Traitement des cellules souches mésenchymateuses humaines pour des applications cliniques à l’aide d’un flux de travail semi-automatisé fermé

La centrifugation de paillasse est un processus ouvert et manuel difficile à mettre à l’échelle. Notre protocole montre comment fermer et automatiser la dissociation, le lavage et la récolte de cellules souches mésenchymateuses, ou CSM, en une seule fois. La configuration est simple.

L’ensemble du processus peut être effectué à l’extérieur de l’enceinte de biosécurité dans une installation de classe cGMP. Le traitement automatisé des cellules fermées réduit les étapes de manipulation manuelle qui pourraient être sujettes à des risques et permet la conformité aux BPF. Cette méthode peut être appliquée à d’autres types de cellules développées dans des systèmes de culture multicouches.

Le système de centrifugation à contre-courant permet de modifier toutes les étapes du protocole pour différentes applications. Le Dr Alan Lam, scientifique du groupe de biotraitement des cellules souches du Bioprocessing Technology, une star à Singapour, fera la démonstration de cette procédure. Pour commencer l’assemblage du kit de centrifugation à contre-courant à usage unique, connectez le kit à usage unique aux sacs de transfert en PVC à usage unique par soudage de tube, comme indiqué dans l’image.

Ensuite, à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité, fixer une fiole multicouche à 10 couches contenant des cellules souches mésenchymateuses humaines dérivées de la gelée de Wharton ou des HMSC de gelée de Wharton à l’ensemble de tubes personnalisés. Transférer le récipient de culture à 10 couches attaché avec l’ensemble de tubes personnalisés sur un banc et le souder à la ligne E du kit à usage unique. Aussi. souder un orifice d’échantillonnage stérile à la ligne G du kit à usage unique à haut débit.

Ensuite, connectez la ligne de récolte H à un leurre stérile, équipé d’une seringue de 50 millilitres. Pour configurer le fonctionnement de l’instrument, allumez l’instrument à l’aide de l’interrupteur à bascule situé à l’arrière de l’instrument et connectez l’ordinateur portable au port USBC de l’instrument à l’aide du câble USBC fourni. Exécutez l’interface utilisateur graphique de la centrifugeuse à contre-courant ou le logiciel GUI à partir du bureau ou du menu Démarrer et connectez-vous.

Ensuite, chargez le protocole en cliquant sur le bouton Sélectionner un protocole sur la page d’accueil principale. Ensuite, appuyez sur le bouton de déverrouillage bleu de l’instrument et ouvrez la porte vitrée pour charger le kit à usage unique assemblé sur le système de centrifugation à contre-courant. Commencez par suspendre les sacs sur les crochets du cintre dans un ordre qui les aligne le mieux avec les orifices de tube sur les bandes de capteurs à bulles avec le flacon multicouche à 10 couches placé à un angle.

Alignez le kit avec les deux boutons d’emplacement du kit. Étirez le tube de pompe autour de la pompe péristaltique et appuyez sur le connecteur blanc en forme de bulbe en place. Fixez la chambre de centrifugation en soulevant le levier argenté du support de la chambre de centrifugeuse à contre-courant et en le fixant en remettant le levier en position verticale.

Appuyez sur le tube de chaque port du kit dans les rails le long des bandes de capteur à bulles. Fermez la porte en appuyant sur le loquet de la porte. Appuyez sur le bouton Initier de l’interface graphique.

Une liste de contrôle apparaîtra. Les quatre premiers éléments sont des vérifications d’instruments, tandis que les deux dernières sont des vérifications d’utilisateurs. À ce stade, assurez-vous que les sacs et les connexions correspondent à l’image du kit et que les pinces manuelles sont ouvertes.

Appuyez sur Confirmer pour afficher l’écran des entrées de protocole. Définissez la valeur de la boîte de dialogue de saisie de données ou de volume de récolte sur 45 millilitres et appuyez sur Confirmer. Appuyez sur le bouton de démarrage vert de l’instrument pour démarrer l’exécution du protocole.

Une fois l’amorçage initial terminé, assurez-vous que le fluide usé est complètement pompé dans le sac à déchets. Lors des étapes de pause indiquées dans le tableau de workflow, soulevez le flacon multicouche et secouez-le pour répartir le tampon de manière égale sur tous les plateaux. Une fois terminé, remettre le ballon multicouche à 10 couches dans sa position de tirage initiale pour les étapes suivantes.

Aux étapes 20 et 23, s’assurer que les cellules trypsinisées sont complètement transférées dans le sac intermédiaire. Bien mélanger le sac intermédiaire, manuellement, à l’étape 25. À l’étape 26, utilisez une seringue à leurre de deux millilitres pour prélever des échantillons à travers le port d’échantillonnage.

Aux étapes 29 et 30, vérifiez la formation stable du lit cellulaire fluidisé. Cela devrait être comme le lit cellulaire fluidisé montré ici. La course est terminée à l’étape de la rampe à l’arrêt, et toutes les valeurs de pincement sur le système de centrifugation à contre-courant se fermeront automatiquement.

Une fois l’exécution du protocole terminée, appuyez sur le bouton de déverrouillage bleu de l’instrument et ouvrez la porte vitrée. Sceller de manière aseptique la chaîne de récolte à l’aide d’un scellant à tube à main et transférer soigneusement la seringue scellée remplie de la récolte de cellules concentrées dans l’enceinte de sécurité biologique pour le comptage et la cryoconservation des cellules. Détachez à nouveau la chambre à l’aide du levier.

Retirez le connecteur de l’ampoule de son raccord et soulevez délicatement le kit et jetez-le dans un sac pour risque biologique. Nettoyez l’instrument à l’aide de lingettes à l’éthanol et fermez la porte. Enfin, fermez d’abord l’application GUI avant d’éteindre l’interrupteur à l’arrière de l’instrument.

Les MSC Wharton’s Jelly ont bien proliféré lorsqu’ils ont été étendus à la fois dans des milieux contenant du sérum et sans sérum et sans xéno. Cependant, ceux en milieu sans sérum et sans xéno présentaient une morphologie fusiforme légèrement plus longue en forme de fibroblaste, avec une taille cellulaire moyenne plus grande de 17 microns, contre 15 microns dans le milieu sérique. Dans les deux milieux au cours des trois passages, les HMSC de Wharton’s Jelly ont constamment atteint une densité cellulaire maximale d’environ 23 000 cellules par centimètre carré et un temps de doublement de la population de 34 heures.

Lorsque les HMSC Wharton’s Jelly ont été dilatés dans des récipients de culture à 10 couches à l’aide de la centrifugation à contre-courant démontrée, une réduction de volume de dix fois a été obtenue, générant des concentrations cellulaires pouvant atteindre 5,3 millions de cellules par millilitre. Le protocole a systématiquement atteint une récupération cellulaire élevée d’environ 98% et une viabilité cellulaire élevée d’environ 99% pour trois exécutions indépendantes. Les HMSC Wharton’s Jelly récoltés à l’aide des deux méthodes présentaient des profils de marqueurs de surface caractéristiques qui sont CD73, CD90 et CD105 positifs, ainsi que CD34 et CD45 négatifs.

Les cellules récoltées par centrifugation à contre-flux présentaient un dosage de fibroblastes unitaires formant des colonies ou un potentiel UFC similaire, par rapport à celles récoltées par centrifugation manuelle. Dans les deux méthodes, les cellules ont conservé la capacité de se différencier en adipocytes, ostéoblastes et chondrocytes. Les profils de sécrétion de cytokines des cellules après la centrifugation à contre-courant étaient comparables à ceux de la centrifugation pré-contre-flux.

Assurez-vous d’assembler le kit à usage unique en référence à la configuration du lit, déplacez-le dans ce générateur de protocole de système de centrifusion à contre-courant. Le protocole de lavage des impuretés résiduelles du produit final peut être utilisé dans des applications cliniques pour aider les utilisateurs à respecter leurs critères de libération du lot. Pour accélérer le processus de transfert de fluide pour un traitement à grande échelle, des pompes externes peuvent être utilisées pour transférer d’abord le contenu trypsinisé dans un sac de transfert, au lieu de récolter directement dans le ballon multicouche.