gal4-UAS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le poisson zèbre est idéal pour étudier l’impact de l’exposition à l’éthanol sur le développement et les états pathologiques 7,8. Le poisson zèbre produit un grand nombre d’embryons translucides, fécondés à l’extérieur et génétiquement traitables, ce qui permet l’imagerie en direct de plusieurs tissus et types de cellules marqués par des transgènes simultanément dans de multiples contextes environnementaux19,20...

L’exposition prénatale à l’éthanol donne lieu à un continuum de déficits structurels et de déficiences cognitives appelés troubles causés par l’alcoolisation fœtale (ETCAF)1,2,3,4. Les relations complexes entre de multiples facteurs rendent difficile l’étude et la compréhension de l’étiologie de l’ETCAF chez les humains. Pour résoudre ce problème, une grande variété de modèles animaux ont été utilisés. Les outils biologiques et expérimentaux disponibles dans ces modèles se sont avérés cruciaux pour développer notre compréhension de la base mécaniste de la tératogénicité de l’éthanol, et les résultats de ces systèmes modèles ont été remarquablement cohérents avec ce que l’on trouve dans les études sur l’éthanol humain 5,6. Parmi ceux-ci, le poisson zèbre est apparu comme un modèle puissant pour étudier la tératogenèse de l’éthanol 7,8, en partie en raison de leur fécondation externe, de leur fécondité élevée, de leur traçabilité génétique et de leurs embryons translucides. Ces forces se combinent pour rendre le poisson zèbre idéal pour les études d’imagerie en temps réel de l’ETCAF à l’aide de lignées de poissons-zèbres transgéniques.
Le poisson-zèbre transgénique a été largement utilisé pour étudier de multiples aspects du développement embryonnaire9. Cependant, la création de constructions transgéniques et de lignées transgéniques ultérieures peut être extrêmement difficile. Un transgène standard nécessite un élément promoteur actif pour piloter le transgène et un signal poly A ou « queue », le tout dans un vecteur bactérien stable pour le maintien général du vecteur. La génération traditionnelle d’une construction transgénique à plusieurs composants nécessite plusieurs étapes de sous-clonagechronophages 10. Les approches basées sur la PCR, telles que l’assemblage Gibson, peuvent contourner certains des problèmes associés au sous-clonage. Cependant, des amorces uniques doivent être conçues et testées pour la génération de chaque construction transgénique unique10. Au-delà de la construction transgénique, l’intégration génomique, la transmission germinale et le criblage d’une intégration correcte des transgènes ont également été difficiles. Ici, nous décrivons un protocole d’utilisation du système de transgénèse Tol2 basé sur des transposons (Tol2Kit)10,11. Ce système modulaire utilise le clonage de passerelle multisite pour générer rapidement plusieurs constructions transgéniques à partir d’une bibliothèque en constante expansion de vecteurs « d’entrée » et de « destination ». Les éléments transposables Tol2 intégrés augmentent considérablement le taux de transgénèse, permettant la construction rapide et l’intégration génomique de plusieurs transgènes. À l’aide de ce système, nous montrons comment la génération d’une lignée de poisson-zèbre transgénique endodermique peut être utilisée pour étudier les défauts structurels spécifiques aux tissus sous-jacents à l’ETCAF. En fin de compte, dans ce protocole, nous montrons que la configuration modulaire et la construction de constructions transgéniques aideront grandement la recherche sur l’ETCAF à base de poisson zèbre.

<table><tbody><tr><td>Addgene Tol2 toolbox</td><td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Air</td><td></td><td></td><td>Fourni directement par l’université</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID Capillaire</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>BioVision</td><td>2486</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent à dissection</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Lawson Lab Donor Plasmid Prep</td><td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9724</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Faiblement EEO/Polyvalent/Biologie moléculaire Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus Enzyme</td><td>Fisher Scientific</td><td>12538200 Sulfate de</td><td></td></tr><tr><td>magnésium (heptahydraté)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Porte-micropipette</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MIMPH-M-PIP</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation 0,5 mL&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>10025-724</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation 1,5 mL&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>10025-716</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Instrumentation scientifique appliquée</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de micropipette 10 &mu ; L&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de micropipette 1000 &mu ; L&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de micropipette 200 &mu ; L&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcription</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Mosimann Lab Tol2 Feuille de calcul</td><td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri 100 mm&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Phénol Sel de sodium rouge</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4758-5G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p1000L Micropipette</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p200L Micropipette</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p2L Micropipette</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium (dibasique)</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>Injecteur de pression</td><td>Instrumentation scientifique appliquée</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium (dibasique)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Stericup .22 & micro ; m système de filtration sous vide&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>Tol2 Page Wiki</td><td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Top10 Chimiquement compétent E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de pipette vertical</td><td>David Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish moule de micro-injection</td><td>Outils de science adaptative</td><td>i34</td><td></td></tr></tbody></table>

le système tol2 du poisson zèbre : une approche de transgénèse modulaire et flexible basée sur une passerelle

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Les troubles causés par l’alcoolisation fœtale (ETCAF) sont caractérisés par un ensemble très variable de défauts structurels et de déficiences cognitives qui surviennent en raison de l’exposition prénatale à l’éthanol. En raison de la pathologie complexe de l’ETCAF, les modèles animaux se sont révélés essentiels à notre compréhension actuelle des défauts de développement induits par l’éthanol. Le poisson zèbre s’est avéré être un modèle puissant pour examiner les défauts de développement induits par l’éthanol en raison du degré élevé de conservation de la génétique et du développement entre le poisson zèbre et les humains. En tant que système modèle, le poisson zèbre possède de nombreux attributs qui le rendent idéal pour les études de développement, y compris un grand nombre d’embryons fécondés à l’extérieur qui sont génétiquement traitables et translucides. Cela permet aux chercheurs de contrôler avec précision le moment et le dosage de l’exposition à l’éthanol dans de multiples contextes génétiques. Un outil génétique important disponible chez le poisson zèbre est la transgénèse. Cependant, générer des constructions transgéniques et établir des lignées transgéniques peut être complexe et difficile. Pour résoudre ce problème, les chercheurs sur le poisson zèbre ont établi le système de transgénèse Tol2 basé sur des transposons. Ce système modulaire utilise une approche de clonage de passerelle multisite pour l’assemblage rapide de constructions transgéniques complètes basées sur des transposons Tol2. Ici, nous décrivons la boîte à outils flexible du système Tol2 et un protocole pour générer des constructions transgéniques prêtes pour la transgénèse du poisson zèbre et leur utilisation dans les études sur l’éthanol.

Pour générer les constructions transgéniques, nous avons utilisé le système de transgénèse Tol2. Trois vecteurs d’entrée, dont p5E, qui contient les éléments promoteur/amplificateur de gène, pME, qui contient le gène à exprimer par les éléments promoteurs/amplificateurs, et p3E qui, au minimum, détient la queue polyA, ont été utilisés pour générer la construction transgénique via le clonage LR de passerelle multisite. Le vecteur de destination, pDest, fournit les répétitions Tol2 pour l’insertion génomique de la...

Ce travail décrit un protocole pour le système modulaire de transgénèse Tol2, une méthode de clonage basée sur une passerelle pour créer et injecter des constructions transgéniques dans des embryons de poisson zèbre.

Le système Tol2 du poisson zèbre : une approche de transgénèse modulaire et flexible basée sur une passerelle

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Le poisson zèbre transgénique s’est avéré essentiel à notre compréhension du développement embryonnaire. Le système Tol2 est un outil polyvalent qui permet aux chercheurs de générer rapidement et systématiquement plusieurs poissons-zèbres transgéniques pour les études sur l’ETCAF. La conception modulaire et la facilité de génération de nouveaux composants du kit font du système Tol2 un outil polyvalent pour générer de nouveaux transgéniques sans avoir à redessiner les composants du kit.Mon conseil aux chercheurs qui pratiquent cette technique pour la première fois est de faire plusieurs essais pour s’entraîner à la précision de la génération et de l’injection de constructions transgéniques. Pour commencer, linéariser le plasmide du kit Tol2 contenant de la transposase avec une endonucléase de restriction nulle en combinant 10 microlitres de plasmide transposase, 1,5 microlitre de tampon de réaction de l’endonucléase de restriction et 0,3 microlitre d’endonucléase nulle dans un tube microcentrifuge de 500 microlitres. Remplissez la réaction jusqu’à 20 microlitres avec de l’eau sans ARNase.Mélanger et digérer à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, arrêtez la digestion en ajoutant un microlitre d’EDTA 0,5 molaire, deux microlitres d’acétate d’ammonium molaire et 80 microlitres d’éthanol à 100% au mélange réactionnel. Mélanger et refroidir à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, centrifuger et aspirer le surnageant avant de remettre en suspension la pastille d’ADN dans de l’eau aRNASE. Ensuite, déterminez la concentration plasmidique linéaire en nanogrammes par microlitre sur un fluoromètre en faisant couler deux microlitres de l’échantillon. Configurez la production d’ARNm SP6 en combinant 10 microlitres de NTP / CAP 2X, deux microlitres de tampon de réaction 10X, 0,1 à un microgramme de matrice d’ADN linéaire dans deux microlitres de mélange d’enzymes SP6 dans un tube de 500 microlitres.Remplissez la réaction jusqu’à 20 microlitres avec de l’eau sans ARNase et mélangez avant d’incuber à 37 degrés Celsius. Après deux heures, ajoutez un microlitre d’ADNASE, mélangez bien et incuber pendant 15 minutes supplémentaires. Arrêtez la réaction en ajoutant 30 microlitres de solution de précipitation de chlorure de lithium.Mélanger et refroidir à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, centrifuger la solution pour granuler l’ARNm et aspirer le surnageant avant de laver la pastille avec un millilitre d’éthanol à 80%. Sécher la pastille à l’air libre et la remettre en suspension dans 20 microlitres d’eau sans ARNase.Déterminer la concentration d’ARNm à l’aide d’un fluoromètre, puis aliquote 100 nanogrammes d’ARNm par tube à usage unique et stocker à moins 80 degrés Celsius. Pour effectuer la réaction, recueillir 10 femtomole chacun de P5E, PME et P3E et 20 femtomole du vecteur de destination PDEST. Identifier la taille des quatre vecteurs et paires de bases à partir de la source plasmidique.Après avoir déterminé la concentration des quatre vecteurs, en utilisant le poids de l’ADN comme 660 grammes par mole et la taille du plasmide et les paires de bases, calculer le nombre total de nanogrammes de plasmide nécessaires pour atteindre 10 femtomole pour les vecteurs d’entrée ou 20 femtomole pour le vecteur de destination. Ensuite, générez la construction sox17:EGFP-CAAX en utilisant les composants décrits dans le manuscrit. En utilisant la concentration plasmidique, calculez les microlitres totaux de chaque plasmide nécessaires pour atteindre 10 femtomole ou 20 femtomole, puis divisez cela par deux pour l’utilisation dans les réactions de demi-LR de cinq microlitres.Générer 10 femtomole de P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) et 20 femtomole de vecteur de destination. Mettre en place cinq microlitres de réaction demi-LR en combinant les volumes de P5E, PME, P3E et PDEST dans un tube de 500 microlitres. Ajoutez ensuite de l’eau stérile pour faire le volume quatre microlitres.Vortex le mélange d’enzymes LR deux fois pendant une minute chacun avant d’ajouter un microlitre à la réaction et bien mélanger avant d’incuber à 25 degrés Celsius. Le lendemain, arrêtez la réaction LR en ajoutant 0,5 microlitre de protéinase K.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis refroidir à température ambiante. Ensuite, transformez trois à quatre microlitres du plasmide en cellules chimiquement compétentes décongelées en ajoutant le plasmide et en laissant les cellules reposer sur de la glace pendant 25 à 30 minutes.Ensuite, choc thermique les cellules dans un bain-marie de 42 degrés Celsius pendant 30 secondes. Après le choc thermique, ajoutez 250 microlitres de milieux liquides riches sans antibiotiques aux cellules et incuber en agitant à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Étaler 300 microlitres de suspension bactérienne sur une plaque d’ampicilline Luria-Bertani et incuber pendant une nuit.Le lendemain, dépister les colonies pour détecter la présence de deux phénotypes : clair et opaque. Choisissez les colonies claires une à la fois, inoculez la culture liquide et agitez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Combinez 150 nanogrammes de plasmide, 100 nanogrammes d’ARNm de transposase et 2% de rouge de phénol sur glace.Ajoutez ensuite de l’eau sans ARN pour obtenir un volume de trois microlitres. Transférer un embryon au stade cellulaire à l’aide de pipettes de transfert dans la plaque d’injection remplie d’EM recouvrant complètement la gélose puis appuyer doucement sur environ 50 à 75 embryons par fente de la plaque d’injection. Ajouter le mélange de rouge de phénol plasmidique d’ARNm à l’extrémité ouverte d’une aiguille d’injection capillaire.Placez l’aiguille capillaire dans l’armature de l’appareil d’injection et allumez l’appareil d’injection. Abaissez l’aiguille dans la plaque d’injection et cassez l’embout à l’aide d’une pince pour ne permettre qu’à une petite quantité de mélange d’être pompée par l’appareil d’injection. Injectez aux embryons un bolus de trois nanolitres du mélange de rouge de phénol plasmidique d’ARNm dans le corps cellulaire de l’embryon.Lorsque vous avez terminé, retirez les embryons de la plaque d’injection en les sortant doucement de la fente et transférez-les en les pipetant dans une boîte de Petri de 100 millimètres avec EM frais. Incuber à 28,5 degrés Celsius. Choisissez le stade de développement approprié pour l’expression des transgènes fluorescents et dépister au microscope à dissection fluorescente. Dépister les transgènes non fluorescents en criblant les marqueurs transgéniques fluorescents tels que la GFP pilotée par le promoteur cardiaque spécifique du gène Cmlc2.Lorsque les embryons positifs pour l’insertion transgénique se développent chez les adultes et atteignent l’âge de reproduction, les dépister individuellement pour la transmission germinale et l’expressivité transgénique en les élevant en poisson zèbre de type sauvage. Des exemples de colonies bactériennes obtenues à partir de la transformation de la recombinaison LR sont présentés. Les colonies transparentes contenaient un produit de recombinaison LR correct plus de 85% du temps, tandis que les colonies opaques ne contenaient jamais de produit de recombinaison correct.La digestion diagnostique des trois colonies à partir de la transformation des produits de recombinaison LR a montré que la seule colonie opaque ne contenait aucun plasmide, tandis que les deux colonies claires contenaient une seule bande à 9 544 paires de bases. L’ARNm transposase à 1 950 paires de bases est illustré ici. L’expression de l’endoderme en mosaïque EGFP-CAAX a été observée dans 75% des embryons injectés.L’expression de marqueurs transgéniques de Cmlc2 EGFP dans le cœur en développement a été observée 24 heures après la fécondation. Le poisson zèbre adulte a eu la transmission germinale d’embryons fluorescents générés par sox17:EGFP-CAAX avec l’endoderme entièrement marqué avec EGFP-CAAX. La longueur antéro-postérieure de l’endoderme et la longueur dorso-ventrale de chaque poche des poches un à cinq ont été mesurées chez des embryons mutants BMP sauvages témoins et traités à l’éthanol.La longueur totale de l’endoderme n’a pas été affectée par le génotype ou le traitement. Cependant, les poches un et trois ont montré des augmentations significatives de la longueur de la poche entre les embryons de type sauvage non traités et traités à l’éthanol, mais des diminutions significatives de la longueur entre les mutants BMP non traités et traités à l’éthanol. La poche deux a montré des augmentations significatives de la taille de la poche entre les groupes de type sauvage non traité et traité à l’éthanol et les groupes mutants BMP respectivement.Lors de la tentative de cette procédure, il est essentiel d’être précis dans le pipetage et la dilution du système Tol2, ainsi que dans le fait de frapper le corps cellulaire pendant l’injection d’embryons.

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