Analyse et imagerie des ostéocytes

La contrainte de cisaillement de l’écoulement des fluides est supposée être un mécanostimulateur des ostéocytes. Comme la mesure directe n’est pas une option, les modèles d’ostéocytes dérivés d’images confocales sont un outil précieux pour effectuer une analyse numérique de la dynamique des fluides afin d’évaluer les contraintes pures de l’écoulement des fluides sur les membranes dendritiques des ostéocytes. Une partie du travail effectué dans notre laboratoire correspond aux développements récents dans le domaine où la morphologie réelle des lacunes ostéocytaires, y compris la tortuosité et la densité des dendrites, est utilisée avec l’os et le réseau lacunaire-canaliculaire afin de déterminer numériquement la contrainte de cisaillement de l’écoulement du fluide et les emplacements dans la structure dendritique ostéocytaire où le stress est élevé.

Les technologies actuelles comprennent diverses modélisations informatiques, telles que l’analyse des éléments finaux, la dynamique des fluides numérique, l’interaction fluide-structure, la modélisation basée sur l’image, y compris le microscope à rayons X ou confocal pour des modèles 3D précis et par des systèmes d’essais mécaniques pour valider les modèles en mesurant les réponses osseuses telles que les déformations dans des conditions de charge de contrôle. Nos résultats indiquent que la perte de dendrites due au vieillissement ou à une maladie osseuse est un facteur qui rend les os moins réactifs à l’activité physique. Nous avons prédit que les ostéocytes détectent les charges mécaniques à travers les régions de contrainte de cisaillement à fort écoulement de fluide qui sont des dendrites.

Et la contrainte de cisaillement de l’écoulement du fluide est corrélée à la morphologie lacunaire, en particulier à la surface. Avec l’établissement de ce protocole, nous travaillons actuellement sur un projet du NIH pour étudier le stress de cisaillement de l’écoulement des fluides dans les dendrites ostéocytaires d’os de souris de deux âges et sexes différents. Cette étude aidera à déterminer comment le vieillissement et les différences entre les sexes affectent la transduction mécano-osseuse due à la charge.

Pour commencer, fixez le fémur prélevé sur la souris dans du paraformaldéhyde froid à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate pendant 24 heures à quatre degrés Celsius avec un léger balancement. Le lendemain, rincez l’os et la solution saline tamponnée au phosphate et incrustez-la rapidement dans un acrylique à polymérisation rapide. Découpez d’épaisses tranches transversales de 300 micromètres au-dessus du troisième trochanter.

À l’aide de papier de verre, polissez les sections osseuses jusqu’à une épaisseur finale de 90 à 100 micromètres. Rincez ensuite les sections polies à 70 %95 % et 100 % d’éthanol pendant cinq minutes chacune. Colorez les sections à 1 % de C ajusté à 100 % d’éthanol pendant quatre heures dans l’obscurité en secouant modérément.

Ensuite, lavez soigneusement les sections dans de l’éthanol à 100 %. Et faites-les sécher à l’air libre pendant la nuit avant de les placer dans une goutte de support de montage sur une lame de verre. Montez une lamelle de recouvrement sur l’échantillon.

Sur un microscope confocal, réglez un laser de 488 nanomètres pour l’excitation et une fenêtre de collecte d’émission de 496 à 596 nanomètres. Tout d’abord, capturez une image à faible consommation de l’ensemble de la section osseuse à l’aide de l’objectif 5x. Capturez ensuite des images des trois régions d’intérêt à l’aide de l’objectif 20x.

Utilisez un objectif à huile numérique à ouverture 100x 1,44 avec un zoom numérique de 1,7 et une taille de pas de 0,126 micromètre pour collecter des piles Z détaillées de 400 plans Z à une résolution de 1024 par 1024 pixels et une résolution de 0,089 micromètre. Pour la modélisation informatique des ostéocytes de souris, ouvrez le logiciel ImageJ après avoir importé les images de la pile Z collectées du fémur de la souris au format TIFF, ajustez le seuil dans le menu de section pour modifier les limites d’intensité des pixels à inclure dans un masque. À l’aide de l’opération de masque de culture, coupez une lacune avec ses canalicules comme région d’intérêt.

Enfermez le vide dans un cube imaginaire plus grand avec des longueurs de côté de 21, 14 et 19 micromètres. Effectuez une opération de croissance de région pour sélectionner les régions de pixels connectées afin de générer un réseau lacunaire-canaliculaire ou LCN uniforme. Ensuite, à l’aide de l’opération de pièce calculée, convertissez le masque lacunaire-canaliculaire en objet.

Réduire le volume de LCN en utilisant l’opération de lissage pour construire les membranes ostéocytaires et dendritiques. Exportez ensuite les objets. Combinez deux surfaces des membranes dendritiques LCN et ostéocytaires en une seule surface.

Maintenant, utilisez l’opération de remaillage pour créer un modèle volumétrique de l’espace canaliculaire lacunaire. Exportez le modèle sous forme de fichier STL et ajustez l’échelle de l’objet en micromètres. Dans un logiciel de traitement d’images tridimensionnelles, choisissez le modèle volumétrique de l’espace lacunaire-canaliculaire de la souris comme modèle de base pour construire des modèles ostéocytaires distincts.

Sélectionnez un seuil plus bas pour réduire l’intensité lumineuse de l’image et obtenir une lacune avec moins de canalicules. Ensuite, développez des modèles d’ostéocytes avec différentes épaisseurs d’espace lacunaire-canaliculaire ou diamètres canaliculaires dendrites. Construisez des modèles d’ostéocytes plus grands ou plus petits en utilisant respectivement des opérations d’enroulement ou de lissage.

Pour créer un écoulement de fluide dans le logiciel de simulation, importez les géométries confocales développées basées sur l’image dans le logiciel CFX. Réglez les dimensions de l’unité sur le nanomètre. Ensuite, cliquez sur soustraire pour obtenir un seul corps d’espace caniculaire lacunaire.

Faites un clic droit sur la facette générée et convertissez-la de facettes en un domaine solide sans fusionner les faces. Cliquez sur le maillage et sélectionnez des éléments tétraédriques linéaires d’une taille d’élément de 0,06 micromètre. Affinez le maillage à l’aide d’une étude de convergence de maillage.

Maintenant, sélectionnez la surface et choisissez les canalicules sur la face supérieure du cube imaginaire comme entrées de fluide. À l’aide de la boîte, choisissez les canalicules sur les cinq autres faces comme sorties de liquide. Exportez ensuite le maillage.

Après avoir créé un autre flux de fluide, importez le maillage fluide dans la section de configuration de CFX. À l’aide de l’option Insérer une limite, définissez deux conditions limites d’entrées et de sorties pour les faces. Exercez une pression d’entrée de fluide de 300 et zéro pascal sur les entrées et les sorties respectivement.

Traitez les surfaces restantes comme des murs avec un état antidérapant. À partir de la matériauthèque, traiter le liquide laminaire interstitiel comme de l’eau. Réglez les sections de transfert de chaleur, de combustion et de rayonnement thermique sur aucun.

Sélectionnez la turbulence comme caractéristique de fluide dans le LCN. Ensuite, exécutez le logiciel en utilisant la double précision et le démarrage direct comme type de soumission. Insérez un nouveau contour dans la section des résultats du logiciel CFD.

Créez une contrainte de cisaillement d’écoulement de fluide ou un contour FFSS en choisissant le cisaillement de la paroi sur les membranes dendritiques ostéocytaires comme variable au niveau du domaine. Ensuite, insérez un contour de lignes de vitesse à l’intérieur du domaine lacunaire-canaliculaire à partir des entrées. La FFSS moyenne sur les membranes ostéocytaires et dendritiques dans le modèle d’ostéocytes jeunes était de 0,42 Pascal, ce qui était significativement plus élevé que 0,13 Pascal dans le modèle d’ostéocytes âgés.

Les FFSS ont augmenté dans les ostéocytes avec un espace canaliculaire lacunaire plus grand, comme on le voit dans les modèles sept et huit où le modèle huit a montré les FFSS les plus élevés. Les valeurs FFSS les plus basses de 0,19 Pascal et 0,13 Pascal ont été observées dans le modèle deux et le modèle quatre, respectivement, avec la densité canaliculaire la plus faible. Aucun changement significatif de la FFSS n’a été observé avec l’augmentation du diamètre des dendrites, comme on l’a vu dans les modèles cinq et six.