Name: Un modèle 3D de moelle osseuse humaine pour étudier la dynamique et les interactions entre les cellules résidentes dans des contextes physiologiques ou tuboraux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Découvrez un modèle microphysiologique 3D de moelle osseuse humaine utilisant des lignées cellulaires et des cellules primaires. Ce système standardisé permet l'analyse d'imagerie et moléculaire des interactions cellulaires dans des contextes physiologiques ou tumoraux.

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Nous remercions P. Battiston-Montagne et A. Jambon de la plateforme de cytométrie du CRCL ainsi que N. Gadot et C. Leneve de la Plateforme de pathologie de recherche, Département de recherche translationnelle et innovation, Centre Léon Bérard. Les auteurs remercient B. Manship pour l’édition anglaise. Ces travaux ont été financés par l’Inserm et FI-LMC à V. M. S., et S. L. K. A. et L. B. ont bénéficié d’une subvention de la Société Française d’Hématologie.

REMARQUE: Pour préparer la structure du squelette semblable à la moelle osseuse, ce protocole repose sur la combinaison de billes avec des cellules endothéliales HMEC-1 et des cellules stromales HS27A sur des billes de phosphate de calcium biphasique (BCP). Les perles BCP serviront d’échafaudage permettant, avec un support spécifique, la mise en forme structurelle 3D.
1. Préparation et stérilisation des billes
<ol><li>Peser de 35 à 40 mg de billes de PCA (HA/β-TCP 60/40; 45-75 μm) pour chaque insert (petite boîte cylindrique en plastique avec une membrane de polycarbonate au fond) dans un tube de 1,5 mL (voir le tableau des matériaux). Après avoir pesé les billes, percez un petit trou avec une aiguille propre dans le haut du tube de 1,5 ml pour éviter que le couvercle ne s’ouvre pendant le cycle de l’autoclave (121 °C pendant 60 min) et placez les tubes en position verticale dans une boîte stérile fermée.</li>
</ol>2.3D insérer la préparation sous une hotte stérile
<ol><li>Placez des inserts de culture cellulaire en polycarbonate stérile dans les puits d’une plaque à 6 puits. Versez les billes de BCP stériles d’un tube de 1,5 mL dans l’insert. Lavez soigneusement les billes en versant 350 μL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’intérieur de l’insert, puis ajoutez 4,5 mL de 1x PBS au puits. Retirez et jetez le PBS à l’aide d’un vide ou d’une pipette de 5 mL en plaçant l’embout dans un coin du puits. Répétez l’étape de lavage deux fois.</li>
	<li>Une fois les perles lavées, utilisez 1x PBS complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) pour bloquer le système. Ajouter délicatement 350 μL de la solution de blocage à l’insert et 4,5 mL au puits et placer la plaque entière dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2 pendant la nuit. REMARQUE : Les étapes 2.1 et 2.2 aident à minimiser la libération d’ions par les billes de PCA avant l’ensemencement cellulaire.</li>
</ol>3. Prélèvement de lignées cellulaires et maintenance 3D
REMARQUE: Après cette étape d’incubation, des cellules microenvironnementales sont ajoutées pour former le squelette de la structure 3D. Ce système est basé sur l’utilisation de HMEC-1, cellules endothéliales microvasculaires humaines immortalisées avec un grand antigène T de SV40, et HS27A, cellules stromales de moelle osseuse humaine immortalisées avec le virus du papillome humain, en raison de leur capacité à former une structure solide de type BM et de leur compatibilité avec l’inclusion de cellules endothéliales.
<ol><li>Avant d’ajouter des cellules au système, préparez les milieux d’incubation suivants :<ol><li>Pour 50 mL de milieu de différenciation ostéo (ODM) complet, mélanger 45 mL de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco + 5 mL de FBS + 0,5 mL de pénicilline-streptomycine + 8 × 10-4 mg/L de dexaméthasone + 2,16 g/L de bêta-glycérophosphate + 44 mg/L d’acide ascorbique.</li>
		<li>Pour 50 mL de milieu HMEC-1 complet, mélanger 45 mL de MCDB 131 + 5 mL de FBS + 0,5 mL de pénicilline-streptomycine + 1 % de substitut de glutamine + 1 mg/L d’hydrocortisone + 10 μg/L d’EGF.</li>
	</ol></li>
	<li>Retirez la solution de blocage du système. Mélanger 1 × 10 6 cellules HMEC-1 (représentant le compartiment vasculaire) et 2 × 106 cellules HS27A (représentant le compartiment des cellules stromales mésenchymateuses) dans un tube de 15 ml et centrifuger pendant 5 min à 1 575 × g à température ambiante. Jeter le surnageant et ajouter 175 μL de milieu HMEC-1 (milieu spécifique pour la croissance cellulaire HMEC-1) avec 175 μL d’ODM (milieu spécifique pour l’ostéodifférenciation HS27A).</li>
	<li>Versez 350 μL de cette suspension contenant 3 × 106 cellules totales à l’intérieur de chaque insert. Ensuite, versez 4,5 mL du milieu combiné (2,25 mL de milieu HMEC-1 + 2,25 mL d’ODM) sans cellules dans les puits de la plaque. Aspirer doucement et distribuer le mélange plusieurs fois avec une micropipette de 1 mL pour homogénéiser les cellules et les billes de PCA dans l’insert. Répartir le mélange entier pour qu’il se dépose au bas de l’insert. REMARQUE: Une préparation de mélange avec un volume mort est recommandée si plusieurs inserts sont cultivés. Par exemple, si quatre inserts sont cultivés, préparez toujours le volume requis pour cinq inserts.</li>
	<li>Une fois que les cellules endothéliales et mésenchymateuses sont homogénéisées à l’intérieur de l’insert, conserver la plaque à 6 puits dans un incubateur à 37 °C, 5% CO2 pendant 3 semaines. Changez le milieu à l’intérieur de l’insert et du puits 2x par semaine en retirant soigneusement le fluide de l’insert à l’aide d’une micropipette de 1 mL et en plaçant l’embout sur la paroi intérieure de l’insert pour éviter de déranger le coin de l’insert. REMARQUE: Le surnageant récupéré peut être stocké à -80 ° C à n’importe quelle étape pour une quantification ultérieure des protéines.</li>
</ol>4. Ajout de cellules d’intérêt dans le système
NOTE: Après 3 semaines de culture HMEC-1 et HS27A, l’ostéodifférenciation des cellules HS27A a permis la rigidification du système. À cette étape, ajoutez des cellules hématologiques d’intérêt (le nombre de cellules ajoutées peut varier de 1 × 104 à 1 × 106) dans l’insert. Les cellules ajoutées étaient des cellules TF1 transfectées avec l’oncogène BCR-ABL et des cellules CD34+ mononucléées primaires provenant soit de patients atteints de leucémie myéloïde aiguë, soit de donneurs sains.
<ol><li>Changez la composition du milieu à cette étape, car le composé ODM est toxique pour les cellules hématologiques et il n’est pas nécessaire de continuer à l’ajouter une fois la rigidification du système terminée. Par exemple, pour soutenir le maintien hématopoïétique, substituer le milieu ODM par un RPMI complet pour les lignées cellulaires hématopoïétiques (RPMI complété par 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine) ou IMDM pour les cellules hématopoïétiques primaires. Préparer un lot de milieu HMEC-1 complet à 50 % et de milieu RPMI/IMDM complet à 50 % pour les changements hebdomadaires du milieu 3D (deux fois).</li>
	<li>Remettez en suspension les cellules hématologiques d’intérêt dans ce milieu combiné et ajoutez-les dans l’insert. Si un protocole de traitement médicamenteux est nécessaire, attendez 24 heures après avoir ajouté les cellules d’intérêt avant de traiter, ce qui leur donne le temps d’adhérer à la structure osseuse.</li>
	<li>Adapter la période de culture cellulaire 3D en fonction des besoins. Actualiser le milieu (milieu complet HMEC-1 à 50 % + milieu complet à 50 % RPMI) deux fois par semaine. REMARQUE: Au cours de la culture cellulaire 3D, certaines cellules adhérentes peuvent fuir à l’extérieur de l’insert dans le fond des puits, augmentant ainsi la consommation du milieu. Vérifiez au microscope la dispersion cellulaire au-delà de l’insert et remplacez l’insert dans une nouvelle plaque à 6 puits sous une hotte stérile si nécessaire.</li>
</ol>5.3D Résultats expérimentaux de type moelle osseuse
NOTE: Après la culture 3D, plusieurs résultats peuvent être obtenus en fonction des objectifs de l’expérience.
<ol><li>Analyse des protéines REMARQUE: Au cours de l’expérience 3D, les protéines sécrétées par les cellules présentes dans la structure semblable à la moelle osseuse peuvent être collectées pour des analyses plus approfondies.<ol><li>Lorsque le milieu de culture est changé 2 fois par semaine, stocker le surnageant récupéré de l’intérieur de l’insert à -80 °C pour évaluer la production de protéines d’intérêt dans le système.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissociation des cellules de la structure 3D (sous une capuche stérile si les cellules doivent être triées) REMARQUE: Les cellules cultivées dans le système 3D semblable à la moelle osseuse peuvent être récupérées, triées et analysées plus avant.<ol><li>À la fin de l’expérience, dans un tube de 15 mL, mélanger 4,5 mL de RPMI avec 0,5 mL de FBS complété par 0,4 mg/mL de collagénase, et réchauffer la solution à 37 °C pendant 10 min.</li>
		<li>Placez l’insert à l’envers (côté membrane blanche sur le dessus) sur un couvercle de plaque stérile à 6 puits pour découper correctement la membrane. Utilisez un scalpel stérile pour couper la membrane des côtés, récupérant ainsi un disque solide blanc. Placer le disque à l’intérieur du tube chaud de 15 mL préparé à l’étape 5.2.1.</li>
		<li>Placer le tube dans une roue active dans un incubateur à 37 °C et incuber pendant 10 min pour permettre la digestion (au contact de la collagénase). Appliquez le même temps d’incubation pour toutes les membranes afin d’éviter une analyse biaisée.</li>
		<li>Après 10 min, centrifuger le tube de 15 mL pendant 5 min à 1 575 × g à température ambiante, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 5 mL de PBS chaud 1x. REMARQUE: À cette étape, comme la membrane de polycarbonate flotte généralement dans la fraction surnageante, elle peut être éliminée à l’aide d’une pointe de pipette stérile. Si la membrane est toujours incluse dans la pastille, laissez-la et retirez-la à la fin de l’étape suivante.</li>
		<li>Remettez la pastille en suspension dans 300 μL de trypsine tiède, faites tourbillonner le tube pendant 10 s et placez-le dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 min.</li>
		<li>Arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant 1 mL de FBS pur et chaud. Avec une micropipette de 1 mL, aspirer mécaniquement et distribuer le milieu pour dissocier complètement le disque. ATTENTION : L’étape d’aspiration/distribution doit être très rapide, sinon les billes sédimenteront à l’intérieur de la pointe.</li>
		<li>Centrifuger le tube pendant 5 min à 1 575 × g. Remettez la pastille en suspension dans 3 mL de 1x PBS complété par 10% FBS.</li>
		<li>Laisser les billes sédimenter pendant 5 s avant de recueillir le surnageant et de le filtrer à travers une crépine cellulaire de 35 μm placée sur un tube collecteur. Centrifuger le filtrat récupéré pendant 5 min à 1 575 × g. Compter les cellules avec du bleu de trypan pour évaluer la viabilité et procéder à des analyses de cytométrie en flux. REMARQUE: Le nombre de cellules viables récupérées après l’incubation du bleu trypan est de ~1-2 × 105 cellules par insert digéré.</li>
	</ol></li>
	<li>Marquage par cytométrie en flux des cellules récupérées REMARQUE: Les cellules récupérées de la structure 3D en forme de moelle osseuse peuvent être marquées et analysées par cytométrie en flux. Utilisez un mélange d’anticorps pour détecter les différents compartiments après dissociation 3D. Ici, CD45 (colore les cellules hématologiques d’intérêt), CD31 (colore le compartiment vasculaire) et CD73 (colore le compartiment ostéoblastique) ont été utilisés à 1 μL dans 50 μL de PBS + 2% FBS. Gardez toutes les cellules préparées et les anticorps sur de la glace (4 °C) à l’abri de la lumière pendant tout le processus.<ol><li>Remettez les pastilles en suspension dans le mélange d’anticorps et incuber pendant 30 à 40 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de PBS + 2% FBS pour laver les cellules et centrifuger pendant 5 min à 1 575 × g.</li>
		<li>Resuspendre la pastille récupérée dans 200 μL de 1x PBS + 10% FBS supplémenté en 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, dilué 1:2 000).</li>
		<li>Analyser les tubes dans un cytomètre en utilisant les paramètres suivants: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. Utilisez un graphique FSC-H versus FSC-W pour inclure la population singulet. Dans la fraction singulet, utilisez un graphique DAPI-A versus FSC-A pour déterminer la population de cellules viables (DAPI-négatif). Avec la population DAPI négative précédemment contrôlée, utilisez un graphique APC-A versus FSC-A pour déterminer la population CD45-positive.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixation de la structure 3D ressemblant à une moelle osseuse REMARQUE: La fixation de la structure 3D de type BM est généralement effectuée pour l’immunohistochimie ou l’immunofluorescence afin de visualiser les cellules in situ et pour une coloration spécifique ultérieure.<ol><li>Pour fixer la structure de type BM, transférez l’insert (étape 4.3) de l’ancienne plaque vers une nouvelle plaque à 6 puits remplie de 1x PBS. Ensuite, remplacez doucement le support à l’intérieur de l’insert avec 1x PBS. REMARQUE: Ne pas rincer la structure formée avec PBS; la pression du liquide peut altérer la structure 3D.</li>
		<li>Une fois l’insert lavé, placez-le dans une nouvelle plaque à 6 puits et remplissez le puits et l’insert avec du paraformaldéhyde (PFA) fraîchement ouvert à 4% (dilué à 16% dans 1x PBS).</li>
		<li>Laissez le processus de fixation se dérouler pendant 4 h à température ambiante, à l’abri de la lumière.</li>
		<li>À la fin du processus de fixation, lavez l’insert une fois avec 1x PBS et conservez-le à 4 °C à l’abri de la lumière.</li>
		<li>Coupez la membrane au bas de l’insert comme décrit à l’étape 5.2.2 pour récupérer le disque solide.</li>
		<li>Incuber le disque 4x pendant 48 h dans de l’EDTA (0,5 M, pH 8) afin de décalcifier la structure.</li>
		<li>Incorporer la structure dans de la paraffine et trancher des sections de 4 μm d’épaisseur.</li>
		<li>À l’aide d’un immunocolorant automatisé, incuber les sections avec des anticorps anti-CD45, anti-CD73 et Ki67. Visualisez la coloration avec une peroxydase de raifort anti-lapin ou -souris (HRP) et avec 3,3'-diaminobenzidine comme substrat chromogène et contre-coloration avec la hématoxyline de Gill.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

L’un des défis actuels auxquels sont confrontées les études sur les problèmes physiologiques humains et les problèmes pathologiques associés est le manque de modèles imitant avec précision les fonctions complexes des organes humains. Dans le cas des modèles 3D BM humains, de nombreux modèles utilisent des hydrogels et reproduisent partiellement le BM, illustrant la puissance des conditions de culture 3D par rapport aux cultures 2D classiques pour assurer, par exemple, une meilleure différenciation ostéoblastique27,28. Néanmoins, malgré une bonne reproductibilité et une facilité d’utilisation, ces systèmes n’imitent pas la structure et l’architecture humaines BM 3D, ce qui peut avoir un impact significatif sur les analyses ultérieures. Les progrès technologiques ont permis aux scientifiques de mieux reproduire l’environnement de niche ostéoblastique humain natif en utilisant un système de bioréacteur à base de perfusion pour maintenir certaines propriétés HSC29. Le développement de dispositifs microfluidiques a conduit à de nouvelles approches pour reproduire une structure pertinente semblable à la moelle osseuse, mais n’ont jusqu’à présent atteint que des caractéristiques limitées de la moelle osseuse et ont donc des applications restreintes30,31,32,33.
Les progrès des sciences des matériaux ont contribué au développement d’une large gamme de biomatériaux naturels ou synthétiques, qui peuvent être utilisés pour développer des systèmes de culture osseuse 3D pertinents. Cependant, de tels systèmes sont parfois difficiles à développer dans des laboratoires biologiques standard sans compétences internes en biophysique. De plus, dans la plupart des cas, ces systèmes atteignent une capacité limitée à imiter la structure 3D de l’os humain, y compris le microenvironnement BM, et ont utilisé de grandes quantités de cytokines et de facteurs de croissance, créant un milieu de culture artificiellement riche34.
Le choix d’induire une différenciation ostéoblastique plutôt qu’une différenciation adipocytaire était basé sur le fait que les préostéoblastes et les ostéoblastes ont été décrits comme faisant partie de la niche endostéale35. Cela a permis d’identifier les cellules ostéoblastiques comme composants demandés de l’os et de la moelle osseuse. Parmi les composants cellulaires de la moelle osseuse, les cellules endothéliales et stromales occupent une grande partie du microenvironnement. De plus, ces deux types cellulaires produisent des composants structurels non cellulaires de la matrice extracellulaire et des cytokines impliquées dans la régulation de l’homéostasie et de la différenciation, demandées ici pour générer une structure calcifiée. Ainsi, cela justifie l’utilisation de cellules endothéliales et stromales, et notre choix de lignées cellulaires pour permettre un accès facile et augmenter la reproductibilité entre laboratoires. La culture de la lignée HMEC-1 étant plus stable dans le temps, cette lignée cellulaire a été retenue pour le développement du système 3D. Pour les cellules stromales, nous avons comparé en culture 2D la capacité de différenciation des ostéoblastes des lignées cellulaires stromales dérivées de la moelle osseuse normale : HS5 et HS27A. Nous avons constaté que la lignée HS5 ne différenciait pas autant que la lignée HS27A dans le système 3D généré avec l’une ou l’autre lignée cellulaire. À cet égard, les tentatives de remplacement des cellules HS27A par la lignée HS5 ont abouti à la production d’une structure moins rigide, ce qui suggère que HS27A est plus approprié.
Les lignées cellulaires HS27A et HMEC-1 ont été cultivées dans différentes combinaisons de milieux, dans lesquelles on obtient la meilleure structure rigide et les meilleurs alignements de HMEC-1 le long des structures ostéoblastiques de sorte que la production de la matrice extracellulaire apporte une rigidité relative à la structure de base. L’analyse de l’avancement de la différenciation à D14 a montré que la différenciation était plus avancée à D21 (mesure de BSP, marqueur ostéoblastique tardif), avec un rapport de 1:2 pour HMEC-1:HS27A et avec de meilleurs résultats lorsque 2 × 106 HS27A ont été introduits. Les cellules endothéliales jouent également un rôle important dans la régulation de l’homéostasie et de la différenciation (entre autres par l’apport de cytokines). Le fait que les cellules HMEC-1 soient maintenues dans ce système indique qu’elles peuvent au moins remplir ce rôle, ce qui contribue à la légitimité de notre modèle. Pour la lignée endothéliale HMEC-1, il était important de l’introduire suffisamment tôt pour qu’elle puisse être correctement intégrée dans la structure et avec l’espoir que ces cellules puissent former des alignements ou même des tubes à l’intérieur de la structure. Des essais de coculture de HS27A et HMEC-1 ont été effectués en introduisant ce dernier à différents stades : D0, D7, D14 ; Aucune différence notable n’a été observée, ni dans la différenciation des cellules stromales, ni dans le maintien ou le positionnement des cellules endothéliales. Ainsi, ces cellules ont été introduites au début du processus. Les cellules hématopoïétiques ont été introduites à un moment où la différenciation ostéoblastique serait suffisamment avancée pour favoriser les interactions cellule-cellule. Ce choix a également été conditionné par le fait que cette différenciation ostéoblastique est conditionnée par l’utilisation d’un milieu, qui selon nos tests, ne supporte pas pleinement le maintien des cellules hématopoïétiques. Les cellules hématologiques peuvent être des lignées cellulaires ou des cellules hématopoïétiques primaires BM CD45.
A partir de ce modèle 3D, on pourrait envisager de remplacer chaque type cellulaire par des cellules primaires, normales ou pathologiques, voire d’ajouter d’autres types cellulaires pour booster les propriétés biomimétiques, comme les cellules immunitaires, les adipocytes ou les fibroblastes26. En fait, la lignée cellulaire HS27A a été remplacée par des CSM BM primaires à faible passaging. De même, les lignées cellulaires hématologiques ont été remplacées par des cellules hématopoïétiques BM primaires. Cependant, le remplacement des cellules HMEC-1 par des cellules endothéliales primaires n’a pas encore été testé. Actuellement, ce modèle pourrait encore être amélioré en termes de représentation vasculaire, car même si les cellules endothéliales sont présentes et interagissent correctement avec d’autres cellules du microenvironnement (par exemple, les cellules hématopoïétiques), elles ne forment pas de vaisseaux structurés, empêchant ainsi la perfusion de flux pour imiter les vaisseaux sanguins fonctionnels. Dans l’ensemble, cela pourrait progressivement augmenter la complexité et la représentativité du modèle 3D minimal actuel. L’ajout d’autres types de cellules peut faciliter les études portant sur d’autres questions, telles que l’importance de l’inflammation BM locale ou la résistance à l’immunothérapie.
Cependant, ce système 3D a besoin de 3 semaines avant que les cellules d’intérêt, les cellules hématologiques ou les cellules cancéreuses épithéliales si le processus de métastase est évalué, puissent être ajoutées. Les conditions stériles doivent être maintenues, car les changements de milieu deux fois par semaine peuvent parfois entraîner une contamination moyenne. De plus, étant donné que certaines cellules peuvent migrer à travers les pores de l’insert et commencer à se disperser dans le puits, ce qui entraîne une augmentation de la consommation moyenne, une surveillance régulière est recommandée.
Nous avons décrit ici un échafaudage 3D permettant la différenciation ostéoblastique et développé un microenvironnement humain, in vitro, pertinent de type BM humain. Ce système permet l’analyse in situ et la récupération ultime de cellules vivantes. Ce système fournit un nouvel outil très flexible, reproductible et convivial, avec un large éventail d’applications pour étudier les interactions et les mécanismes au sein du microenvironnement BM humain.

La moelle osseuse (BM) se trouve à la fois dans les cavités centrales des os axiaux et longs et des os plats trabéculaires, et contient une variété de composants cellulaires et non cellulaires distincts. Au niveau structurel, il est constitué d’îlots de tissu hématopoïétique (aussi appelés « hématons »)1,2 et de cellules adipeuses entourées de sinus vasculaires intercalés dans l’os trabéculaire3. Dans les os longs et plats, l’apport sanguin à l’os et à la moelle osseuse est interconnecté par un réseau endostéal de vaisseaux4. Caché dans ce solide réseau protecteur, le BM héberge des cellules très immatures immergées dans un stroma spongieux et constitue le lieu de différenciation des cellules souches mésenchymateuses résidentes (CSM) et des cellules souches hématopoïétiques (CSH)5. En effet, outre le renouvellement des tissus osseux par la production d’ostéoblastes, l’une des principales fonctions connues du BM réside dansle développement de l’hématopoïèse6.
Le tissu hématopoïétique BM comprend une variété de types de cellules, à savoir les CSH, les précurseurs et les cellules sanguines plus différenciées telles que les lymphocytes, les neutrophiles, les érythrocytes, les granulocytes, les monocytes et les thrombocytes7. Les cellules hématopoïétiques ne sont pas disposées au hasard dans l’espace BM mais présentent une organisation particulière au sein des niches hématopoïétiques, qui comprennent de nombreux types de cellules d’origines différentes (ostéoblastes, ostéoclastes, CSM, adipocytes, endothélium sinusoïdal et cellules stromales périvasculaires, cellules immunitaires, cellules nerveuses et cellules hématopoïétiques matures distinctes), formant une structure complexe pour assurer une hématopoïèse normale8 . Les fonctions biologiques de la niche hématopoïétique comprennent la régulation de la survie, de l’adhésion, de la quiescence, de la localisation et de la différenciation des CSH par différents mécanismes (interactions cellule-cellule et cellule-matrice, production de facteurs solubles, hypoxie) en réponse à de multiples stress physiologiques ou non physiologiques 3,6. Bien que ces niches hématopoïétiques aient été initialement perçues comme des entités homogènes, les avancées technologiques telles que les analyses unicellulaires et d’imagerie ont progressivement révélé leur complexité, leur dynamique et leurs propriétés adaptatives 9,10,11.
Le besoin crucial de remplacer et de réduire l’utilisation des animaux pour déchiffrer les processus physiologiques et pathologiques humains conduit à de nouvelles opportunités et défis11,12. Parmi les outils in vitro nouvellement décrits, des modèles tridimensionnels (3D) qui imitent mieux la BM humaine in vivo que les cultures bidimensionnelles (2D) classiques 13,14,15,16,17 ont été proposés. La modélisation 3D semble donc être une approche prometteuse pour observer les interactions cellule-cellule et cellule-matrice, plus proches de celles qui se produisent in vivo. À l’aide de divers de ces modèles, certaines équipes ont démontré la survie et la prolifération des CSS18,19. Plusieurs modèles 3D sont disponibles, l’approche la plus courante étant l’utilisation de biomatériaux 3D à base d’échafaudages tels que les hydrogels, les colloïdes ou les collagènes, associés aux CSM tirant parti de leurs capacités de différenciation de la lignée ostéoblastique20,21,22. Néanmoins, aucun consentement global n’a été obtenu pour satisfaire à toutes les exigences relatives aux études sur les cellules humaines d’une manière conviviale et normalisée23, d’autant plus que ces systèmes 3D actuels reposent principalement sur des cellules stromales primaires et souffrent donc d’un accès limité aux échantillons primaires, de la disponibilité des tissus et de l’hétérogénéité.
De plus, le compartiment des cellules endothéliales devrait être introduit car ces cellules représentent une composante majeure des interactions cellule-cellule et sont impliquées dans le devenir des cellules souches et le développement de la maladie BM, à la fois dans la leucémie24 et les métastases25. Nous avons précédemment rapporté que l’ajout d’éléments pathologiques dans un modèle de moelle osseuse humain 3D standardisé récapitule les caractéristiques observées dans les échantillons de patients telles que les altérations de la matrice extracellulaire (ECM)26. Pour mieux comprendre la dynamique et les interactions entre le microenvironnement BM humain et les cellules résidentes, nous fournissons un protocole détaillé pour un système convivial et standardisé afin de construire une structure minimale, bien organisée, semblable à BM. Ce système est composé de trois types de cellules de la moelle osseuse humaine - les cellules endothéliales et les cellules stromales, qui représentent le microenvironnement, et les CSH. En utilisant des billes spécifiques comme échafaudage et milieu de différenciation ostéoblastique, la structure 3D obtenue imitera la niche médullaire humaine, permettant une étude pratique de la moelle osseuse humaine.

<table><tbody><tr><td>Système de substrat liquide 3,3-diaminobenzidine (DAB)</td><td>MERCK SIGMA</td><td>D7304</td><td>Coloration IHC</td></tr><tr><td>5 mL Pipette</td><td>SARSTEDT</td><td>861253001</td><td>Changement moyen</td></tr><tr><td>Anti souris HRP</td><td>Thermofisher</td><td>62-6520</td><td>IHC Coloration secondaire</td></tr><tr><td>Anti Rabbit HRP</td><td>Thermofisher</td><td>31460</td><td>Coloration secondaire IHC</td></tr><tr><td>Acide ascorbique 250 &mu ; M</td><td>MERCK SIGMA</td><td>A92902</td><td>ODM medium</td></tr><tr><td>BCP</td><td>CaP Biomaterials LLC-US</td><td></td><td>3D Beads</td></tr><tr><td>Beta Glycerophosphate 10 mM</td><td>MERCK SIGMA</td><td>G9422</td><td>ODM medium</td></tr><tr><td>CD31-BV711</td><td>BD</td><td>744078</td><td>3D endothéliale Marquage de la population cellulaire</td></tr><tr><td>CD34-APC</td><td>BD</td><td>555824</td><td>3D immature hématologique Marquage de la population cellulaire</td></tr><tr><td>CD38-PE-Cy5</td><td>BD</td><td>555461</td><td>Marquage hématologique 3D de la population cellulaire progénitrice</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-110-637</td><td>Coloration IHC des cellules hématologiques</td></tr><tr><td>CD45-APC</td><td>BD</td><td>555485</td><td>3D Étiquetage de la population cellulaire</td></tr><tr><td>CD45-BV500</td><td>BD</td><td>560777</td><td>Étiquetage 3D de la population cellulaire</td></tr><tr><td>CD73</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-120-066</td><td>Coloration IHC du compartiment stromal</td></tr><tr><td>CD73-BV605</td><td>BD</td><td>563199</td><td>3D ostéoblastique Marquage de la population cellulaire</td></tr><tr><td>Passoire cellulaire pour équipement FACS avec tube de 5 mL</td><td>FALCON</td><td>352235</td><td>Passoire et tube utilisés pour collecter les cellules et éliminer les billes</td></tr><tr><td>Collagénase</td><td>MERCK SIGMA</td><td>C2674-1G</td><td>Dissociation enzymatique 3D</td></tr><tr><td>Cytométrie tube de filtration</td><td>Thermofisher</td><td>10585801</td><td>Filtration de cellules récupérées en 3D</td></tr><tr><td>Tube de cytométrie</td><td>Thermofisher</td><td>10100151</td><td>étiquetage de cellules récupérées en 3D&nbsp ;</td></tr><tr><td>DAPI (Solution 12)</td><td>Chemometec</td><td>910-3012</td><td>Marquage 3D des cellules viables</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Thermofisher</td><td>A13449</td><td>ODM moyen</td></tr><tr><td>DMEM, glycémie élevée, supplément GlutaMAX, pyruvate 500 mL</td><td>Thermofisher</td><td>31966021</td><td>ODM moyen</td></tr><tr><td>EGF</td><td>MERCK SIGMA</td><td>E9644-0.2MG&nbsp ;</td><td>HMED-1 moyen</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube de 1,5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>72696</td><td>Pour perles autoclave et surnageant</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL</td> FALCON <td>352096</td><td>Pour la dissociation 3D</td><td>FBS</td></tr><tr><td></td><td>DUTSCHER</td><td>S1900-500</td><td>Pour compléter le milieu de culture et arrêter l’action de la trypsine</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher</td><td>A1286001</td><td>substitut de glutamine pour le milieu HMED-1</td></tr><tr><td>Solution d’hématoxyline, Gill N° 1</td><td>MERCK SIGMA</td><td>GHS132-1L</td><td>Coloration IHC</td></tr><tr><td>HMEC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td>Population de cellules endothéliales 3D&nbsp ;</td></tr><tr><td>HS27A</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td>Population cellulaire ostéoblastique 3D&nbsp ;</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>MERCK SIGMA</td><td>H0135-1MG</td><td>HMED-1</td></tr><tr><td>medium Insert : Nunc Polycarbonate Inserts de culture cellulaire en plaques multi-puits</td><td>THERMO SCIENTIFIC NUNC</td> 140627 <td></td><td>Pour récolter des cellules et former une structure osseuse 3D</td></tr><tr><td>KI-67 IHC</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-14520</td><td>Coloration IHC des cellules prolifératives</td></tr><tr><td>MCDB 131 Medium, sans glutamine</td><td>Thermofisher</td><td>10372019</td><td>Micropipette moyenne HMED-1</td></tr><tr><td>(1 000 & micro ; L)</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp ; 4924000088</td><td>Changement de milieu</td></tr><tr><td>PBS D 1x</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>14190169 Cellules/ Lavage d’insert</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>Pour compléter le milieu de culture&nbsp ;</td></tr><tr><td>PFA (Formaldéhyde 16 %)</td><td>EUROMEDEX</td><td>EM-15710</td><td>Fixation 3D (dilution avec PBS 1X)</td></tr><tr><td>RMPI 1640 moyen, supplément glutamax</td><td>Thermofisher</td><td>61870044</td><td>Cuture</td></tr><tr><td>medium Scalpel</td><td>&nbsp ; FISHER SCIENTIFIC</td><td>11768353</td><td>Découpe de membrane 3D</td></tr><tr><td>Plaque à six puits</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td>Culture 3D</td></tr><tr><td>TRYPSINE-EDTA SOLUTION (1x)</td><td>Thermofisher</td><td>25300096</td><td>dissociation enzymatique 3D</td></tr></tbody></table>

un modèle 3d de moelle osseuse humaine pour étudier la dynamique et les interactions entre les cellules résidentes dans des contextes physiologiques ou tuboraux

A Human Bone Marrow 3D Model to Investigate the Dynamics and Interactions Between Resident Cells in Physiological or Tumoral Contexts

La niche médullaire est un écosystème complexe essentiel au maintien de l’homéostasie des cellules résidentes. En effet, la moelle osseuse, qui comprend une matrice extracellulaire complexe et divers types de cellules, telles que les cellules souches mésenchymateuses, les ostéoblastes et les cellules endothéliales, est profondément impliquée dans la régulation des cellules souches hématopoïétiques par le biais d’interactions cellulaires directes, ainsi que dans la production de cytokines. Pour imiter étroitement cette structure in vivo et mener des expériences reflétant les réponses de la moelle osseuse humaine, plusieurs modèles 3D ont été créés à partir de biomatériaux, en s’appuyant principalement sur des cellules stromales primaires. Ici, un protocole est décrit pour obtenir un système minimal et standardisé qui est facile à mettre en place et fournit des caractéristiques de structure semblable à la moelle osseuse, qui combine différentes populations cellulaires, y compris les cellules endothéliales, et reflète l’hétérogénéité du tissu de moelle osseuse in vivo . Cette structure 3D semblable à de la moelle osseuse, assemblée à l’aide de particules à base de phosphate de calcium et de lignées cellulaires humaines, représentatives du microenvironnement de la moelle osseuse, permet de surveiller une grande variété de processus biologiques en combinant ou en remplaçant différentes populations de cellules primaires au sein du système. Les structures 3D finales peuvent ensuite être récoltées pour l’analyse d’images après fixation, l’incorporation de paraffine et la coloration histologique / immunohistochimique pour la localisation cellulaire dans le système, ou dissociées pour collecter chaque composant cellulaire pour la caractérisation moléculaire ou fonctionnelle.

En utilisant ce protocole, il est possible de récapituler un microenvironnement minimal, in vitro, 3D, humain de type BM, à partir duquel des cellules viables de trois compartiments cellulaires différents peuvent être récupérées (Figure 1). En effet, après l’exposition souhaitée, les structures 3D de type BM peuvent être dissociées et les CSM, les cellules endothéliales et les cellules hématopoïétiques peuvent être évaluées/caractérisées par cytométrie en flux (Figure 2A). Jusqu’à présent, les résultats suggèrent qu’il est possible de maintenir des cellules hématologiques pendant au moins 6 semaines dans le modèle 3D, avant de récupérer des cellules viables (Figure 2B). Cependant, des recherches futures sont nécessaires pour estimer la limite de ce modèle 3D. De plus, si nécessaire, il est possible de remplacer la lignée cellulaire HS27A par une CSM primaire de la moelle osseuse normale (MNN) ou une CSM de leucémie myéloïde aiguë (LAM) dans ce modèle 3D de type BM (figure 2C) ou de remplacer la lignée cellulaire hématopoïétique par des CSH primaires (figure 2D). De plus, lors de l’analyse des interactions entre les compartiments cellulaires ou de la localisation de marqueurs d’intérêt spécifiques, les structures 3D de type BM peuvent être fixées et traitées avec l’incorporation de paraffine et l’immunochimie. Par exemple, l’analyse des contenus CD45 (hématologique) ou CD73 (MSC) a été réalisée à l’aide de ces modèles 3D (Figure 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64736/64736fig01.jpg"> Figure 1: Schéma de principe de la configuration initiale du système humain de type BM 3D. Après 3 semaines de co-culture, des tissus solides de type BM peuvent être collectés ou ensemencés avec des cellules hématopoïétiques (comme dans l’exemple) ou d’autres types de cellules. Si nécessaire, une fois que les cellules sont adhérentes, un traitement peut être ajouté et des changements moyens effectués deux fois par semaine. À la fin de l’expérience, les structures de type BM peuvent être soit fixées et traitées pour des études de localisation, soit dissociées pour évaluer le contenu cellulaire. Abréviations : BCP = phosphate de calcium biphasique; BM = moelle osseuse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64736/64736fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64736/64736fig02.jpg"> Figure 2 : Récupération de cellules viables de différents compartiments après culture dans le modèle 3D de type BM. (A) Modèle typique de récupération cellulaire à partir d’une structure dissociée de type BM avec 9,84% de cellules viables (DAPI-). Des tracés représentatifs de cellules hématopoïétiques (66,6 % de CD45+), de cellules CSM/ostéoblastes (88,6 % de cellules CD73+ dans la population CD45) et de cellules endothéliales (22,1 % de cellules CD31+ au sein de la population CD45) récupérées après dissociation 3D. (B) Le système 3D permet le maintien de cellules hématopoïétiques viables (CD45+) jusqu’à 6 semaines après la culture. (C) Les systèmes 3D constitués de CSM primaires issues du MNB ou de la LMA aux côtés de HMEC-1 (coloré avec Kusabira-Orange dans cet exemple) peuvent maintenir des CSH (cellules DAPI CD45+ à 3,88 %) in situ (D). Abréviations : BM = moelle osseuse; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; CSM = cellules souches mésenchymateuses; MNB = moelle osseuse normale; LAM = leucémie myéloïde aiguë; CSH = cellules souches hématopoïétiques; FSC = diffusion vers l’avant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64736/64736fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64736/64736fig03.jpg"> Figure 3 : Visualisation des interactions cellulaires et de la prolifération dans le modèle 3D de type BM. Les systèmes ont été collectés après 3 semaines de co-culture 3D avec HS27A et HMEC-1 et l’ajout de cellules hématopoïétiques après 1 semaine. La coloration immunohistochimique typique (visualisée en brun) par IHC a été visualisée à l’aide d’une peroxydase de raifort anti-lapin ou souris et visualisée avec la 3,3′-diaminobenzidine comme substrat chromogène et contre-colorée avec l’hématoxyline de Gill et montre la présence de cellules hématopoïétiques avec CD45 (panneau de gauche), de cellules stromales avec CD73 (panneau du milieu) ou de prolifération de toutes les cellules avec KI67 (panneau de droite). Barres d’échelle = 50 μm. Abréviations : BM = moelle osseuse; IHC = immunohistochimie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64736/64736fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ici, nous décrivons un système microphysiologique standardisé facile à mettre en œuvre qui reflète la complexité de la structure in vivo de la moelle osseuse humaine, fournissant un modèle pertinent pour étudier finement un large éventail d’événements normaux et pathologiques.

Un modèle 3D de moelle osseuse humaine pour étudier la dynamique et les interactions entre les cellules résidentes dans des contextes physiologiques ou tuboraux

The medullary niche is a complex ecosystem that is essential to maintain homeostasis for resident cells. Indeed, the bone marrow, which includes a complex ...

Cette technique permet le développement d’un système standardisé facile à mettre en place à partir de lignées cellulaires humaines ou de populations cellulaires primaires et fournit les caractéristiques d’une structure bien organisée, semblable à la moelle osseuse. Ce modèle permet à la post-fixation de récolte cellulaire de caractériser la localisation cellulaire in situ dans le système via l’imagerie, ou la dissociation de structure 3D pour collecter chaque composant cellulaire pour des études moléculaires ou fonctionnelles. La démonstration de la procédure sera assurée par Kevin Geistlich, un ingénieur adjoint de mon laboratoire.Peser de 35 à 40 milligrammes de billes de BCP dans un tube de 1,5 millilitre pour chaque insert. C’est-à-dire une petite antenne cylindrique en plastique avec une membrane en polycarbonate au fond. Percez un petit trou avec une aiguille propre à travers le haut du tube de 1,5 millilitre pour éviter que le couvercle ne s’ouvre pendant le cycle d’autoclave et placez les tubes en position verticale dans une boîte fermée et stérile.Placez des inserts de culture cellulaire en polycarbonate stérile dans les puits d’une plaque de six puits. Versez des billes de BCP stériles provenant d’un tube de 1,5 millilitre dans l’insert. Lavez soigneusement les billes en versant 350 microlitres de 1X PBS à l’intérieur de l’insert, puis ajoutez 4,5 millilitres de 1X PBS au puits.Jetez le PBS à l’aide d’un vide ou d’une pipette de cinq millilitres en plaçant la pointe dans un coin du puits. Répétez l’étape de lavage deux fois. Ensuite, utilisez 1X PBS complété par 10% FBS pour bloquer le système.Ajoutez soigneusement 350 microlitres de solution de blocage à l’insert et 4,5 millilitres au puits, puis placez la plaque entière dans un incubateur pendant la nuit. Retirez la solution de blocage du système. Mélanger 1 fois 10 aux 6 cellules HMEC-1 et 2 fois 10 aux 6 cellules HS27A, représentant respectivement les compartiments des cellules stromales vasculaires et mésenchymateuses, dans un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse pendant cinq minutes à 1 575 G à température ambiante.Jeter le surnageant et ajouter 175 microlitres de milieu HMEC-1, complétés par 175 microlitres d’ODM qui favoriseront la différenciation des cellules stromales mésenchymateuses en ostéoblastes. Versez 350 microlitres de la suspension cellulaire contenant 3 fois 10 à 6 cellules totales à l’intérieur de chaque insert. Ensuite, versez 4,5 millilitres du média combiné sans cellules dans les puits de la plaque.Aspirer doucement et distribuer le mélange plusieurs fois avec une micropipette d’un millilitre pour homogénéiser les cellules et les billes de PCA dans l’insert. Laisser le mélange entier se déposer au bas de l’insert. Une fois que les cellules endothéliales et mésenchymateuses sont homogénéisées à l’intérieur de l’insert, conservez la plaque à six puits à l’intérieur de l’incubateur pendant trois semaines.Changez le milieu à l’intérieur de l’insert dans le puits deux fois par semaine en retirant soigneusement le milieu à l’aide d’une micropipette d’un millilitre et en plaçant l’embout sur la paroi intérieure de l’insert pour éviter de déranger le coin de l’insert. Resuspendre les cellules hématologiques d’intérêt dans le milieu combiné HMEC-1 et RPMI et ajouter la suspension cellulaire à l’insert. D’autres types de cellules d’intérêt avec des médias dédiés peuvent être ajoutés à cette étape.Si un protocole de traitement médicamenteux est nécessaire, attendez 24 heures après l’ajout des cellules d’intérêt avant de les traiter, ce qui leur donne le temps d’adhérer à la structure osseuse. Actualisez le milieu avec 50 % de milieu complet HMEC-1 et 50 % de milieu complet RPMI deux fois par semaine. Après avoir changé le milieu de culture deux fois par semaine, conservez le surnageant récupéré de l’intérieur de l’insert à moins 80 degrés Celsius pour évaluer la production de protéines dans le système.Pour dissocier les cellules de la structure 3D, mélangez 4,5 millilitres de RPMI avec 0,5 millilitre de FBS, complété par 0,4 milligramme par millilitre de collagénase dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, réchauffez la solution à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Placez l’insert à l’envers sur un couvercle de plaque stérile à six puits pour découper correctement la membrane.Utilisez un scalpel stérile pour couper la membrane des côtés, récupérant ainsi un disque solide blanc. Placez le disque à l’intérieur du tube chaud de 15 millilitres contenant le mélange de solution préparé précédemment. Placez le tube dans une roue active dans un incubateur à 37 degrés Celsius et incuber pendant 10 minutes pour permettre la digestion.Appliquez le même temps d’incubation pour toutes les membranes afin d’éviter une analyse biaisée. Après l’incubation, centrifuger le tube de 15 millilitres pendant cinq minutes à 1 575 g à température ambiante. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans cinq millilitres de PBS chaud 1X.Remettez la pastille en suspension dans 300 microlitres de trypsine chaude et mélangez bien en pipetant pendant 10 secondes, puis placez-la dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius pendant une minute. Arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant un millilitre de FBS chaud et pur. Avec une micropipette d’un millilitre, aspirer mécaniquement et distribuer le milieu pour dissocier complètement le disque.Centrifuger le tube pendant cinq minutes à 1 575 G et remettre en suspension la pastille dans trois millilitres de 1X PBS complété par 10% FBS. Laissez les billes sédimenter pendant cinq secondes avant de recueillir le surnageant et de le filtrer à travers une crépine cellulaire de 35 microns placée sur un tube de collecte. Centrifuger le filtrat récupéré pendant cinq minutes à 1 575 G et compter les cellules avec du bleu de trypan pour évaluer la viabilité.Remettez les pastilles en suspension dans le mélange d’anticorps et incuber pendant 30 à 40 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière. Ajouter un millilitre de PBS complété par 2%FBS pour laver les cellules et centrifuger pendant cinq minutes à 1 575 G.To lancer l’analyse de cytométrie en flux, remettre en suspension la pastille récupérée dans 200 microlitres de PBS 1X avec 10%FBS, complété par DAPI dans une solution de 1 à 2000. Analyser les tubes dans un cytomètre en utilisant les paramètres décrits dans le manuscrit texte.Utilisez un graphique FSC-H versus FSC-W pour inclure la population singulet. Dans la fraction singulet, utilisez un graphique DAPI-A par rapport au FSC-A pour déterminer la population cellulaire viable. Avec la population DAPI négative précédemment contrôlée, utilisez un graphique APCA-A par rapport à FSC-A pour déterminer la population CD45-positive.Pour fixer la structure de type BM, transférez l’insert de l’ancienne plaque vers une nouvelle plaque à six puits remplie de 1X PBS. Ensuite, remplacez délicatement le support à l’intérieur de l’insert par 1X PBS. Une fois l’insert lavé, placez-le dans une nouvelle assiette à six puits et remplissez le puits et l’insert avec du paraformaldéhyde fraîchement ouvert.Laissez le processus de fixation se dérouler pendant quatre heures à température ambiante, à l’abri de la lumière. Ensuite, lavez l’insert une fois avec 1X PBS et rangez-le à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. Après l’exposition souhaitée, les résultats suggèrent qu’il était possible de maintenir les cellules hématologiques pendant au moins six semaines dans le modèle 3D avant de récupérer des cellules viables.Il a été possible de remplacer la lignée cellulaire HS27A par une CSM primaire normale de la moelle osseuse ou une CSM de leucémie myéloïde aiguë dans ce modèle 3D de type BM, ou de remplacer la lignée cellulaire hématopoïétique par des CSH primaires. L’incorporation de paraffine et l’immunochimie ont permis avec succès l’analyse des contenus CD45 et CD73 à l’aide des modèles 3D. Ce système 3D nécessite trois semaines de structures ressemblant à de la moelle osseuse et du temps supplémentaire avec les cellules d’intérêt.Et les conditions stériles doivent être maintenues car parfois, nous pouvons voir des contaminations moyennes avec les changements de milieu bihebdomadaires.

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