CLHP couplée à une empreinte chimique pour la reconnaissance multi-motifs afin d’identifier l’authenticité de Clematidis armandii caulis

Ce protocole peut fournir une nouvelle stratégie pour identifier efficacement les matériaux authentiques de Clematidis armandii caulis et de ses adultérants. Cette méthode peut être utilisée dans la recherche sur la qualité des matériaux médicinaux et fournit une référence pour l’étude des normes de qualité d’autres matériaux médicinaux chinois. Pour commencer la préparation de l’échantillon, broyer la matière première jusqu’à ce qu’elle atteigne une taille de particules uniforme en les faisant passer à travers un maillage en nylon avec un diamètre intérieur approprié.

Transférer avec précision peser deux grammes de matière première broyée dans une fiole conique de 50 millilitres bouchée avant d’ajouter 50 millilitres de méthanol dans la fiole. Placer le bouchon sur la fiole dans un ultrason chauffé à 600 watts et 40 kilohertz pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, filtrer la solution d’extrait médicinal à travers le papier filtre.

Après filtrage, transférer quatre millilitres de la solution de méthanol contenant les extraits médicinaux dans une fiole jaugée de 10 millilitres. Ensuite, ajoutez-y six millilitres d’eau et mélangez la solution. Laissez la solution reposer pendant 10 minutes.

Pour l’analyse CLHP des échantillons. Commencez par préparer les phases mobiles et définissez le programme de gradient HPLC tel que décrit dans le manuscrit. Filtrer l’échantillon à travers une membrane filtrante microporeuse de 0,45 micron et le soumettre à une analyse CLHP.

Pour chaque échantillon, effectuez une analyse six fois par jour. Pour évaluer la stabilité de la solution échantillon, analysez la même solution d’échantillon conservée à température ambiante pendant 0, 2, 4, 6, 8, 12 et 24 heures après la préparation. Prélever six répétitions du même échantillon et détecter son empreinte digitale en CLHP.

Importez les données pertinentes dans le logiciel nommé Système d’évaluation de la similarité des empreintes chromatographiques de la médecine traditionnelle chinoise ou SESCF TCM version 2012. Importez le temps de rétention et la zone de pic pour les 10 lots d’échantillons authentiques de Chuanmutong ainsi que cinq lots d’adultérants dans SESCF TCM pour analyse. Dans le menu principal, cliquez sur le spectre de référence défini et accédez à la fenêtre des paramètres pour définir l’empreinte chromatographique de référence de l’espèce authentique de Chuanmutong comme référence.

Ensuite, définissez la méthode de génération du spectre de contrôle comme méthode médiane avec une largeur de fenêtre temporelle de 0,5. Ensuite, cliquez sur étalonnage multipoint dans le menu principal, sélectionnez les pics, puis sélectionnez l’option de correspondance des pics comme pics marqués. Enfin, cliquez sur Calculer la similarité pour effectuer une analyse de similarité des échantillons basée sur les empreintes digitales chromatographiques de référence de Chuanmutong.

Pour effectuer une analyse systémique par grappes, ouvrez le logiciel d’analyse statistique pertinent et cliquez sur le fichier pour importer les données de 10 lots d’échantillons authentiques et de cinq lots d’adultérants dans le logiciel. Dans le menu, sous l’onglet Classification, cliquez sur Analyse et clustering de systèmes. Sélectionnez les zones de pic communes de 10 lots d’échantillons authentiques et de cinq lots d’adultérants comme variables.

Définissez le nombre de clusters sur quatre. Ensuite, cliquez sur Méthode pour sélectionner la méthode de clustering comme connexion intergroupe. Choisissez l’intervalle de mesure comme corrélation de Pearson et utilisez l’onglet OK pour dessiner la carte d’analyse de cluster.

Pour l’analyse des composants principaux ou l’ACP, ouvrez le logiciel d’analyse des données. Cliquez sur fichier dans le menu et créez un nouveau projet régulier. Importez la zone des pics de 12 pics communs dans une feuille de calcul Excel ou similaire à partir du système HPLC.

Appuyez sur le bouton Terminer pour terminer l’importation des données. Pour définir le type de modèle avec PCA, cliquez sur Nouveau pour créer un nouveau modèle, puis ajustez les données à l’aide de l’ajustement automatique et ajoutez des onglets. Accédez aux scores pour obtenir la carte des scores PCA.

Pour utiliser l’analyse de discrimination orthogonale partielle des moindres carrés ou OPLSDA. Générez la carte des scores PCA comme illustré précédemment. Définissez le type de modèle avec l’OPLSDA en cliquant sur Nouveau et Nouveau en tant que modèle un Avant de passer à l’échelle en sélectionnant le par pour tous, appuyez ensuite sur AutoFit in scores pour générer la carte de score OPLSDA.

Pour estimer l’importance et la projection de la variable, allez dans le menu du logiciel d’analyse de données et allez dans Analyser, puis définissez le nombre sur 200 sous par mutation. Obtenez les valeurs du carré R et du carré Q du score OPLSDA et cliquez sur VIP et VIP prédictif pour obtenir la carte VIP. Les empreintes digitales HPLC des 10 échantillons authentiques de Chuanmutong ont montré 12 pics communs distincts dont le relativement grand et bien résolu.

Le pic numéro 10 a été utilisé comme pic de référence pour estimer les temps de rétention relatifs des pics de repos. Les échantillons authentiques ont démontré des degrés de similitude très proches de celui impliquant une grande similitude dans une bonne consistance. Cependant, les degrés de similitude entre les cinq lots d’adultérants et le contrôle Chuanmutong étaient assez faibles.

On a observé que les empreintes digitales CLHP des cinq adultérants différaient des échantillons authentiques, principalement dans la région ayant des temps de rétention allant de 28 à 55 minutes. L’ACP a montré une similitude évidente entre les variétés authentiques et leur différence par rapport aux adultérants, à l’exception du CC adultérant.Des résultats similaires ont également été obtenus à partir de l’analyse en grappes lorsque la distance de classification était de 20. La matrice de score générée à partir de l’OPLSDA n’indiquait aucune intersection entre les points d’échantillonnage des échantillons authentiques et les adultérants.

Encore une fois, le CC adultérant ressemblait plus aux variétés authentiques qu’aux autres adultérants. Selon la carte VIP, les pics ayant des valeurs supérieures à un ont été identifiés comme les principaux composants marqueurs causant la différence entre les échantillons authentiques et les adultérants. La teneur en bêta-sitostérol, un composant actif trouvé dans Chuanmutong a été détectée dans les cinq lots d’adultérants, mais la teneur variait considérablement.

Ce protocole établit diverses méthodes d’analyse pour refléter toutes les informations sur les matériaux médicinaux sous plusieurs angles et tout autour de la façon d’estimer l’authenticité des matériaux médicinaux Chuanmutong.