Name: Dosage vert de malachite pour la découverte d’inhibiteurs de la protéine 90 de choc thermique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Découvrez le dosage vert de malachite pour identifier des inhibiteurs de la protéine Hsp90. Cette méthode colorimétrique simple et économique permet le criblage à haut débit des inhibiteurs d'ATPases pour la recherche contre le cancer.

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Cette étude a été financée par le programme Korea Research Fellowship (KRF), boursier postdoctoral de la National Research Foundation of Korea (NRF), financé par le ministère des Sciences et des TIC (NRF-2019H1D3A1A01102952). Les auteurs remercient la subvention intra-muros du KIST et la subvention numéro 2MRB130 du ministère des Océans et des Pêches pour l’aide financière qu’ils ont apportée à ce projet.

1. Dosage vert de malachite à l’échelle du laboratoire
<ol><li>Préparation du tampon de dosage<ol><li>Préparer le tampon d’essai, conformément à la composition et à la préparation présentées dans le tableau 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation des étalons phosphate<ol><li>Utiliser un phosphate étalon de 1 mM, fourni dans le kit de dosage du phosphate vert malachite (conservé à 4 °C).</li>
		<li>Pipeter 40 μL de phosphate étalon 1 mM dans 960 μL d’eau ultra-pure pour obtenir une solution de phosphate 40 μM (solution de prémélange). Ajouter la solution de prémélange avec de l’eau ultra-pure, selon les instructions du fabricant, pour former une dilution en série du phosphate de 0 à 40 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de la levure Hsp90<ol><li>Utilisez de la levure Hsp90 avec une concentration stockaire de glycérol de 0,66 mg / mL. Décongeler sur la glace juste avant utilisation.</li>
		<li>Utilisez 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) de levure Hsp90 pour une activité ATPase mesurable. Vérifier que la différence de densité optique après l’ajout du réactif vert malachite entre le témoin blanc et le témoin positif est d’au moins 0,5 et inférieure à 1,0. Ici, la différence d’absorbance entre l’essai (sans Hsp90) et le témoin positif (avec Hsp90) s’est avérée être de 0,510.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de l’ATP<ol><li>Transférer 1 mg d’ATP dans un flacon contenant 453,39 μL d’eau ultra-pure pour obtenir 4 mM de solution mère. Effectuer des calculs de poids basés sur l’ATP anhydre (masse moléculaire [m.w.] = 551,14). Préparez de l’ATP frais, car il peut s’hydrolyser spontanément avec le temps.</li>
		<li>Ajouter 4 μL de solution mère d’ATP à chaque puits pour obtenir une concentration finale de 0,2 mM (volume total final du puits d’essai de 80 μL). Ajouter l’ATP comme dernier composant à la réaction, à l’aide d’une pipette multicanal afin que toutes les réactions commencent simultanément.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de la geldanamycine (GA)<ol><li>Préparer un stock de 10 mM d’AG en dissolvant 1 mg dans 178,37 μL de DMSO (m.w. = 560,64). À l’aide de la solution mère, préparer une solution de 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM et 0,00128 mM dans du DMSO par dilution série.</li>
		<li>Ajouter 2 μL de ces solutions mères à chaque puits pour obtenir une concentration finale de 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM et 0,000032 mM, respectivement.</li>
		<li>Préparer les puits comme décrit dans les tableaux 2 et 3, avec les puits contenant le blanc (tampon + eau + DMSO) et le témoin négatif (Hsp90 dans le tampon + eau + DMSO). Les puits contenant GA (Hsp90 en tampon + eau + GA) servent de témoin positif.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation des plaques de puits et ordre d’addition<ol><li>Préparer des plaques à 96 puits selon la disposition présentée au tableau 2. Pour les composés qui présentent une absorbance à 620 nm, préparer un puits séparé pour enregistrer l’absorbance à cette longueur d’onde. Ne pas préparer un puits séparé pour l’AG, car l’AG ne montre pas d’absorbance à 620 nm pour la concentration utilisée dans l’essai.</li>
		<li>Préparer chaque constituant avec le volume total de chaque constituant, tel que présenté dans le tableau 3.</li>
		<li>Installez des puits d’analyse en ajoutant de l’eau ultra-pure à chaque puits. Ensuite, ajoutez la quantité requise de tampon de dosage et une solution composée (par exemple, une solution GA).</li>
		<li>Ensuite, ajoutez Hsp90 aux puits appropriés et agitez les plaques pendant 2 min sur un agitateur à plaques à température ambiante.</li>
		<li>Ajouter 4 μL de solution d’ATP à l’aide d’une pipette multicanal. Envelopper la plaque dans du papier d’aluminium et agiter pendant 2 min sur un agitateur à plaques (200 tr/min) à température ambiante. Incuber la plaque à 37 °C pendant 3 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation et ajout de réactif vert malachite<ol><li>Le réactif vert malachite est constitué des réactifs A (molybdate d’ammonium dans 3M HCl) et B (vert malachite et alcool polyvinylique). Porter le réactif à température ambiante avant utilisation. Mélanger les réactifs A et B dans un rapport de 100:1 (1 000 μL:10 μL). Préparez-le dans les 3 heures avant utilisation, car il est instable et commence à se décomposer après 3 heures.</li>
		<li>Après 3 h de l’étape 1.6.5, arrêter la réaction en ajoutant 20 μL de réactif vert malachite, ajouté dans le même ordre que l’ATP, à l’aide d’une pipette multicanaux.</li>
		<li>Après une incubation de 15 min à température ambiante, mesurer l’absorbance de la plaque à 620 nm dans un lecteur de plaques.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Criblage à haut débit des inhibiteurs de Hsp90 par dosage vert malachite
REMARQUE : Le protocole de criblage à haut débit est similaire à la méthodologie à l’échelle du laboratoire. Le volume final du puits dans chaque cas est de 80 μL. Cependant, il existe une légère différence dans l’ordre d’ajout des réactifs. Dans la méthode à l’échelle du laboratoire, il y a cinq étapes d’addition de solution (34 μL d’eau, 32 μL de tampon, 2 μL de composé dans le DMSO, 8 μL de Hsp90 et enfin 4 μL de solution d’ATP). En revanche, avec HTS, il y a trois étapes d’addition (40 μL de solution tampon contenant de la levure Hsp90, 2 μL de DMSO dans 18 μL d’eau contenant les composés, et enfin 20 μL d’ATP dissous dans l’eau). La quantité minimale de solution pouvant être pipetée avec précision dans la configuration HTS est de 20 μL. Par conséquent, une différence de pipetage entre les échelles de laboratoire et HTS est observée.
<ol><li>Préparation du tampon de dosage (pH 7,4)<ol><li>Utiliser le même tampon dans HTS que pour l’essai vert malachite à l’échelle du laboratoire (tableau 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de la levure Hsp90<ol><li>Utilisez des protéines avec une concentration de stock de glycérol de 0,66 mg / mL. Décongeler sur la glace juste avant utilisation.</li>
		<li>Utilisez 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) de levure Hsp90 dans chaque puits, ce qui fournit une activité ATPase mesurable.</li>
		<li>Diluer la protéine (8 μL) dans un tampon (32 μL) pour chaque puits. Le volume de travail total final pour chaque puits est de 40 μL dans un volume d’essai total de 80 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de 0,8 mM d’ATP<ol><li>Dissoudre 1 mg d’ATP dans 2 267 μL d’eau distillée pour obtenir une solution de 0,8 mM. Le volume de travail total pour chaque puits est de 20 μL dans un volume d’essai total de 80 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de la geldanamycine (GA)/composés d’essai<ol><li>Préparez un stock de 0,8 mM de GA dans DMSO, comme à l’étape 1.5. Diluer 10 μL du stock GA avec 90 μL d’eau pour obtenir une concentration finale de 80 μM.</li>
		<li>Utiliser 20 μL de la solution GA à 80 μM dans des puits d’essai appropriés (volume total final du puits d’essai = 80 μL), ce qui donne une concentration finale de 20 μM dans le puits. Cela sert de contrôle positif.</li>
		<li>Pour les composés d’essai, préparer les solutions dans du DMSO selon leur concentration souhaitée pour l’évaluation.</li>
		<li>Préparer 10 μL de DMSO dans 90 μL d’eau pour l’ajouter aux puits blancs (tampon + eau + DMSO) et aux puits témoins négatifs (Hsp90 dans le tampon + eau + DMSO). Préparer les composés d’essai de la même manière à une concentration finale de 100 μM dans le puits.</li>
	</ol></li>
	<li>Conception des plaques d’essai et ordre d’addition<ol><li>Utiliser quatre plaques principales, une plaque composée et quatre plaques d’addition contenant des stocks de réactifs pour mettre en place le test (Figure 2 et Tableau 4).</li>
		<li>De plus, la plaque A, ajouter 90 μL de tampon d’essai dans chaque puits; en plus de la plaque B, ajouter 90 μL de tampon avec Hsp90 dans chaque puits; en plus des plaques C et D, ajouter 90 μL d’ATP et 90 μL de réactif vert malachite, respectivement, dans chaque puits (tableaux 5 et 6).</li>
		<li>À partir de la plaque d’addition A et de la plaque B, transférer 40 μL de solution de chaque puits à la plaque principale 1 et 2, et aux plaques 3 et 4, respectivement, à l’aide d’un système de distribution multicanal automatisé. Ici, le poste de travail d’automatisation de laboratoire Biomek(R) FXP a été utilisé (Figure 2 et Tableau 6).</li>
		<li>De chaque puits de la plaque composée, transférer 20 μL de la solution aux plaques principales 1, 2, 3 et 4 (figure 2). Secouer les plaques pendant 1 min dans un shaker (200 tr/min).</li>
		<li>De chaque puits de la plaque d’addition C (ATP), transférer 20 μL de solution aux plaques principales 1, 2, 3 et 4 (figure 2). Secouer les plaques pendant 1 min dans un shaker (200 tr/min).</li>
		<li>Incuber les plaques pendant 3 h à 37 °C.</li>
		<li>Préparez le réactif vert malachite conformément à l’étape 1.7. Après 3 h, transférer 20 μL de réactif vert malachite de la plaque d’addition D dans les puits des plaques principales 1, 2, 3 et 4 (figure 2).</li>
		<li>Après une incubation de 15 min à température ambiante, mesurer l’absorbance de la plaque est à 620 nm dans un lecteur de plaques.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Opalińska, M., Jańska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA+proteases%3A+guardians+of+mitochondrial+function+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis.</a> Cells. 7 (10), 163(2018).</li>
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<li>Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+region+in+the+N-terminus+of+Escherichia+coli+Lon+that+affects+ATPase%2C+substrate+translocation+and+proteolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity.</a> Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).</li>
</ol>

Il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.

Hsp90 est une cible importante pour la découverte de nouvelles molécules médicamenteuses anticancéreuses. Depuis que sa pharmacogabilité a été établie en 199410, 18 molécules ont atteint les essais cliniques. À l’heure actuelle, sept molécules sont en phase variable d’essais cliniques, seules ou en combinaison22. Toutes ces petites molécules sont des inhibiteurs de liaison à l’ATP N-terminal. Les autres moyens d’inhibition du chaperon (inhibiteurs C-terminal, inhibiteurs du...

La protéine de choc thermique 90 (Hsp90) est un chaperon moléculaire qui maintient la stabilité des protéines responsables du développement et de la progression du cancer. De plus, les protéines responsables du développement de la résistance aux agents antinéoplasiques sont également clientes de Hsp901. Hsp90 est surexprimé de façon ubiquitaire dans tous les types de cellules cancéreuses (>90% des protéines cellulaires), par rapport aux cellules normales où il peut constituer moins de 2% des protéines totales. De plus, le Hsp90 des cellules cancéreuses réside dans un complexe avec des co-chaperons, alors que dans une cellule normale, il est présent principalement à l’état libreet non complexé 2,3. Au cours des dernières années, il a été démontré que plusieurs inhibiteurs de Hsp90 possèdent des effets sénolytiques dans des études in vitro et in vivo, où ils ont considérablement amélioré la durée de vie des souris 4,5,6. Tous les résultats susmentionnés corroborent le fait que les inhibiteurs de Hsp90 pourraient être efficaces dans plusieurs types de cancer, avec moins d’effets indésirables et moins de risques de développer une résistance. La fonction chaperonnante de Hsp90 est accomplie en liant l’ATP au domaine N-terminal de Hsp90 et en l’hydrolysant en ADP et en phosphate libre7. De petites molécules qui se lient de manière compétitive à la poche de liaison ATP de Hsp90 se sont avérées supprimer avec succès l’effet chaperonnant de la protéine. À ce jour, cela reste la meilleure stratégie pour l’inhibition de Hsp90, ce qui est soutenu par le fait que ces inhibiteurs ont atteint les essais cliniques8. L’un d’eux, Pimitespib, a été approuvé au Japon pour le traitement de la tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) en juin 20229. Il s’agit du premier inhibiteur de Hsp90 approuvé depuis que la pharmacogabilité du chaperon a été établie en 199410.
Le dosage vert malachite est une procédure simple, sensible, rapide et peu coûteuse pour la détection du phosphate inorganique, adaptée à l’automatisation et au criblage à haut débit (HTS) de composés par rapport à sa ciblesouhaitée 11. Le test a été utilisé avec succès pour le criblage des inhibiteurs de Hsp90 dans de petites installations à l’échelle du laboratoire, ainsi que dans un HTS 12,13,14,15,16,17. Le test utilise une méthode colorimétrique qui détermine le phosphate inorganique libre formé en raison de l’activité ATPase de Hsp90. La base de cette quantification est la formation d’un complexe phosphomolybdate entre le phosphate libre et le molybdène, qui réagit ensuite avec le vert malachite pour générer une couleur verte (Figure 1). Cette formation rapide de couleur est mesurée sur un spectrophotomètre, ou sur un lecteur de plaques, entre 600-660 nm18,19.
Dans le présent protocole, la procédure à suivre pour effectuer un dosage au vert de malachite avec la levure Hsp90 et l’identification ultérieure des inhibiteurs contre le chaperon sont décrites. La molécule de produit naturel, la geldanamycine (GA), avec laquelle la pharmacogabilité de Hsp90 a été établie pour la première fois, a été prise comme inhibiteur authentique10. HTS est devenu une partie intégrante du programme actuel de découverte de médicaments, en raison de la disponibilité d’un grand nombre de molécules pour les tests. Cette technique a gagné en importance au cours des 2 dernières années en raison du besoin urgent de réorienter les médicaments pour traiter l’infection Covid-1920,21. Par conséquent, un aperçu détaillé de l’HTS des molécules contre la protéine de levure Hsp90 en adoptant la méthode de dosage vert malachite est présenté.

<table><tbody><tr><td>1M Solution de chlorure de magnésium dans l’eau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069-100ml</td><td></td></tr><tr><td>1M Solution de chlorure de potassium dans l’eau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>SPL Life Sciences</td><td>Sans objet</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5&prime ;-triphosphate sel disodique hydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoire Biomek FX station de travail d’automatisation</td><td>Beckman Coulter</td><td>Sans objet</td><td></td></tr><tr><td>Composés 3-96</td><td>Sans objet</td><td>Sans objet La</td><td>levure Hsp90 marquée Histidine a été obtenue auprès du Dr Chrisostomos Prodromou, de l’École des sciences de la vie, de l’Université du Sussex, au Royaume-Uni, et la protéine a été exprimée dans le KIST Gangneung Institute of Natural Products. Les détails ne peuvent pas être divulgués en raison de problèmes de contrefaçon de brevet.</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycine, 99 % (HPLC), poudre</td><td>AK Scientific, Inc.</td><td>V2064</td><td></td></tr><tr><td>Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Eau distillée</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Dosage du phosphate vert de malachite&nbsp ; Kit de dosage</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK307-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques à détection multiple Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lecteur multiplaques Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>Sans objet</td><td></td></tr> Solution <tr><td>tampon de chlorhydrate de Trizma, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93313-1L</td><td></td></tr><tr><td>Levure Hsp90</td><td>Sans objet</td><td>Sans objet</td><td>École des sciences de la vie, Université du Sussex, Royaume-Uni et la protéine a été exprimée dans le KIST Gangneung Institute of Natural Products. Numéro d’acquisition principal : P02829</td></tr></tbody></table>

dosage vert de malachite pour la découverte d’inhibiteurs de la protéine 90 de choc thermique

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

La protéine de choc thermique 90 (Hsp90) est une cible anticancéreuse prometteuse en raison de son effet chaperonnant sur de multiples protéines oncogènes. L’activité de Hsp90 dépend de sa capacité à hydrolyser l’adénosine triphosphate (ATP) en adénosine diphosphate (ADP) et phosphate libre. L’activité ATPase de Hsp90 est liée à sa fonction chaperonnante ; L’ATP se lie au domaine N-terminal du Hsp90, et la perturbation de sa liaison s’est avérée être la stratégie la plus efficace pour supprimer la fonction Hsp90. L’activité de l’ATPase peut être mesurée par un dosage colorimétrique du vert malachite, qui détermine la quantité de phosphate libre formée par hydrolyse de l’ATP. Ici, une procédure pour déterminer l’activité ATPase de la levure Hsp90 en utilisant le kit de dosage de phosphate vert malachite est décrite. En outre, des instructions détaillées pour la découverte d’inhibiteurs de Hsp90 en prenant de la geldanamycine comme inhibiteur authentique sont fournies. Enfin, l’application de ce protocole de dosage par le criblage à haut débit (HTS) de molécules inhibitrices contre la levure Hsp90 est discutée.

Les résultats de l’essai sont interprétés en termes d’absorbance due à la concentration en ions phosphate libres. L’absorbance par le phosphate libre due à l’hydrolyse de l’ATP par la levure Hsp90 à 620 nm est considérée comme une activité ATPase à 100%, ou un pourcentage zéro d’inhibition protéique. L’inhibition des protéines conduit à l’arrêt de l’hydrolyse de l’ATP (phosphate moins libre). ce qui se traduit par une diminution de l’absorbance à 620 nm.
Résultats de l’essai au vert de...

Le protocole de dosage vert malachite est une méthode simple et rentable pour découvrir les suppresseurs de la protéine de choc thermique 90 (Hsp90), ainsi que d’autres composés inhibiteurs contre les enzymes dépendantes de l’ATP.

Dosage vert de malachite pour la découverte d’inhibiteurs de la protéine 90 de choc thermique

Heat shock protein 90 (Hsp90) is a promising anticancer target because of its chaperoning effect on multiple oncogenic proteins. The activity of Hsp90 is ...

Ce protocole aidera à déterminer l’activité des protéines ATPase en mesurant le phosphate libre résultant de l’hydrolyse de l’ATP par les protéines. Le dosage du vert malachite est une procédure simple, sensible, rapide et peu coûteuse pour la détection du phosphate inorganique. Il convient à l’automatisation et au criblage à haut débit de composés par rapport à sa cible.Cette technique jouera un rôle important dans la découverte rapide d’inhibiteurs contre la protéine Hsp90, qui est une cible anticancéreuse importante. Pour commencer, pipeter 40 microlitres de phosphate étalon d’un millimolaire dans 960 microlitres d’eau ultrapure pour obtenir une solution de phosphate de 40 micromolaires. Ajouter cette solution selon les instructions du fabricant pour former une dilution en série du phosphate de 0 à 40 micromolaires.Ensuite, utilisez huit microlitres de levure Hsp90 pour une activité ATPase mesurable. Ajouter le réactif vert malachite à l’essai blanc et au témoin positif, et vérifier que la différence de densité optique entre l’essai blanc et le témoin positif après l’addition est d’au moins 0,5 et inférieure à 1. Pour préparer l’ATP, transférer un milligramme d’ATP dans un flacon contenant 453,39 microlitres d’eau ultrapure pour obtenir une solution mère de quatre millimolaires.Préparez l’ATP frais, car il peut s’hydrolyser spontanément avec le temps. Ajouter quatre microlitres de solution mère d’ATP à chaque puits pour obtenir une concentration finale de 0,2 millimolaire. Ajouter l’ATP comme dernier composant à la réaction à l’aide d’une pipette multicanal afin que toutes les réactions commencent simultanément.Ensuite, préparez un stock de 10 millimolaires de geldanamycine en dissolvant un milligramme dans 178,37 microlitres de DMSO. À l’aide de la solution mère, préparer une solution de 4 millimolaires, 0,8 millimolaire, 0,16 millimolaire, 0,032 millimolaire, 0,0064 millimolaire et 0,00128 millimolaire dans du DMSO par dilution en série. Ajouter deux microlitres de ces solutions mères à chaque puits pour obtenir une concentration finale de 0,1 millimolaire, 0,02 millimolaire, 0,04 millimolaire, 0,0008 millimolaire, 0,00016 millimolaire et 0,000032 millimolaire.Ensuite, préparez les puits avec les puits contenant le témoin blanc et négatif. Les puits contenant de la geldanamycine servent de témoin positif. Préparez les plaques de 96 puits et préparez un puits séparé pour les composés qui montrent une absorbance à 620 nanomètres pour enregistrer l’absorbance à cette longueur d’onde.Ne pas montrer un puits séparé pour la geldanamycine, car la geldanamycine ne montre pas d’absorbance à 620 nanomètres pour la concentration utilisée dans ce test. Installez des puits d’essai en ajoutant de l’eau ultrapure à chaque puits. Ensuite, ajoutez la quantité requise de tampon de dosage et une solution composée telle que la solution de geldanamycine.Ajouter Hsp90 aux puits appropriés et agiter les plaques pendant deux minutes sur un agitateur à plaques à température ambiante. Ajouter quatre microlitres de solution d’ATP à l’aide d’une pipette multicanal. Envelopper la plaque dans du papier d’aluminium et agiter pendant deux minutes sur un agitateur à plaques à température ambiante à 200 tr/min.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Arrêtez la réaction en ajoutant 20 microlitres de réactif vert malachite dans le même ordre que l’ATP à l’aide d’une pipette multicanal et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Enfin, mesurez l’absorbance de la plaque à 620 nanomètres dans un lecteur de plaques.En plus de la plaque A, ajouter 90 microlitres de tampon de dosage dans chaque puits. En plus de la plaque B, ajouter 90 microlitres de tampon avec Hsp90 dans chaque puits. En plus de la plaque C, ajouter 90 microlitres d’ATP, et en plus de la plaque D ajouter 90 microlitres de réactif vert malachite dans chaque puits.Utiliser un système de distribution multicanal automatisé pour transférer 40 microlitres de solution de chaque puits de la plaque d’addition A aux plaques principales un et deux, et de la plaque B à la plaque principale trois et quatre. Transférer 20 microlitres de la solution de chaque puits de la plaque composée aux plaques principales un, aux plaques principales deux, aux plaques principales trois et aux plaques principales quatre. Secouer les plaques pendant une minute dans un shaker à 200 tr/min.Transférer 20 microlitres de la solution de chaque puits des plaques d’addition C aux plaques principales un, deux, trois et quatre. Secouer les plaques pendant une minute dans un shaker à 200 tr/min. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant trois heures, puis transférer 20 microlitres de réactif vert malachite de la plaque d’addition D aux puits des plaques principales un, deux, trois et quatre.Après une incubation de 15 minutes à température ambiante, mesurez l’absorbance de la plaque à 620 nanomètres dans un lecteur de plaques. La structure du vert de malachite et les réactions du réactif vert de malachite A avec le phosphate libre et la réaction ultérieure avec le réactif B sont montrées ici. Un graphique standard pour la concentration standard de phosphate est représenté dans cette figure.Ici, l’axe des x représente la concentration de phosphate libre ou de pi en micromolaire, et l’absorbance à 620 nanomètres est représentée sur l’axe des y. Les barres d’erreur représentent l’écart entre les deux numéros d’échantillon. Le pourcentage d’activité de l’ATPase est utilisé pour mesurer l’inhibition dose-dépendante de la protéine par la geldanamycine.Il a été observé que la geldanamycine inhibait la protéine de manière dose-dépendante avec une valeur CI50 de 0,85 micromolaire. Ici, chaque point est une moyenne de deux déterminations. Le développement de la couleur dans la plaque principale après l’ajout de l’agent vert malachite est montré dans cette image.La couleur rose dans le puits A11 est due à la couleur composée. De même, le développement des couleurs dans la planche principale deux est montré ici. La couleur rose dans le puits A11 est due à la nature colorée du composé.Le développement de la couleur après l’ajout du réactif vert malachite dans la plaque principale trois et dans la plaque principale quatre est montré ici. L’ajout d’ATP et de réactif vert malachite à intervalle de temps à chaque puits est une chose importante à retenir lors de la tentative de cette procédure.

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JoVE Journal

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Ce protocole introduit une méthodologie de dépistage fluorométrique optimisée pour identifier les inhibiteurs naturels de produits et petites molécules de la synthèse protéique. Sa praticité le rend adapté à la fois à l’enseignement de premier cycle en techniques de découverte de médicaments et à la mise en œuvre dans des campagnes de chimie médicinale.

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Découvrez le dosage vert de malachite pour identifier des inhibiteurs de la protéine Hsp90. Cette méthode colorimétrique simple et économique permet le criblage à haut débit des inhibiteurs d'ATPases pour la recherche contre le cancer.

Dosage vert de malachite pour la découverte d’inhibiteurs de la protéine 90 de choc thermique

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