Analyse d’échantillons bruts et traités de Cyperi rhizoma par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem chez des rats atteints de dysménorrhée primaire
December 23rd, 2022
Ici, une analyse comparative d’échantillons bruts et traités de Cyperi rhizoma (CR) est présentée à l’aide de la chromatographie liquide ultra-haute performance-spectrométrie de masse en tandem à haute résolution (UPLC-MS/MS) chez des rats atteints de dysménorrhée primaire. Les changements dans les taux sanguins des métabolites et des constituants de l’échantillon ont été examinés entre des rats traités par RC et des rats traités au vinaigre (CRV).
La métabonomie mesure les réponses métaboliques globales et dynamiques et est cohérente avec la détermination de l’efficacité globale de la médecine traditionnelle chinoise. Les changements dans les composants du médicament dus à la réponse métabolique du corps peuvent être déterminés avec la métabonomique. La portée du criblage des ingrédients actifs de la MTC peut être réduite en utilisant cette technique.
L’unilatéralité peut être évitée en étudiant les constituants individuels. Cette méthode peut être simultanée, déterminer les métabolites endogènes et les constituants exogènes absorbés dans le sang. La métabonomie a été largement utilisée dans des études sur la MTC, la toxicologie des médicaments, la gestion de la santé, le sport, l’alimentation et d’autres domaines.
Pour commencer, déterminez l’extrait requis de Cyperi rhizoma, ou CR, ou Cyperi rhizoma traité avec du vinaigre, ou CRV, pour traiter un groupe de six rats Sprague Dawley pendant trois jours. Calculez le volume de CR ou CRV à appliquer par rat à l’aide de cette équation. Pour traiter le CRV, mélangez soigneusement 100 grammes de CR et 20 grammes de vinaigre, qui contient plus de 5,5 grammes d’acide acétique pour 100 millilitres, et incuber pendant 12 heures.
Après l’incubation, faites sauter le mélange dans une poêle en fer pendant 10 minutes à 110 à 120 degrés Celsius. Ensuite, retirez le mélange et laissez-le refroidir à température ambiante. Pour préparer l’extrait CR, faites tremper le CR pendant deux heures avec de l’eau pure 10 fois la quantité de CR prise, en vous assurant que les matières médicinales sont inférieures au niveau du liquide.
Ensuite, portez le mélange d’eau et de médicament à ébullition à feu vif et maintenez-le bouillir à feu doux pendant 20 minutes. Ensuite, filtrez le contenu à travers une toile filtrante à 100 mailles et collectez le filtrat. Ensuite, concentrez le filtrat recueilli dans un extrait avec un évaporateur rotatif à raison d’un gramme par millilitre.
Pour préparer l’extrait CRV, effectuez les étapes de trempage, d’ébullition et de concentration comme démontré pour l’extraction CR. Pour tester les extraits CR et CRV, pipeter 500 microlitres de l’extrait à 500 microlitres de méthanol dans des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre et vortex pendant 30 secondes pour mélanger. Centrifuger les échantillons pendant 15 minutes à 16 500 g à quatre degrés Celsius.
Ensuite, retirez le surnageant et transférez-le dans le flacon d’échantillon pour le test. Après avoir testé les échantillons, effectuez l’analyse en composantes principales, ou ACP, et la modélisation à l’aide du logiciel d’analyse. Importez les données standardisées des métabolites dans le logiciel, puis utilisez Autofit pour créer le modèle d’analyse.
Enfin, utilisez les scores pour obtenir le nuage de points de l’ACP. Pour effectuer l’analyse discriminante orthogonale partielle du moindre carré, ou OPLS-DA, importez les données normalisées sur les métabolites et les groupes CR et CRV dans le logiciel. Ensuite, importez les données CR et CRV dans leurs groupes respectifs créés.
Ensuite, utilisez Autofit pour générer le modèle d’analyse et utilisez le score pour obtenir le nuage de points de score de l’OPLS-DA. Enfin, utilisez VIP pour obtenir la signification variable dans la projection ou la valeur VIP dans l’OPLS-DA. Pour identifier les métabolites potentiellement différentiels, éliminez les métabolites dont la valeur VIP est supérieure à un.
Ensuite, utilisez le logiciel statistique pour calculer la valeur P des métabolites dépistés par le test T de l’élève. Ensuite, pour identifier les métabolites différentiels, utilisez les métabolites annotés et filtrez les métabolites différentiels à apparier dans la base de données KEGG. Montrer les changements dans les métabolites différentiels dans les groupes CR et CRV en dessinant une carte thermique.
Pour examiner les voies métaboliques potentielles, consultez la base de données MetaboAnalyst. Utilisez l’analyse des voies pour télécharger les différents métabolites afin d’obtenir les voies métaboliques potentielles. Téléchargez les différents métabolites dans la base de données KEGG pour analyser les voies métaboliques potentielles.
L’expérience de modèle de dysménorrhée analysée a montré des différences significatives dans les niveaux de prostaglandines. Les rats des groupes CR et CRV modèles ont présenté des réactions de torsion substantielles après l’injection d’ocytocine. Les résultats de l’analyse de l’ACP ont démontré que les grappes de RC et de CRV par rapport aux groupes modèles étaient significativement séparées dans les modes d’ions positifs et négatifs.
L’OPLS-DA a été utilisé pour dépister les différences métaboliques, et les résultats du nuage de points ont démontré que les groupes RC et CRV étaient séparés. Des analyses statistiques univariées ont été effectuées pour identifier les variations métaboliques. Un tracé de volcan est montré, dans lequel chaque point correspond à un métabolite différent.
Des changements significatifs ont été observés dans 63 métabolites en mode positif et 30 en mode négatif. Les métabolites différentiels ont été déterminés à l’aide des bases de données KEGG et HDMB, et les composés appariés avec précision ont été répertoriés. Les valeurs quantitatives des métabolites différentiels entre les groupes CR et CRV ont été calculées et regroupées.
Les taches de couleur indiquent comment chaque métabolite est exprimé par rapport aux autres. Par rapport au groupe CR, les niveaux de quatre métabolites différentiels dans le groupe CRV ont augmenté tandis que 11 métabolites ont diminué en mode ion positif. Dans le cas du mode ion négatif, quatre métabolites différentiels ont augmenté et sept métabolites ont diminué.
Les résultats de l’analyse de la voie KEGG ont montré que les métabolites différentiels étaient associés à neuf voies dans les modes positif et négatif. Plus il y a de métabolites différentiels, meilleurs sont les résultats, de sorte que suffisamment de voies métaboliques peuvent être liées et que les principales voies métaboliques criblées seront plus précises.
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Aperçu
Cette étude présente une analyse comparative d'échantillons de Cyperi rhizoma (CR) crus et traités en utilisant une chromatographie liquide ultra-haute performance couplée à une spectrométrie de masse en tandem à haute résolution (UPLC-MS/MS) chez des rats atteints de dysménorrhée primaire. Elle examine les changements dans les niveaux sanguins de métabolites et de constituants d'échantillons entre les rats traités avec CR et ceux traités avec CR traité au vinaigre (CRV).
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Métabonomique
- Médecine chinoise traditionnelle
Contexte
- La métabonomique mesure les réponses métaboliques dynamiques.
- Elle aide à déterminer l'efficacité de la médecine chinoise traditionnelle (MTC).
- Les ingrédients actifs de la MTC peuvent être dépistés en utilisant cette technique.
- Elle permet la détermination simultanée des métabolites endogènes et des constituants exogènes.
Objectif de l'étude
- Analyser les réponses métaboliques au CR cru et traité.
- Comparer les effets du CR et du CRV sur les niveaux de métabolites sanguins.
- Améliorer la compréhension de l'efficacité de la MTC grâce au profilage métabolique.
Méthodes utilisées
- Chromatographie liquide ultra-haute performance couplée à une spectrométrie de masse en tandem à haute résolution (UPLC-MS/MS).
- Analyse comparative des niveaux de métabolites dans des modèles de rats.
- Évaluation des échantillons sanguins de rats traités.
- Évaluation des changements dans les constituants des échantillons.
Résultats principaux
- Identification de différences significatives dans les niveaux de métabolites entre les traitements CR et CRV.
- Aperçu des voies métaboliques affectées par CR et CRV.
- Preuves soutenant l'efficacité du CR traité dans la gestion de la dysménorrhée primaire.
- Contribution à la compréhension de la MTC par l'analyse métabolique.
Conclusions
- La métabonomique est un outil précieux pour évaluer la MTC.
- Le CR traité montre des avantages potentiels par rapport au CR cru dans les réponses métaboliques.
- Des études supplémentaires sont nécessaires pour explorer les implications de ces résultats.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Metabonomics-driven profiling of Cyperi rhizoma (CR) and its vinegar-processed form (CRV) in a dysmenorrhea rat model enables precise mapping of metabolic pathway modulation and constituent bioavailability. This approach supports mechanistic de-risking and target validation for botanical therapeutics, informing early discovery and translational research decisions. Quantitative metabolite analysis enhances predictive confidence for portfolio triage and prioritization in natural product drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping metabolic pathway shifts after CR and CRV administration.
- Supports biological de-risking through identification of differential metabolites and pathway associations.
- Provides functional target validation by linking constituent changes to analgesic and anti-inflammatory pathways.
- Facilitates predictive confidence for advancing botanical leads in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Delivers validated quantitative metabolite profiles for downstream screening workflows.
- Standardizes measurement of exogenous and endogenous metabolites for reproducibility.
- Enables robust comparison of raw versus processed botanical extracts in assay development.
- Supports reliable evaluation of compound efficacy and mechanistic impact.
Translational & Preclinical Research
- Aligns metabolic pathway modulation with disease-relevant mechanisms in dysmenorrhea models.
- Provides continuity from discovery-stage metabolic profiling to preclinical biomarker identification.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying pathway-specific effects of botanical processing.
- Enhances predictive de-risking for natural product-based therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This UPLC-MS/MS-based metabonomics workflow integrates from early discovery through preclinical validation, supporting lead identification and mechanistic de-risking for botanical therapeutics.
- Discovery Biology: Quantitative metabolite profiling clarifies pathway engagement and constituent bioavailability.
- Screening: Standardized metabolite measurements enable reproducible comparison of extract efficacy.
- Analytics: Multivariate and univariate statistical outputs (PCA, OPLS-DA, VIP, volcano plots) facilitate condition comparison and differential metabolite identification.
- Translational Research: Pathway analysis links metabolic changes to disease-relevant mechanisms, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable for other botanical extracts and disease models, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in botanical drug discovery.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable metabolite analysis workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management for natural product leads.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of botanical candidates based on quantitative pathway data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in UPLC-MS/MS operation and metabolomics data analysis.
- Demands access to advanced analytical instrumentation and bioinformatics infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and data processing protocols.
- Adaptation across botanical sources and disease models may require pathway-specific validation.
- Interpretation of metabolic pathway data must be grounded in robust statistical analysis and database annotation.
