Name: Dépistage des spermatozoïdes pour l’isolement rapide des modifications de la lignée germinale chez le poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Découvrez une méthode de dépistage des spermatozoïdes pour isoler rapidement les modifications de la lignée germinale chez Danio rerio. Cette approche utilise PCR, enzymes de restriction et électrophorèse sur gel.

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Nous tenons à remercier Anna Hindes de la faculté de médecine de l’Université de Washington pour ses efforts initiaux dans l’obtention d’ADN génomique de sperme de bonne qualité en utilisant la méthode du coup chaud. Ce travail a été financé par l’Institut national de l’arthrite et des maladies musculo-squelettiques et cutanées des National Institutes of Health sous attribution (R01AR072009 à R.S.G.).

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<li>Draper, B. W., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+zebrafish+sperm+cryopreservation+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1395(2009).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
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Ce protocole décrit une méthode pour caractériser rapidement des modifications présumées du génome ou des mutations ciblées à l’aide de la technologie CRISPR-Cas par analyse ciblée sur les génomes des spermatozoïdes masculins F0. Ce protocole devrait se prêter à d’autres modèles animaux où le sperme est facilement disponible pour l’échantillonnage sans euthanasie. Cette méthode augmentera le débit de criblage pour les modifications souhaitées et est particulièrement utile pour identifier les rares événements de knock-in ...

Le système CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas est un outil puissant pour effectuer une mutagénèse spécifique aux loci et une édition précise du génome dans le système modèle Danio rerio (poisson zèbre) 1,2,3,4. La Cas-ribonucléoprotéine (RNP) est composée de deux composants principaux : une endonucléase Cas (communément Cas9 ou Cas12a) et un ARN guide synthétique spécifique au locus (ARNs)5. Ensemble, le Cas-RNP génère une rupture double brin (DSB) dans le locus désiré qui peut être réparée par l’un des deux mécanismes de réparation intrinsèques. Le mécanisme de réparation de l’assemblage d’extrémité non homologue (NHEJ) est sujet aux erreurs et entraîne souvent diverses insertions ou suppressions (indels) autour de l’ORD. Ces indels peuvent être délétères s’ils introduisent une mutation de décalage de trame ou un arrêt prématuré dans la séquence protéique résultante. Alternativement, le mécanisme de réparation dirigée par homologie (HDR) utilise un modèle de donneur avec des régions d’homologie entourant le site DSB pour réparer les dommages. Les chercheurs peuvent tirer parti du système HDR pour générer des modifications génomiques précises. Plus précisément, ils peuvent co-injecter une construction de donneur d’ADN double brin qui contient les modifications souhaitées ainsi que les régions d’homologie flanquant le site DSB dans le génome. L’économie d’échelle accrue pour ces composants CRISPR produits commercialement a considérablement réduit les obstacles au dépistage de plusieurs loci et à la mise en place d’efforts à plus grande échelle pour une édition précise du génome. Cependant, dans les modèles animaux à reproduction sexuée, un goulot d’étranglement majeur est l’identification et l’isolement des animaux mutants stables à la lignée germinale.
Le système modèle du poisson zèbre présente plusieurs qualités clés qui améliorent son utilisation dans les études génétiques inverses. Ils sont faciles à élever en grand nombre avec un équipement de base pour les logements aquatiques, et les femelles présentent une fécondité élevée toute l’année6. De plus, leur ponte externe et leur fécondation les rendent propices à la micro-injection de composants CRISPR/Cas. Le Cas-RNP est couramment injecté dans des embryons de poisson-zèbre au stade unicellulaire pour générer des DSB / réparation qui sont, en théorie, hérités par toutes les cellules filles. Cependant, les génomes diploïdes nécessitent deux événements DSB/réparation pour mutagène les deux chromosomes homologues. De plus, bien que le Cas-RNP soit injecté au stade monocellulaire, le DSB/réparation peut ne pas se produire avant des points ultérieurs du développement. Ensemble, ces facteurs contribuent à la nature mosaïque des poissons injectés de F0. Une pratique courante consiste à croiser les poissons injectés par F0 et à dépister la descendance F1 pour détecter les indels / modifications spécifiques. Cependant, comme tous les poissons injectés par F0 ne possèdent pas de mutations germinales, cette pratique entraîne de nombreux croisements improductifs qui ne génèrent pas la modification souhaitée. Le dépistage de la lignée germinale F0 plutôt que du tissu somatique F1 augmente la probabilité d’isoler la modification de la lignée germinale souhaitée et réduit le nombre d’animaux requis dans ce processus.
Le sperme peut facilement être recueilli à partir de poisson-zèbre injecté par F0 sans avoir besoin d’euthanasie. Cette caractéristique permet la cryoconservation et la redérivation de stocks de spermatozoïdes congelés7 mais peut également être exploitée pour dépister, identifier et isoler rapidement les porteurs germinales des mutations génomiques souhaitées 8,9. Brocal et al. (2016) ont précédemment décrit une méthode basée sur le séquençage pour le dépistage des modifications de la lignée germinale chez le poisson-zèbre mâleinjecté F0 10. Bien qu’utile pour identifier les allèles mutés présents dans la lignée germinale, cette approche peut devenir coûteuse à haut débit et peut ne pas être accessible à tous les laboratoires. En revanche, le protocole actuel offre une stratégie accessible et rentable basée sur l’électrophorèse pour identifier les modifications de la lignée germinale. Plus précisément, ce protocole décrit une méthode robuste pour le dépistage et l’isolement des mutations germinales à des loci spécifiques en utilisant l’électrophorèse sur gel d’agarose à haute résolution. En outre, ce protocole décrit une stratégie similaire pour identifier l’intégration réussie d’un concept de donneur contenant des modifications spécifiques. Comme toujours, si des modifications spécifiques sont souhaitées, les stratégies basées sur le séquençage peuvent être exécutées en tandem avec le protocole décrit ci-dessous. Bien que ce protocole soit spécifique au système modèle du poisson zèbre, ces principes devraient être adaptables à tout modèle dans lequel la collecte de spermatozoïdes est une procédure de routine. Ensemble, ces stratégies permettront d’identifier les mâles injectés de F0 avec des indels / modifications germinales qui peuvent être résolus sur un gel après une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) standard et / ou un digestion de restriction.

<table><tbody><tr><td>Poudre d’agarose&nbsp ;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Bassins d’élevage</td><td>Carolina Biological&nbsp ;</td><td></td><td></td>161937</tr><tr><td>Enzyme de restriction BstNI</td><td>NEB</td><td>R0168S</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 Endonuclease</td><td>IDT</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>échelle d’ADN, 100 pb&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>FERSM0241</tr><tr><td>dnah10 donateur construct&nbsp ; &nbsp ;</td>Oligo d’ADN <td>Sigma-Aldrich</td><td>en tube ; 0,025 nM, purification par dessalage standard, sec. Liaison phosphorothioate sur le donneur aux trois premières liaisons phosphate aux extrémités 5' et 3' (5'-CCTCTCTCTCTCTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3')</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 amorce directe&nbsp ;</td>Oligo d’ADN <td>Sigma-Aldrich</td><td>en tube ; 0,025 nM, purification par dessalage standard, sec (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3')</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 amorce inverse&nbsp ;</td>Oligo d’ADN <td>Sigma-Aldrich</td><td>en tube ; 0,025 nM, purification par dessalage standard, sec ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3')&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 sgRNA synthétique&nbsp ;</td><td>Synthego&nbsp ;</td><td>ARNsg synthétique, séquence cible : 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'Alimentation</td><td></td></tr> <tr><td>par électrophorèse</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>105ECA-115</td><td></td></tr><tr><td>Pince à filtre</td><td>Millipore</td><td>XX6200006P</td><td></td></tr><tr><td>Eau de poisson (système)</td><td>Générique</td><td>n/a</td><td></td>Système d’électrophorèse</tr><tr><td>sur gel (y compris cadre de coulée, peigne et chambre d’électrophorèse)&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>Boîte</td> lumineuse d’imagerie gel B2<td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Azure Biosystems</td><td>AZI200-01</td><td></td></tr><tr><td>Coloration gel, 10000X&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Bol en verre, 250 mL&nbsp ;</td><td>Générique</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Réservoirs d’isolement, 0,8 L&nbsp ;</td><td>Aquaneering</td><td>ZT080</td><td></td></tr><tr><td>Tube capillaire microcap avec bulbe, 20 & micro ; L&nbsp ;</td><td>Drummond</td><td>1-000-0020/CA</td><td></td></tr><tr><td>Minicentrifugeuse</td><td>Bio-Rad</td><td>12011919EDU</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes, diverses avec embouts appropriés</td><td>Générique&nbsp ;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Micro-ondes&nbsp ;</td><td>Générique&nbsp ;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>Promega</td><td>P119-C</td><td></td></tr><tr><td>Essuie-tout</td><td>Générique</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tubes PCR, 0,2 mL</td><td>Bioexpress</td><td>T-3196-1</td><td></td></tr><tr><td>Cuillère en plastique, avec trous/fentes percés&nbsp ;</td><td>Solution générique</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl, 0,2 M d’ARNse libre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 amorce directe&nbsp ;</td>Oligo d’ADN <td>Sigma-Aldrich</td><td>en tube ; 0,025 nM, purification par dessalage standard, à sec (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3')</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 amorce inverse</td> Oligo d’ADN <td>Sigma-Aldrich</td><td>en tube ; 0,025 nM, purification par dessalage standard, à sec (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3')&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 ARNsg synthétique&nbsp ;</td><td>Synthego&nbsp ;</td><td>ARNsg synthétique, séquence cible : 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'</td><td></td></tr> <tr><td>Enzyme de restriction 10X Tampon</td><td>NEB</td><td>B6003SVIAL</td><td></td></tr><tr><td>solution de NaOH, 50 mM&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>S318 ; Éponge 424330010</td><td></td></tr><tr><td>, coupe de 1 pouce x 1 pouce avec petit divot ovale</td><td>Générique&nbsp ;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymérase master mix, 2X</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>TBE Buffer Concentrate, 10X</td><td>VWR</td><td>E442</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Papier de soie</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Solution de tricaïne-méthanesulfonate (Syncaine, MS-222), 0,016 % dans l’eau de poisson (pH 7,0&plusmn ; 0.2)&nbsp ;</td><td>Syndel</td><td>200-266</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris, 1M (tamponnée avec HCl à pH 8,0)&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr></tbody></table>

dépistage des spermatozoïdes pour l’isolement rapide des modifications de la lignée germinale chez le poisson zèbre

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

L’avènement des technologies de nucléase CRISPR-Cas ciblées a révolutionné la capacité d’effectuer une édition précise du génome dans les systèmes modèles établis et émergents. Les systèmes d’édition du génome CRISPR-Cas utilisent un ARN guide synthétique (sgRNA) pour cibler une endonucléase associée à CRISPR (Cas) sur des loci d’ADN génomique spécifiques, où l’endonucléase Cas génère une cassure double brin. La réparation des cassures double brin par des mécanismes intrinsèques sujets aux erreurs conduit à des insertions et/ou des délétions, perturbant le locus. Alternativement, l’inclusion de donneurs d’ADN double brin ou d’oligonucléotides d’ADN simple brin dans ce processus peut susciter l’inclusion de modifications précises du génome allant des polymorphismes mononucléotidiques aux petites étiquettes immunologiques ou même aux grandes constructions de protéines fluorescentes. Cependant, un goulot d’étranglement majeur dans cette procédure peut être de trouver et d’isoler la modification souhaitée dans la lignée germinale. Ce protocole décrit une méthode robuste pour le dépistage et l’isolement des mutations germinales à des loci spécifiques chez Danio rerio (poisson zèbre); Cependant, ces principes peuvent être adaptables dans n’importe quel modèle où la collecte de sperme in vivo est possible.

Les approches expérimentales décrites dans ce protocole permettent l’identification plus rapide des modifications du génome ou des allèles délétères putatifs en se concentrant sur l’analyse de milliers de génomes dérivés de la collecte de spermatozoïdes masculins injectés F0. La figure 2 montre comment interpréter les résultats obtenus à l’aide de ce protocole.
Pour générer des mutations dans le locus p2ry12, des embryons de poisson-zèbre au stade unicellulaire on...

Les technologies CRISPR-Cas ont révolutionné le domaine de l’édition du génome. Cependant, trouver et isoler la modification souhaitée de la lignée germinale reste un goulot d’étranglement majeur. Par conséquent, ce protocole décrit une méthode robuste pour dépister rapidement les spermatozoïdes de poisson-zèbre injectés par F0 CRISPR pour les modifications de la lignée germinale en utilisant des techniques standard de PCR, de digestion de restriction et d’électrophorèse sur gel.

Dépistage des spermatozoïdes pour l’isolement rapide des modifications de la lignée germinale chez le poisson zèbre

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

Ce protocole décrit une méthode pour dépister rapidement des milliers de génomes à l’aide de spermatozoïdes de poisson zèbre injecté par F0 CRISPR. Cette technique est avantageuse dans son accessibilité. Plutôt que des approches coûteuses et spécialisées basées sur le séquençage, notre méthode utilise des enzymes de restriction PCR et l’électrophorèse sur gel pour dépister les porteurs mâles F0 pour détecter les indels ou les modifications spécifiques du génome.La partie la plus difficile de cette procédure est d’obtenir le sperme rapidement, mais cela devient une bonne technique pour la fécondation in vitro si nous travaillons avec beaucoup de poissons dysmorphes, et c’est donc un moyen facile pour nous de croiser des poissons qui nous causent des problèmes. Commencez par installer des bassins d’élevage pour les poissons de type sauvage et F0 et incuber les réservoirs pendant la nuit. Après avoir anesthésié le poisson mâle le lendemain, utilisez une cuillère à fente pour le transférer sur une pile de serviettes en papier propres.Rouler doucement le poisson pour enlever l’excès d’eau. Enlevez toute eau en la séchant avec un mouchoir en papier plié propre. À l’aide de la cuillère fe

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Génétique

C'est une méthode pour générer des embryons de poisson zèbre gynogénétiques diploïde (embryons dont la seule contribution génétique vient de la mère) en bloquant la seconde division méiotique immédiatement après la fécondation avec la lumière ultraviolette inactivé sperme. EP embryons ne sont pas entièrement homozygotes due à la recombinaison lors de la première division méiotique, cependant elles sont homozygotes à tous les loci qui n'ont pas été séparés de leur centromère par recombinaison.

Faire Zebrafish diploïdes gynogénétiques par Pression Early

PCR combinée à l'analyse de fusion à haute résolution (AGRH) est démontré comme une méthode rapide et efficace de déterminer le génotype du poisson zèbre.

Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

Le poisson-zèbre est un système modèle puissant pour la biologie du développement et la recherche sur les maladies humaines en raison de sa similitude génétique avec les vertébrés supérieurs. Ce protocole décrit une méthodologie permettant de créer des embryons de poisson-zèbre haploïde qui peuvent être utilisés pour des stratégies de dépistage avancé afin d’identifier les mutations récessives dans les gènes essentiels à l’embryogenèse précoce.

Production de haploïdes embryons de poisson zèbre par<em&gt; In Vitro</em&gt; Engrais

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Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

Un protocole modifié pour la manipulation ploïdie utilise un choc thermique pour induire un décrochage d'un cycle cytokinèse dans l'embryon précoce. Ce protocole est mise en évidence chez le poisson zèbre, mais il peut être applicable à d'autres espèces.

Manipulation Ploïdie de Zebrafish Embryons avec Heat Shock Treatment 2

Le but du présent protocole est de modifier la pénétrance de lethal phénotypes mutants squelettiques chez le poisson zèbre par reproduction sélective. Mutants létaux ne peuvent pas être cultivés à l’âge adulte et se sont élevés, donc ce protocole décrit une méthode de suivi et en sélectionnant une pénétrance à travers plusieurs générations de tests de descendance.

Décalage de pénétrance de Mutant squelettique létale Zebrafish Progeny test

Poisson zèbre ont été utilisés comme des organismes modèle génétique fiable dans la recherche biomédicale, en particulier avec l’avènement des techniques de modification génétique. Lorsque les larves phénotypes sont supposés, identification de l’ADN d’extraction et de génotype peut être difficile. Ici, nous décrivons une procédure efficace de génotypage pour les larves de poisson zèbre, par coupure de queue, dès 72 h après la fécondation.

Extraction d’ADN de haut débit et le génotypage des larves de poisson zèbre 3dpf de découpage Fin

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.

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Modifications précises de CRISPR-Cas9 dans les cœurs de poisson zèbre

Ce protocole décrit comment effectuer une édition efficace de la base d’adénine sans limitation PAM pour construire un modèle précis de maladie du poisson zèbre en utilisant zSpRY-ABE8e.

Édition de base efficace sans PAM pour la modélisation des maladies génétiques humaines chez le poisson zèbre avec zSpRY-ABE8e

Ici, nous décrivons un protocole de génération de mutant maternel qui couple une ligne d’entraînement stable zpc :cas9 avec l’administration médiée par Tol2 de cassettes d’expression d’ARNsg.

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