Cristallisation de protéines à haut débit par microdialyse

La cristallisation par dialyse est une méthode sous-utilisée. Ce protocole présente une approche Novo à cet égard, qui augmentera la gamme de stratégies de cristallisation actuellement disponibles pour la détermination structurée. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est à haut débit, simple à mettre en place sans équipement spécialisé requis, et permet un suivi facile de la croissance des cristaux.

La personne qui effectue cette technique doit être à l’aise avec le pipetage à faible volume et l’utilisation de pipettes multicanaux. Les gouttes doivent être pipetées aussi suffisamment que possible pour éviter une déshydratation partielle. Pour mettre en place l’expérience de microdialyse, placez une plaque de microdialyse de 96 puits disponible dans le commerce dans l’orientation vers le haut côté protéine et retirez le ruban adhésif en décollant l’espaceur adhésif sous pression de 200 microns.

Après avoir décollé le ruban adhésif du couvercle, notez la position du puits A1. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanal, chargez un maximum de 3,2 microlitres d’échantillon de protéines correctement préparé dans chaque puits. Positionnez correctement le film de couverture UV de 200 microns sur la plaque de 96 puits, le film étant orienté vers le haut. Ensuite, pour activer et sceller l’adhésif sous pression, appuyez sur le film de couverture UV à l’aide d’une palette d’étanchéité et vérifiez son intégrité.

Maintenant, inversez la plaque pour l’amener à l’orientation du côté tampon vers le haut et notez la position en miroir du puits marqué A1. À l’aide d’une pipette multicanaux, chargez un maximum de 350 microlitres de solution de dialyse dans chaque puits de la plaque et scellez soigneusement les puits avec le film de couvercle du réservoir. Ensuite, placez la plaque dans l’orientation tampon vers le haut à l’intérieur d’un incubateur approprié à température contrôlée à 20 degrés Celsius pour permettre la croissance des cristaux. Pour examiner la formation de cristaux au microscope, retirez le film de couverture protecteur du film de couverture UV de 200 microns et placez la plaque sous l’oculaire avec le côté protéique vers le haut.

Pour mettre en place une expérience de cristallisation à grande échelle, adoptez les conditions dans lesquelles la croissance des microcristaux s’est produite dans la plaque de microdialyse et reproduisez les mêmes conditions dans de grands récipients. Sélectionnez la taille du récipient en fonction du volume de la solution de dialyse. Pipeter un volume maximum de 500 microlitres d’échantillon de protéines dans le tube de dialyseur avant de sceller le tube à l’aide du bouchon en plastique rouge.

Placez le tube de dialyseur scellé de 500 microlitres dans le rack flottant à l’intérieur du récipient rempli de solution de dialyse. Ensuite, placez le récipient sans être dérangé dans un incubateur approprié à température contrôlée à 20 degrés Celsius pour obtenir une croissance cristalline. Pour vérifier la formation de cristaux, pipeter un à deux microlitres de la solution du dialyseur sur une lame de couvercle en verre.

Couvrez la solution sur la lame avec une autre lame de verre et visualisez-la au microscope. Les images capturées à l’aide d’un microscope stéréo à fort grossissement ont montré la formation réussie de quatre protéines par microcristaux à l’aide de plaques de microdialyse avec des membranes de coupure de poids moléculaire de 10 kilodaltons. Le lysozyme s’est avéré former des cristaux lorsqu’il est dialysé contre 0,1 molaire d’acétate de sodium à pH 4 contenant des additifs appropriés.

La domatine a formé des cristaux lorsqu’elle est dialysée contre 0,1 molaire de bis-tris propane à pH 6,6 contenant des additifs appropriés. Des conditions de dialyse optimisées ont conduit à la formation de microcristaux par les protéines membranaires, à savoir la protéine AcrB de la pompe à efflux multimédicament E. coli et le transporteur de lactose E. coli LacY. La cristallisation à grande échelle dans les tubes de dialyseur en utilisant les conditions de dialyse optimisées obtenues à partir des expériences de microdialyse a conduit à la formation de milliers de microcristaux pour chacune des protéines.

Pour la cristallisation de la fomitine, 250 microlitres de protéines ont été dialysés contre 50 millilitres de la solution de dialyse. Pour AcrB, 250 microlitres de la protéine ont été dialysés contre 25 microlitres de solution de dialyse. La cristallisation LacY a également été mise en place au même rapport, avec 100 microlitres de protéines pour 10 millilitres de solution de dialyse.

Lors de l’inversion de la plaque du côté tampon vers le haut, il est important de noter la position de A1, afin que les solutions de l’écran de cristallisation puissent être distribuées en conséquence. Les cristaux obtenus à partir de cette méthode peuvent être utilisés pour des applications en aval, telles que la cristallographie en série et la micro-ED.