Name: Application d’AlDeSense pour stratifier les cellules cancéreuses de l’ovaire en fonction de l’activité de l’aldéhyde déshydrogénase 1A1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Découvrez une méthode de cytométrie en flux et d'imagerie moléculaire en cellules vivantes pour mesurer l'activité ALDH1A1, biomarqueur de stemness, dans les lignées cellulaires de cancer de l'ovaire. Cette approche utilise une sonde fluorogénique isoforme-sélective offrant une haute spécificité et un excellent rapport signal/bruit pour identifier les cellules souches cancéreuses.

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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R35GM133581 à JC) et le Cancer Center at Illinois Graduate Scholarship (décerné à SG). JC remercie la Fondation Camille et Henry Dreyfus pour son soutien. Les auteurs remercient le Dr Thomas E. Bearrood pour sa contribution initiale à la préparation des stocks d’AlDeSense et d’AlDeSense AM. Nous remercions M. Oliver D. Pichardo Peguero et M. Joseph A. Forzano de leur aide dans la préparation de divers précurseurs synthétiques. Nous remercions le professeur Erik Nelson (Département de physiologie moléculaire et intégrative, UIUC) pour les cellules Caov-3, IGROV-1 et PEO4. Nous remercions le professeur Paul Hergenrother (Département de chimie, UIUC) pour les cellules BG-1. Nous remercions les installations principales de l’Institut Carl R. Woese de biologie génomique pour leur accès au microscope confocal Zeiss LSM 700 et au logiciel correspondant. Nous remercions l’installation de cytométrie en flux pour l’accès à l’analyseur BD LSR II CMtO. Nous remercions la Dre Sandra McMasters et l’installation des milieux cellulaires pour leur aide dans la préparation des milieux de culture cellulaire.

1. Mesurer l’activité totale de l’ALDH1A1 dans les homogénats de cellules cancéreuses de l’ovaire par fluorimétrie
<ol><li>Décongeler 1 × 106 cellules dans une fiole de culture cellulaire T25 dans 5 mL des milieux de culture cellulaire suivants :<ol><li>IGROV-1 et PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S).</li>
		<li>BG-1 et Caov-3 : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) avec 10% FBS et 1% P/S.</li>
		<li>OVCAR-3 : RPMI 1640 avec 20 % de FBS, 1 % P/S et 0,01 mg/mL d’insuline.</li>
	</ol></li>
	<li>Maintenir les cellules dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2 pendant deux à trois passages. Assurez-vous que les cellules ne dépassent pas 80% à 90% de confluence avant de passer.</li>
	<li>Trypsiniser les cellules dans 0,25% de trypsine pendant 10 min, les compter à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et granuler 1 × 107 cellules par centrifugation (180 × g) à 25 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le surnageant avec précaution par aspiration, laver la pastille en remettant les cellules en suspension dans 1 mL de 1x PBS et regranuler les cellules par centrifugation dans les mêmes conditions que celles décrites à l’étape 4.</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans une solution de 1x inhibiteur de protéase dans 1x PBS. Utilisez 1 mL de cette solution par 2,5 × 106 cellules.</li>
	<li>Soniquez la suspension cellulaire sur glace pendant 2 min (impulsion de 1 s, amplitude de 40 %) avec une sonde homogénéisante de cellules.</li>
	<li>Fractions insolubles/membranaires des pastilles par centrifugation (3 200 × g) à 25 °C pendant 15 min. Retirez et conservez le surnageant, car c’est l’homogénat qui sera utilisé dans les étapes suivantes. Séparer les homogénats en trois cuvettes pour réaliser l’expérience en trois exemplaires.</li>
	<li>Ajouter la sonde à l’homogénat pour obtenir une concentration finale de sonde de 4 μM. Pipeter trois fois de haut en bas pour bien mélanger la solution.</li>
	<li>Mesurer le signal fluorescent immédiatement après l’ajout et après les temps d’incubation souhaités sur un fluorimètre. Le temps d’incubation peut être optimisé pour voir l’activation maximale du pli (1 h dans cette expérience). Le temps d’incubation doit être constant sur toutes les lignées cellulaires comparées.<ol><li>Réglez la longueur d’onde d’excitation sur 496 nm.</li>
		<li>Réglez l’émission sur 510-600 nm.</li>
		<li>Réglez la largeur de la fente sur 0,5 mm.</li>
		<li>Pipeter la solution dans une cuvette de quartz de 1 mL, placer dans le fluorimètre et frapper le balayage.</li>
	</ol></li>
	<li>Diviser l’intensité finale de fluorescence à 516 nm (longueur d’onde fluorescente maximale) par l’intensité à la même longueur d’onde à partir de la lecture initiale pour déterminer l’activation du pli du colorant isoforme-sélectif.</li>
</ol>2. Utilisation de la microscopie à fluorescence pour imager des cellules à forte activité ALDH1A1
<ol><li>Décongeler 1 × 106 cellules dans un ballon de culture cellulaire T25 dans 5 mL du milieu de culture cellulaire approprié.</li>
	<li>Maintenir les cellules dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2 pendant deux à trois passages. Assurez-vous que les cellules ne dépassent pas 80% à 90% de confluence avant de passer.</li>
	<li>La veille de l’imagerie confocale, plaquez 4 × 105 cellules dans une lame de chambre à 8 puits.<ol><li>Enduire le fond de chaque puits de poly-L-lysine (0,1 mg/mL, 100 μL par puits) pendant 10 minutes, puis en aspirant.</li>
		<li>Lavez chaque puits 3x en ajoutant de l’eau de culture cellulaire (100 μL par puits) et en aspirant.</li>
		<li>Trypsiniser les cellules dans 0,25% de trypsine pendant 10 min, les compter à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et plaquer les cellules à 4 × 105 cellules par puits.</li>
		<li>Laissez les cellules se déposer et se fixer pendant la nuit (12-16 h).</li>
	</ol></li>
	<li>Aspirer le milieu de croissance et ajouter un milieu sans sérum (500 μL par puits), complété par 2 μM de la sonde ou de la sonde témoin.</li>
	<li>Incuber avec la sonde à température ambiante pendant 30 min et imager les cellules immédiatement.</li>
	<li>Allumez le microscope confocal et ajustez-le pour l’échantillon.<ol><li>Charger soigneusement l’échantillon au grossissement le plus bas; Trouvez les cellules pour assurer un bon positionnement.</li>
		<li>Assurez-vous que la lentille de l’objectif est à un grossissement de 10x et localisez les cellules.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour cette expérience, le canal FITC (excitation: laser 488 nm; émission: 516-521 nm) et le canal T-PMT (lumière transmise) sont nécessaires. Localisez et concentrez-vous sur les cellules en utilisant T-PMT pour se concentrer sur le même plan z pendant toute l’expérience afin d’éliminer les biais.</li>
	<li>Ajustez la puissance laser et le gain FITC au réglage approprié, où le signal des échantillons Ctrl-AlDeSense AM est détectable au minimum, tout en voyant le signal dans les échantillons AlDeSense AM. Chaque paramètre peut être ajusté en faisant glisser la barre correspondante. Les paramètres devront peut-être être ajustés plusieurs fois pour identifier les paramètres corrects. Une fois optimisé, complétez le reste de l’expérience au sein de cette lignée cellulaire en utilisant des paramètres identiques.</li>
	<li>Prenez trois images par puits pour un total de trois puits par condition de traitement (neuf images au total). Concentrez-vous sur le plan approprié en utilisant T-PMT pour éviter les biais plutôt que d’utiliser le canal de fluorescence ou l’image fusionnée.</li>
	<li>Traitez les images pour déterminer le pourcentage de cellules ALDH1A1+.<ol><li>À l’aide d’un logiciel de traitement d’image, divisez le fichier czi en différents canaux.</li>
		<li>Comptez le nombre total de cellules et le nombre total de cellules fluorescentes.</li>
		<li>Pour déterminer le pourcentage de cellules ALDH1A1+, divisez le nombre de cellules fluorescentes par le nombre total de cellules dans chaque image. Il est impératif de compter de la même manière pour chaque image sans manipuler les images, car, par exemple, le réglage de la luminosité peut ajouter une variable confondante.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Application de la cytométrie de flux pour identifier les cellules ayant une activité ALDH1A1 élevée
<ol><li>Décongeler 1 × 106 cellules dans un ballon de culture cellulaire T25 dans 5 mL du milieu de culture cellulaire approprié.</li>
	<li>Maintenir les cellules dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2 pendant deux à trois passages. Assurez-vous que les cellules ne dépassent pas 80% à 90% de confluence avant de passer.</li>
	<li>Trypsiniser, compter et granuler les cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL par centrifugation (180 × g) à 25 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans 1 mL de solution de sonde/sonde témoin 2 μM dans du PBS. Balancez les cellules à température ambiante pendant 60 minutes pour vous assurer que l’exposition au colorant est uniforme.</li>
	<li>Après la période d’incubation, pelleter les cellules par centrifugation (180 × g) à 25 °C pendant 5 min. Remettez les cellules en suspension dans 0,5 mL de PBS. Faites passer les cellules à travers une passoire cellulaire (maille de nylon de 35 μm) pour éliminer les amas cellulaires qui peuvent obstruer le cytomètre en flux. Placez immédiatement les cellules sur de la glace.</li>
	<li>Allumez l’instrument et exécutez le protocole de démarrage.</li>
	<li>Vérifiez s’il y a du liquide de gaine et des déchets vides.</li>
	<li>Faites fonctionner les lignes avec 10% d’eau de Javel et d’eau pendant 5 minutes chacune.</li>
	<li>Exécutez des perles de contrôle de la qualité pour assurer le bon fonctionnement.</li>
	<li>Dans l’onglet Paramètres, sélectionnez FSC (diffusion directe), SSC (diffusion latérale) et FITC (isothiocyanate de fluorescéine) pour le filtre à fluorescence.</li>
	<li>Dessinez les graphiques suivants pour la viabilité, les singulettes et la fluorescence. Optimiser la puissance laser (spécifique à l’instrument de l’utilisateur) afin que les populations cellulaires soient dans les paramètres donnés pour une analyse plus approfondie.<ol><li>Nuage de points FSC-A versus SSC-A : la population cellulaire principale est proche du centre du graphique.</li>
		<li>Nuage de points FSC-A versus FSC-W : bande horizontale étroite indiquant des singulets (plutôt que des amas de cellules).</li>
		<li>Diagramme de dispersion FITC-A versus FSC-A : observez la distribution des cellules triées par la sonde d’activation fluorogénique sélective isoforme.</li>
		<li>Histogramme FITC-A : observez le déplacement de la population en fonction de la FITC pour déterminer le pourcentage de cellules ALDH1A1+.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour optimiser la puissance laser FITC, exécutez un échantillon avec la sonde de sorte que la queue droite de la courbe de l’histogramme soit proche du signal FITC-A maximal. Ensuite, exécutez un échantillon avec la sonde de contrôle. Un déplacement de population doit être observable pour révéler la plage dynamique maximale. L’étape d’optimisation de la puissance laser peut devoir être répétée plusieurs fois, mais la puissance laser ne doit pas être modifiée entre les échantillons une fois qu’un réglage a été désigné pour une expérience.</li>
	<li>Exécutez chaque échantillon pour 10 000 comptages (en trois exemplaires).</li>
	<li>Répétez l’étape 3.12 pour chaque lignée cellulaire, car il y aura une variabilité dans l’absorption et l’activité ALDH1A1.</li>
	<li>Une fois le prélèvement de l’échantillon terminé, faites fonctionner les conduites avec 10 % d’eau de Javel et d’eau pendant 5 minutes chacune, puis lancez l’arrêt de l’instrument.</li>
	<li>Traitez les données à l’aide du logiciel de cytométrie en flux et portez la population cellulaire souhaitée. Réglez les portes de sorte que tous les événements tombent dans la porte ALDH1A1 ou ALDH1A1+. À l’aide de la sélection de porte rectangulaire, réglez la porte ALDH1A1- de sorte que >99,5 % des événements dans les échantillons de sonde de contrôle se produisent à l’intérieur de cette porte. Les cellules restantes seront considérées comme ALDH1A1+. Ces mêmes portes peuvent ensuite être appliquées à l’échantillon de sonde pour quantifier le nombre d’événements considérés ALDH1A1- et ALDH1A1+.</li>
</ol>

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<li>Yagishita, A., Ueno, T., Tsuchihara, K., Urano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+BODIPY-based+blue+fluorescent+probes+for+aldehyde+dehydrogenase+1-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amino BODIPY-based blue fluorescent probes for aldehyde dehydrogenase 1-expressing cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (2), 234-238 (2021).</li>
<li>Okamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+breast+cancer+stem+cells+using+a+newly+developed+long-acting+fluorescence+probe%2C+C5S-A%2C+targeting+ALDH1A1%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of breast cancer stem cells using a newly developed long-acting fluorescence probe, C5S-A, targeting ALDH1A1.</a> Anticancer Research. 42 (3), 1199-1205 (2022).</li>
</ol>

Nous divulguons un brevet en instance (US20200199092A1) pour la technologie AlDeSense.

La pansélectivité est une limitation majeure de nombreuses sondes ALDH ; Cependant, plusieurs exemples sélectifs d’isoformes ont récemment été rapportés 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. La ...

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont une sous-population de cellules tumorales qui présentent des propriétés semblables à celles des cellules souches1. À l’instar de leurs homologues non cancéreux, les CSC possèdent une capacité extraordinaire de se renouveler et de proliférer. Avec d’autres mécanismes intégrés, tels que la régulation positive des transporteurs de cassettes liant l’ATP, les CSC sont souvent épargnés par les efforts initiaux de réduction tumorale chirurgicale, ainsi que par le traitement adjuvant ultérieur2. En raison de leur rôle essentiel dans la résistance au traitement3, la rechute4 et les métastases5, les CSC sont devenus une priorité dans la recherche sur le cancer. Bien qu’il existe une variété d’antigènes de surface cellulaire (p. ex. CD133) qui peuvent être utilisés pour identifier les CSC6, tirer parti de l’activité enzymatique des aldéhydes déshydrogénases (ALDH) trouvées dans le cytoplasme est apparu comme une alternative intéressante7. Les ALDH sont une superfamille de 19 enzymes responsables de catalyser l’oxydation des aldéhydes endogènes et xénobiotiques réactifs en produits d’acide carboxyliquecorrespondants 8.
En général, la détoxification des aldéhydes est cruciale pour protéger les cellules contre les événements de réticulation indésirables et le stress oxydatif qui peuvent endommager l’intégrité des cellules souches9. De plus, l’isoforme 1A1 contrôle le métabolisme de l’acide rétinoïque, qui à son tour influence la souche via la signalisation du rétinaldéhyde10. AlDeSense 11,12, une sonde de détection basée sur l’activité (ABS) à petites molécules pour détecter sélectivement l’activité ALDH1A1, a récemment été développée. Les conceptions ABS permettent la détection de l’analyte par un changement chimique plutôt que par un événement de liaison, ce qui permet une sélectivité élevée et une diminution des réponses hors cible13,14,15,16. Le principe de conception de la sonde fluorogénique isoforme-sélective repose sur un mécanisme de trempe par transfert d’électrons photoinduit par donneur (d-PeT)17, issu du groupe fonctionnel aldéhyde, qui sert à supprimer la signature fluorescente de la sonde18. Lors de la conversion médiée par ALDH1A1 en acide carboxylique, la relaxation radiative est débloquée pour produire un produit hautement fluorescent. Étant donné que la trempe d-PeT n’est jamais efficace à 100 %, la fluorescence résiduelle pouvant conduire à d’éventuels résultats faussement positifs a été prise en compte lors de l’établissement de ce test grâce au développement de Ctrl-AlDeSense, un réactif non réactif présentant des caractéristiques photophysiques correspondantes (p. ex., rendement quantique) et un schéma de coloration cytoplasmique identique dans les cellules. Lorsqu’il est utilisé en tandem, cet appariement unique peut distinguer de manière fiable les cellules à forte activité ALDH1A1 de celles qui présentent de faibles niveaux via la fluorimétrie, l’imagerie moléculaire et la cytométrie en flux. Plusieurs avantages clés sont associés à l’utilisation de colorants activables isoformels par rapport aux méthodes immunohistochimiques traditionnelles. Par exemple, on suppose que les CSC sont enfouis profondément dans une tumeur et sont donc plus accessibles à une petite molécule que les gros anticorps19. De plus, le produit fluorescent retourné ne modifie pas de manière covalente un composant cellulaire, ce qui signifie qu’il peut être facilement éliminé par des cycles de lavage pour laisser un CSC dans un état non modifié. Enfin, la réponse d’activation n’identifie que les cellules et les fonctions viables, tout comme le test MTT, en raison de sa dépendance au cofacteur NAD +.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64713/64713fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma montrant l’activation fluorescente d’AlDeSense. Le colorant isoforme-sélectif est activé par ALDH1A1 et peut être utilisé pour identifier une activité élevée d’ALDH1A1 dans les cellules cancéreuses de l’ovaire par fluorimétrie, imagerie moléculaire et cytométrie en flux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64713/64713fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Dans des travaux antérieurs, le test de sonde fluorogénique sélective isoforme a réussi à stratifier les cellules ALDH élevées (ALDH+) des cellules ALDH faibles (ALDH-) dans les cellules leucémiques chroniques humaines K562, les cellules cancéreuses du sein humain MDA-MB-231 et les cellules de mélanome murin B16F0. Ceci est important car, pour de nombreux types de cancer, une expression élevée de la protéine ALDH1A1 signifie un pronostic clinique moins sombre20. Cela suppose que des niveaux élevés d’ALDH1A1 sont indicatifs de CSC qui peuvent échapper au traitement, développer une résistance et se propager dans tout le corps. Cependant, dans le cas du cancer de l’ovaire, certaines études rapportent le résultat inverse (une expression élevée d’ALDH1A1 est liée à une amélioration de la survie des patientes)21,22,23,24. Bien que cela puisse sembler contradictoire à première vue, l’expression n’est pas nécessairement corrélée à l’activité enzymatique, qui peut être influencée par des changements dans le microenvironnement tumoral (par exemple, flux de pH, gradients d’oxygène), la disponibilité du cofacteur NAD+ ou des substrats d’aldéhyde, les niveaux d’acides carboxyliques (inhibition du produit) et les modifications post-traductionnelles qui peuvent modifier l’activité enzymatique25 . De plus, le cancer de l’ovaire est divisé en cinq types histologiques principaux (séreuse de haut grade, séreuse de bas grade, endométrioïde, à cellules claires et mucineuse), dont nous supposons qu’elles présenteront des niveaux variables d’activité ALDH1A126. Dans le but d’étudier l’activité de l’ALDH1A1 dans les tumeurs ovariennes, un test de sonde fluorogénique sélective isoforme a été utilisé pour identifier les populations ALDH1A1+ dans un panel de cinq lignées cellulaires de cancer de l’ovaire appartenant aux différents types histologiques mentionnés ci-dessus. Les lignées cellulaires testées dans cette étude comprennent des cellules BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 et PEO4, couvrant les histotypes à cellules claires et séreuses. Ici, la polyvalence et la généralisabilité de la sonde ont été soulignées pour identifier les CSC pour les chercheurs qui cherchent à effectuer des études similaires sur d’autres lignées cellulaires cancéreuses immortalisées ainsi que sur des échantillons de patients. L’utilisation d’AlDeSense permettra de faire la lumière sur les voies biochimiques impliquées dans le maintien du SCC dans des microenvironnements tissulaires complexes et pourrait servir d’outil clinique pour déterminer le pronostic et mesurer l’agressivité du cancer.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ; 0,25 % de trypsine, 0,1 % d’EDTA dans le HBSS sans calcium, magnésium et bicarbonate de sodium</td><td>Corning</td><td>. &nbsp ; 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x Tampon phosphate salin</td><td>Corning</td><td>21-040-CMX12</td><td></td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17R</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>AlDeSense</td><td></td><td></td><td>synthétisé en interne</td></tr><tr><td>BG-1</td><td></td><td></td><td>Un cadeau offert par le Prof. Paul Hergenrother Lab, Université de l’Illinois Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>BioLite 25cm2 Gourde</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>130189</tr><tr><td>Enceinte de biosécurité 1300 série A2</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caov-3</td><td></td><td></td><td>Un don offert par le Prof. Erik Nelson Lab, Université de l’Illinois Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>Homogénéisateur de cellules</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scientific Centrifuge 5180R</td><td>Eppendorf</td><td>22627040</td><td></td></tr><tr><td>Contrl-AlDeSense</td><td></td><td></td> DMEM <td>synthétisé en interne</td></tr><tr><td>, 10 % FBS, 1 % P/S</td><td></td><td></td><td>Préparé par la cellule UIUC </td></tr><tr><td>Falcon Tubes à essai en polystyrène à fond rond avec filtre à cellules, 5 ml</td><td>Corning</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>FCS Express 6</td><td></td><td></td><td>Fourni par UIUC CMtO</td></tr><tr><td>FL microscope</td><td>EVOS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromètre</td><td>Photon Technology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma Series II Enveloppe d’eau CO2&nbsp ; Incubateur</td><td>Fisher Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>IGROV-1</td><td></td><td></td><td>Un don offert par le Prof. Erik Nelson Lab, Université de l’Illinois Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 42R Incubated Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 700</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Système de Couvre-Vitrage Borosicilate</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>155383</tr><tr><td>OVCAR-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-161</td><td></td></tr><tr><td>PEO4</td><td></td><td></td><td>Un cadeau offert par le Prof. Erik Nelson Lab, Université de l’Illinois Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>Pierce Inhibiteur de protéase</td><td>Comprimés Thermo Scientific</td><td>A32963</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI, 10 % FBS, 1 % P/S</td><td>Préparé par l’installation de milieux cellulaires</td><td></td><td></td> de l’UIUC</tr><tr><td>RPMI, 20 % FBS, 1 % P/S, 0,01 mg/mL Insuline</td><td></td><td></td><td>Préparé par l’installation de milieux cellulaires de l’UIUC</td></tr></tbody></table>

application d’aldesense pour stratifier les cellules cancéreuses de l’ovaire en fonction de l’activité de l’aldéhyde déshydrogénase 1a1

Application of AlDeSense to Stratify Ovarian Cancer Cells Based on Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Activity

La rechute après un traitement anticancéreux est souvent attribuée à la persistance d’une sous-population de cellules tumorales appelées cellules souches cancéreuses (CSC), qui se caractérisent par leur remarquable capacité d’initiation tumorale et d’auto-renouvellement. Selon l’origine de la tumeur (par exemple, les ovaires), le profil de biomarqueur de surface du CSC peut varier considérablement, ce qui rend l’identification de ces cellules par coloration immunohistochimique une entreprise difficile. Au contraire, l’aldéhyde déshydrogénase 1A1 (ALDH1A1) est apparue comme un excellent marqueur pour identifier les CSC, en raison de son profil d’expression conservé dans presque toutes les cellules progénitrices, y compris les CSC. L’isoforme ALDH1A1 appartient à une superfamille de 19 enzymes responsables de l’oxydation de divers aldéhydes endogènes et xénobiotiques en produits d’acide carboxylique correspondants. Chan et al. ont récemment développé AlDeSense, une sonde isoforme-sélective pour la détection de l’activité ALDH1A1, ainsi qu’un réactif de contrôle d’appariement non réactif (Ctrl-AlDeSense) pour tenir compte de la coloration hors cible. Cet outil sélectif des isoformes s’est déjà avéré être un outil chimique polyvalent grâce à la détection de l’activité de l’ALDH1A1 dans les cellules leucémiques myéloïdes K562, les mammosphères et les xénogreffes CSC dérivées du mélanome. Dans cet article, l’utilité de la sonde a été démontrée par des expériences supplémentaires de fluorimétrie, de microscopie confocale et de cytométrie en flux où l’activité relative de l’ALDH1A1 a été déterminée dans un panel de cinq lignées cellulaires de cancer de l’ovaire.

Activité totale de l’ALDH1A1 des homogénats de cellules cancéreuses de l’ovaire Les activations moyennes de pli pour chaque lignée cellulaire obtenue à partir de ce test sont les suivantes: BG-1 (1,12 ± 0,01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1,72 ± 0,06); PEO4 (2,51 ± 0,29); et OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64713/64713fig02.jpg"> <strong...

Les méthodes de mesure de l’activité de l’ALDH1A1 dans les cellules vivantes sont essentielles dans la recherche sur le cancer en raison de son statut de biomarqueur de la souches. Dans cette étude, nous avons utilisé une sonde fluorogénique sélective isoforme pour déterminer les niveaux relatifs d’activité ALDH1A1 dans un panel de cinq lignées cellulaires de cancer de l’ovaire.

Application d’AlDeSense pour stratifier les cellules cancéreuses de l’ovaire en fonction de l’activité de l’aldéhyde déshydrogénase 1A1

Relapse after cancer treatment is often attributed to the persistence of a subpopulation of tumor cells known as cancer stem cells (CSCs), which are ...

Notre protocole permet aux utilisateurs de mesurer l’activité d’ALDH1A1, un biomarqueur de cellules souches en utilisant diverses modalités allant de la cytométrie en flux à l’imagerie moléculaire de cellules vivantes. Les principaux avantages de cette approche sont que l’activation de la sonde implique la réponse de retournement caractérisée par un rapport signal / bruit de fond élevé, ainsi qu’une détection sélective des isoformes ALDH1A1. Michael Lee, Sarah Gardner et Rodrigo Tapia Hernandez feront la démonstration de cette procédure, des étudiants diplômés de mon laboratoire.Pour commencer, aspirez le milieu de croissance des cellules cultivées d’intérêt dans huit lames de chambre de puits. Ajouter 500 microlitres par puits de milieu libre de sérum complété par une sonde fluorogénique sélective isoforme à deux micromolaires ou une sonde témoin non réactive. Incuber la lame à température ambiante pendant 30 minutes.Après l’incubation, procéder immédiatement à l’imagerie au microscope confocal. Localisez les cellules à un grossissement de 10 x. Le canal FITC et les canaux lumineux transmis sont nécessaires pour cette expérience.Localisez et focalisez les cellules à l’aide du canal lumineux transmis pour faire la mise au point sur le même plan Z pendant toute l’expérience afin d’éliminer les biais. Ajustez la puissance laser et le gain FITC au réglage approprié où le signal des échantillons AlDeSense AM de contrôle est détectable au minimum, tout en voyant le signal dans les échantillons AlDeSense AM. Ajustez chaque paramètre en faisant glisser la barre correspondante.Les paramètres devront peut-être être ajustés plusieurs fois pour identifier les paramètres corrects. Une fois optimisé, complétez le reste de l’expérience au sein de cette lignée cellulaire en utilisant des paramètres identiques. Prenez trois images par puits pour un total de trois puits par condition de traitement et enregistrez les images.Assurez-vous de faire la mise au point en utilisant le canal lumineux transmis uniquement lors de la commutation entre les plans et les puits pour éviter les biais. Ensuite, à l’aide du logiciel de traitement d’image, divisez le fichier CZI en différents canaux et comptez le nombre total de cellules et de cellules fluorescentes. Pour déterminer le pourcentage de cellules positives à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1, divisez le nombre de cellules fluorescentes par le nombre total de cellules dans chaque image.Comptez de la même manière pour chaque image afin d’éviter de confondre les variables. Sortir une fiole de culture cellulaire T25 contenant les cellules maintenues dans l’incubateur. Ajoutez de la trypsine pour le détachement cellulaire et comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.Ensuite, pelletez les cellules dans un tube centrifuge de 15 millilitres par centrifugation à 180G pendant cinq minutes à 25 degrés Celsius. Re-suspendre les cellules dans un millilitre d’une sonde à deux micromolaires ou d’une solution de sonde témoin dans du PBS. Balancez les cellules à température ambiante pendant 60 minutes pour assurer une exposition uniforme au colorant.Après la période d’incubation, granuler les cellules par centrifugation à 180 G pendant cinq minutes à 25 degrés Celsius. Ensuite, re-suspendez les cellules dans 0,5 millilitre de PBS. Faites passer les cellules à travers une crépine à mailles de nylon de 35 micromètres sur un tube placé sur de la glace pour éliminer les amas cellulaires qui peuvent obstruer le cytomètre en flux.Allumez l’instrument de cytomètre en flux et exécutez le protocole de démarrage. Vérifiez s’il y a du liquide de gaine et une taille vide. Faites fonctionner les lignes avec 10% d’eau de Javel et d’eau pendant cinq minutes chacune.Ensuite, exécutez des perles de contrôle de la qualité pour assurer le bon fonctionnement. Dans l’onglet Paramètres, sélectionnez Diffusion latérale vers l’avant et FITC pour le filtre de fluorescence. Tracez une zone de diffusion vers l’avant par rapport à un graphique de zone de diffusion latérale pour la population cellulaire principale près du centre du graphique.Ensuite, tracez une zone de dispersion vers l’avant, par opposition à un tracé de largeur de dispersion vers l’avant pour les bandes horizontales étroites indiquant des singulettes. Dessinez ensuite une zone FITC en fonction d’un diagramme de zone de diffusion vers l’avant pour observer la distribution des cellules triées par la sonde fluorogénique sélective isoforme. Ensuite, dessinez un histogramme de zone FITC pour observer le changement de population basé sur FITC et déterminer le pourcentage de cellules positives à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1.Pour optimiser la puissance laser FITC, exécutez un échantillon avec la sonde de sorte que la queue droite de la courbe de l’histogramme soit proche du signal de zone FITC maximal. L’étape d’optimisation de la puissance laser peut devoir être répétée plusieurs fois, mais la puissance laser ne doit pas être modifiée d’un échantillon à l’autre, une fois qu’un réglage a été désigné pour une expérience. Ensuite, ajoutez un échantillon au tamis et exécutez-le avec la sonde de contrôle.Un déplacement de population doit être observable pour révéler la plage dynamique maximale. Exécutez chaque échantillon pour 10 000 comptages effectués en trois exemplaires. Une fois le prélèvement d’échantillons terminé, faites fonctionner les conduites avec 10 % d’eau de Javel et d’eau pendant cinq minutes chacune, puis éteignez l’instrument.Traitez les données à l’aide d’un logiciel de cytométrie en flux et effectuez la démarche de la population cellulaire souhaitée. À l’aide de la sélection de la porte rectangulaire, définissez la démarche négative de l’aldéhyde déshydrogénase 1A1, de sorte que plus de 99,5 % des événements dans les échantillons de sonde de contrôle se produisent à l’intérieur de cette porte. Les cellules restantes seront considérées comme positives à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1.Appliquez les mêmes portes à l’échantillon de sonde. Quantifier le nombre d’événements considérés comme aldéhyde déshydrogénase 1A1 négatifs et 1A1 positifs. Les activations moyennes de plis pour chaque lignée cellulaire ont été déterminées pour quantifier l’activité totale de l’aldéhyde déshydrogénase 1A1.Le pourcentage de cellules positives à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1 a été déterminé dans chaque lignée cellulaire en réglant la puissance et le gain du laser. Pour minimiser le signal dans l’échantillon de contrôle traité AlDeSense AM, le signal de fluorescence a été optimisé dans les cellules traitées AlDeSense AM. En comptant le nombre de cellules positives à l’aldéhyde déshydrogénase A1A, le pourcentage de cellules positives à l’aldéhyde déshydrogénase A1A a été déterminé.Avec l’application de la sonde fluorogénique sélective isoforme, la population cellulaire positive à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1 a été quantifiée dans chaque lignée cellulaire en évaluant les 0,5 % des cellules les plus brillantes de la population témoin traitée par AlDeSense AM. L’analyse du panel de cellules cancéreuses de l’ovaire a révélé le pourcentage de cellules positives à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1. À partir des résultats obtenus des lignées cellulaires cancéreuses testées, on peut conclure que BG-1 a la plus faible activité aldéhyde déshydrogénase 1A1 et la plus faible aldéhyde déshydrogénase 1A1 population positive.De plus, l’imagerie confocale et la cytométrie en flux ont révélé le plus grand pourcentage de cellules positives à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1 dans les cellules Caov-3. Mais l’activité globale de la lignée cellulaire n’était que la troisième plus élevée. Alternativement, les cellules OVCAR-3 contenaient la troisième population positive à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1 la plus élevée, mais présentaient l’activité globale la plus élevée.AlDeSense est une sonde polyvalente et généralisable pour identifier les CSC dans les lignées cellulaires immortalisées et dans les échantillons de patients. Nous espérons le voir comme un outil pronostique en milieu clinique.

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Ici, nous présentons un protocole pour tester l’efficacité des thérapies ciblées sélectionnées basées sur la composition génomique d’une tumeur. Le protocole décrit l’identification et la validation des réarrangements structurels d’ADN, l’engraftment des tumeurs des patients dans les souris et les réponses d’essai aux drogues correspondantes.

Test de thérapies ciblées dans le cancer à l’aide de l’analyse structurale de l’altération de l’ADN et des Xénogreffes dérivées du patient

Ce protocole décrit un flux de travail à haut débit pour la segmentation basée sur l’intelligence artificielle des régions d’intérêt confirmées par la pathologie à partir d’images de coupes de tissus minces et colorées pour l’enrichissement des populations cellulaires résolues par histologie à l’aide de la microdissection laser. Cette stratégie comprend un nouvel algorithme permettant le transfert de démarcations désignant des populations cellulaires d’intérêt directement aux microscopes laser.

Microdissection laser industrialisée guidée par l’intelligence artificielle pour l’analyse protéomique à micro-échelle du microenvironnement tumoral

Nous présentons un protocole qui peut être utilisé pour effectuer des tests thérapeutiques de médicaments avec des organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patientes.

Modèles organoïdes dérivés de patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire pour les tests précliniques de médicaments

Ce protocole offre un cadre systématique pour l’établissement d’organoïdes du cancer de l’ovaire à différents stades de la maladie et relève les défis de la variabilité spécifique à la patiente pour augmenter le rendement et permettre une expansion robuste à long terme pour des applications ultérieures. Il comprend des étapes détaillées pour le traitement des tissus, l’ensemencement, l’ajustement des exigences en matière de milieux et la coloration par immunofluorescence.

Stratégie de mise en banque d’organoïdes du cancer de l’ovaire : Aborder l’hétérogénéité interpatiente entre les sous-types histologiques et les stades de la maladie

Le protocole décrit un test d’hybridation par immunofluorescence en tandem avec du tissu fixé au formol et inclus dans de la paraffine pour détecter et quantifier simultanément les microARN et les protéines multiplexées.

Amplification et reconnaissance de microARN par hybridation in situ d’acides nucléiques verrouillés en tant que nouvelle méthode de détection et de quantification

Ce protocole expérimental offre une méthode stable, rentable et efficace qui combine le knockdown de l’ARNnc avec des tests formant des colonies afin de quantifier l’effet de l’ARNnc sur la prolifération cellulaire de l’ostéosarcome.

Essai de formation de colonie détectant la capacité proliflective des cellules d’ostéosarcome à élimination d’ARNCn

Découvrez une méthode de cytométrie en flux et d'imagerie moléculaire en cellules vivantes pour mesurer l'activité ALDH1A1, biomarqueur de stemness, dans les lignées cellulaires de cancer de l'ovaire. Cette approche utilise une sonde fluorogénique isoforme-sélective offrant une haute spécificité et un excellent rapport signal/bruit pour identifier les cellules souches cancéreuses.

Application d’AlDeSense pour stratifier les cellules cancéreuses de l’ovaire en fonction de l’activité de l’aldéhyde déshydrogénase 1A1 (Vidéo) | JoVE Journal

Application d’AlDeSense pour stratifier les cellules cancéreuses de l’ovaire en fonction de l’activité de l’aldéhyde déshydrogénase 1A1

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