Name: In vitro Étude des effets de la matrice extracellulaire riche en hyaluronanes sur la migration des cellules de la crête neurale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Découvrez un modèle in vitro pour étudier la migration des cellules de la crête neurale dans une matrice riche en acide hyaluronique. Cette méthode permet d'évaluer l'adhésion cellulaire et le criblage de médicaments.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J’exprime ma grande gratitude à Fumitoshi Irie et Yu Yamaguchi pour leurs encouragements et leurs aimables suggestions dans l’établissement de cette méthode. Ce travail a été soutenu par des subventions pour des programmes de recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science (#19KK0232 à T.I., #20H03896 à T.I.). La méthode originale pour le revêtement de l’AH sur des substrats de verre et les essais de dégradation in situ de l’AH sur les substrats ont été décrits dans Yamamoto et coll. (2017)8, tandis que la méthode de préparation de substrats mixtes HA/Col1 a été décrite dans Irie et coll. (2021)7.

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’École supérieure de médecine dentaire de l’Université d’Osaka.
1. Culture de cellules de crête neurale crânienne de souris
REMARQUE : La lignée cellulaire de crête neurale utilisée dans cette étude comprend des cellules O9-1, dérivées à l’origine de Wnt1-Cre; Cellules exprimant R26R-GFP isolées à partir d’embryons de souris E8.512 (voir discussion). La méthode décrite ici pour la culture de cellules O9-1 suit un protocole préalablement établi13.
<ol><li>Préparez la plaque revêtue de matrice de membrane basale.<ol><li>Décongeler la matrice de la membrane basale (voir le tableau des matériaux) sur la glace. Diluez la matrice 1:50 dans 1x PBS réfrigéré et gardez la glace.</li>
		<li>Enduire une plaque de culture de 10 cm de 10 mL de la solution diluée de matrice bas-membrane. Incuber la plaque à température ambiante pendant 1 h et aspirer la matrice avant utilisation.</li>
		<li>Lavez la plaque 3x avec 2 ml de PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Culture de cellules O9-1 sur la plaque recouverte de matrice membranaire basale.<ol><li>Réchauffer le milieu cellulaire embryonnaire complet (SE) (voir le tableau des matériaux) au bain-marie à 37 °C.</li>
		<li>Mélangez délicatement la suspension de cellules O9-1 (voir le tableau des matériaux) et comptez le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé (voir le tableau des matériaux). Ajuster la concentration cellulaire à 1,1 × 106/mL avec un milieu cellulaire ES complet.</li>
		<li>Ajouter 8 mL de milieu cellulaire ES complet préchauffé à la plaque de culture de 10 cm recouverte de matrice et ensemencer les cellules O9-1 à 1,1 x 106 cellules/plaque. Incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 .</li>
		<li>Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu de cellule ES complet frais (préchauffé à 37 °C). Remplacer par un milieu frais tous les 2-3 jours par la suite. REMARQUE: Lorsque les cellules sont confluentes à environ 80% (3-4 jours après le placage), elles peuvent être dissociées avec 0,25% de trypsine-EDTA et évacuées plus loin ou congelées pour une utilisation ultérieure. Des images représentatives des cellules O9-1 sont présentées à la figure 1.</li>
		<li>Laver la plaque de culture avec 2 ml de 1x PBS avant la trypsinisation. Ajouter 2 mL de trypsine-EDTA préchauffé à 0,25 % et incuber pendant 5 min à 37 °C. Vérifier s’il y a un détachement complet de la cellule; Tapotez doucement le côté de la plaque plusieurs fois si nécessaire.</li>
		<li>Ajouter 2 mL de milieu cellulaire ES complet préchauffé à la plaque de culture et transférer les cellules dissociées dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Jetez le surnageant sans déranger la pastille de cellule. Ensuite, ajoutez 2 mL de milieu cellulaire ES complet préchauffé dans le tube et remettez soigneusement les cellules en suspension par pipetage. Ensemencer les cellules sur une nouvelle plaque de culture à la densité cellulaire désirée.</li>
		<li>Vous pouvez également préparer un stock de cellules congelées en ajoutant 1 mL de milieu de congélation cellulaire contenant 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans le tube au lieu du milieu cellulaire ES complet et en remettant complètement les cellules en suspension. Transférer la suspension cellulaire dans des tubes cryogéniques et conserver à −80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparation du plat enrobé de HA/Col1
REMARQUE : La méthode originale d’enrobage de HA/Col1 sur des plats à fond de verre a été proposée par Irie et coll.7.
<ol><li>Ajouter délicatement 50 μL de triéthoxysilane non dilué à un plat à fond de verre de 3,5 cm (voir le tableau des matières). Incuber pendant 5 min à température ambiante (RT) et protéger de la lumière. NOTE: L’incubation avec le triéthoxysilane ne doit pas dépasser 5 min. Cela peut affecter l’efficacité du revêtement et produire des produits indésirables.</li>
	<li>Lavez le plat rapidement 3x avec 2 ml d’eau distillée. Ajouter 50 μL de glutaraldéhyde à 0,25 %, dilué 100x dans du PBS, par boîte, et incuber à TA pendant 30 min.</li>
	<li>Laver rapidement 4x avec 2 ml de PBS. Ensuite, enrobez les plats de 300 μL de collagène de type I dans de l’acide acétique 0,2 N à TA pendant 1 h.</li>
	<li>Laver rapidement 3x avec 2 mL de PBS. Ajouter 300 μL de hyaluronate de sodium H2 marqué à la fluorescéinamine (FAHA-H2) à 200 μg/mL (dilué dans du PBS) à chaque plat et incuber toute la nuit à TA. Laver à nouveau 3x avec 2 mL de PBS. Après avoir aspiré le PBS, sécher la plaque à l’air libre pendant 5 minutes sur un banc propre. REMARQUE: FAHA-H2 est un hyaluronate de sodium marqué à la fluorescéinamine avec un poids moléculaire moyen allant de 1 200 à 1 600 KDa. HA d’un poids moléculaire approprié peut être utilisé selon le plan de recherche.</li>
</ol>3. Essai de migration sur la capsule enrobée de HA/Col1
REMARQUE : Un essai basé sur la fermeture de la plaie utilisant des espaces sans cellules définis de 500 μm dans des substrats Col1/HA a été effectué à l’aide d’inserts de culture à 2 puits (voir le tableau des matériaux). Les cellules O9-1 expriment Tmem2, nécessaire à l’adhésion et à la dégradation de l’HA dans l’espace extracellulaire9 (Figure 2 et Figure 3).
<ol><li>Après avoir séché le plat à fond de verre enrobé, fixez les inserts de culture à 2 puits aux plats et remplissez les inserts à l’extérieur avec 1 ml de PBS.</li>
	<li>Ensemencer les cellules O9-1 dans les puits à raison de 1 x 104 cellules dans 100 μL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 2 % de sérum fœtal bovin (FBS) par insert. Culture des cellules pendant 2 jours à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 .</li>
	<li>Retirez soigneusement les inserts de la vaisselle à fond de verre enduite avec une pince à épiler. Lavez doucement la vaisselle à fond de verre enduit de 2 ml de 1x PBS pour enlever les cellules et les débris cellulaires. Ajouter 2 ml de DMEM frais contenant 2% de FBS dans les plats de culture.</li>
	<li>Capturez des images à contraste de phase dès maintenant comme point de départ à l’aide d’un microscope à fluorescence tout-en-un en mode monochrome avec des réglages haute résolution (gain à 6 dB, pas de rangement). Des lentilles objectives avec des grossissements de 4x à 20x ont été utilisées pour l’imagerie dans cette étude (voir le tableau des matériaux). REMARQUE: Capturez les images à contraste de phase avec les barres d’échelle correspondantes et enregistrez-les au format TIFF.</li>
	<li>Culture des cellules pendant 48 heures supplémentaires à 37 °C et 5 % de CO2. Capturez des images à contraste de phase à 24 h et 48 h en culture à l’aide du microscope à fluorescence tout-en-un.</li>
	<li>Fixer les cellules à 48 h avec 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 15 min à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C. Ensuite, lavez la vaisselle 3x pendant 5 minutes chacune avec 1 ml de PBS frais.</li>
	<li>Placer une lamelle de couverture avec un support de montage (voir le tableau des matériaux) pour une observation morphologique plus approfondie. REMARQUE: Les plats peuvent être imagés immédiatement ou conservés jusqu’à 2 mois à 4 ° C.</li>
	<li>Facultatif : Immunomarquer les cellules pour les protéines d’intérêt. REMARQUE : Un protocole de détection du complexe d’adhésion focale (AF) à l’aide d’un anticorps monoclonal antivinculine dérivé de souris (voir le tableau des matériaux) est décrit ici à titre d’exemple.<ol><li>Incuber les plats (à partir de l’étape 3.6) avec 0,5 mL de tampon bloquant (5% de sérum de chèvre normal dans PBS) pendant 60 min. REMARQUE: Choisissez un tampon de blocage approprié pour l’anticorps primaire. Un tampon bloquant typique serait 5% de sérum normal de la même espèce que l’anticorps secondaire utilisé.</li>
		<li>Préparer l’anticorps primaire dilué dans un tampon de dilution d’anticorps (1% de sérum de chèvre normal dans PBS). Incuber les plats avec 0,5 mL d’anticorps primaire dilué pendant une nuit à 4 °C. REMARQUE: Choisissez le tampon de dilution d’anticorps approprié. En règle générale, l’anticorps est utilisé à une dilution de 1:50-1:200.</li>
		<li>Rincer 3x pendant 5 min chacun avec 2 mL de PBS. Préparer l’anticorps secondaire anti-souris dérivé de chèvre dilué dans le tampon de dilution des anticorps (sérum de chèvre normal à 1% dans PBS). Incuber les boîtes avec 0,5 mL d’anticorps secondaire dilué pendant 1 à 3 h à température ambiante. REMARQUE: En règle générale, l’anticorps secondaire est utilisé à une dilution de 1:500-1:1 000. DAPI peut être utilisé pour colorer les noyaux.</li>
		<li>Rincer 3x avec 2 mL de PBS pendant 5 min à chaque fois. Placez le couvercle avec 50 μL de support de montage. REMARQUE: Les antennes peuvent être imagées à l’aide du microscope à fluorescence tout-en-un avec un filtre GFP (excitation: 470/40, émission: 525/50) et un filtre TexasRed (excitation: 560/40, émission: 630/75) en mode monochrome avec des réglages haute résolution (gain à 6 dB, pas de rangement). Des lentilles objectives avec des grossissements de 4x à 20x ont été utilisées pour l’imagerie dans cette étude. REMARQUE: La lame peut être conservée jusqu’à 2 mois à 4 ° C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analyse des données
<ol><li>Ouvrez le logiciel ImageJ 1.51s. Dans la fenêtre ImageJ, sélectionnez Fichier > Ouvrir dans la barre de menus pour ouvrir le fichier image enregistré.</li>
	<li>Pour définir l’échelle de mesure, tracez une ligne de la même distance que la barre d’échelle. Accédez à Analyser > Définir l’échelle et saisissez la distance et les unités connues de la ligne dans les zones appropriées de la fenêtre Définir l’échelle .</li>
	<li>Tracez une ligne droite entre l’espace de cellule et appuyez sur Analyser > Mesure pour transférer les valeurs dans une fenêtre de données. Mesurer au moins cinq positions différentes dans chaque échantillon et faire la moyenne des distances pour obtenir les données représentatives de l’échantillon. Effectuer les analyses statistiques à l’aide d’un logiciel approprié (voir le tableau des matières).</li>
</ol>

<ol><li>Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+switches+in+mammalian+neural+crest+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326(2013).</li>
<li>Casini, P., Nardi, I., Ori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+is+required+for+cranial+neural+crest+cells+migration+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development.</a> Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).</li>
<li>Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versican+is+selectively+expressed+in+embryonic+tissues+that+act+as+barriers+to+neural+crest+cell+migration+and+axon+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth.</a> Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).</li>
<li>Camenisch, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+hyaluronan+synthase-2+abrogates+normal+cardiac+morphogenesis+and+hyaluronan-mediated+transformation+of+epithelium+to+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).</li>
<li>Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-valve+mesenchyme+formation+is+dependent+on+hyaluronan-augmented+activation+of+ErbB2-ErbB3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors.</a> Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).</li>
<li>Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+hyaluronan+synthase-2+in+craniofacial+and+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development.</a> Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).</li>
<li>Irie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+surface+hyaluronidase+TMEM2+regulates+cell+adhesion+and+migration+via+degradation+of+hyaluronan+at+focal+adhesion+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100481(2021).</li>
<li>Yamamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+homolog+of+the+zebrafish+transmembrane+protein+2+%28TMEM2%29+is+the+long-sought-after+cell-surface+hyaluronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).</li>
<li>Inubushi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+surface+hyaluronidase+TMEM2+plays+an+essential+role+in+mouse+neural+crest+cell+development+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival.</a> PLoS Genetics. 18 (7), 1009765(2022).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51046(2014).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).</li>
<li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li>
<li>Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+manipulation+of+O9-1+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Humphries, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinculin+controls+focal+adhesion+formation+by+direct+interactions+with+talin+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin.</a> Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).</li>
<li>Perris, R., Perissinotto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+extracellular+matrix+during+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration.</a> Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).</li>
<li>Perris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+changes+in+the+distribution+of+proteoglycans+during+avian+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development.</a> Development. 111 (2), 583-599 (1991).</li>
<li>Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decorin+developmental+expression+and+function+in+the+early+avian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decorin developmental expression and function in the early avian embryo.</a> The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).</li>
<li>Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+avian+neural+crest+cell+migration+on+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin.</a> Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).</li>
<li>Chevalier, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+tissue+mechanical+properties+affect+enteric+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration.</a> Scientific Reports. 6, 20927(2016).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+and+Migration%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
<li>Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+methods+for+cell-cycle+synchronization+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells.</a> Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).</li>
<li>Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+T+lymphocyte+adhesion+receptor+for+an+alternative+cell+attachment+domain+%28CS-1%29+in+plasma+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin.</a> Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).</li>
<li>Robert, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+3-aminopropyltriethoxysilane+layers+formed+on+silanol-terminated+silicon+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces.</a> The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).</li>
</ol>

L’auteur déclare qu’il n’existe pas d’intérêts concurrents.

Diverses composantes de l’ECM régissent l’émigration et la migration des CCN. Par exemple, HA réglemente positivement la migration NCC 2,15. Fait intéressant, une étude basée sur des modèles génétiques murins de Tmem2, une hyaluronidase de surface cellulaire, a élucidé la nécessité de la dégradation de l’HA dans la migration NCC9. Les collagènes sont également abondants dans l’ECM entourant le tube neural16. Il a ét...

Les cellules de la crête neurale (CCN) sont une population cellulaire multipotente présente dans les embryons en développement, et elles proviennent de la bordure de la plaque neurale pendant la neurulation. Ils contribuent à la formation d’une variété de tissus, y compris le système nerveux périphérique, le système cardiovasculaire, les tissus craniofaciaux et le squelette1. Après induction et spécification NCC à la frontière de la plaque neurale, les NCC émigrent du neuroépithélium et migrent vers les sites tissulaires dérivés de NCC1.
L’hyaluronane (HA) est un glycosaminoglycane non sulfaté qui est distribué dans une variété de tissus en tant que composant de la matrice extracellulaire (ECM). L’importance de l’AH dans le développement de l’embryon a été démontrée dans des systèmes modèles par l’ablation des gènes responsables du métabolisme de l’hyaluronane. Par exemple, des mutations dans les gènes de la hyaluronane synthase (Has1 et Has2) chez Xenopus se sont avérées entraîner des défauts de migration NCC et une malformation craniofaciale2. De plus, il a été rapporté que les protéoglycanes se liant à l’HA, aggrécan et versican, exercent des effets inhibiteurs sur la migration NCC3. Chez la souris, l’ablation Has2 entraîne de graves défauts dans la formation du coussin endocardique, entraînant une létalité 4,5,6 en milieu de gestation (E9.5-10).
Il a récemment été démontré que la protéine transmembranaire 2 (Tmem2), une hyaluronidase de surface cellulaire, joue un rôle essentiel dans la promotion de l’adhésion et de la migration des cellules cancéreuses médiées par l’intégrine en éliminant l’AH associée à la matrice aux sites d’adhésion 7,8. Plus récemment, Inubushi et coll.9 ont démontré qu’une déficience en Tmem2 entraîne de graves anomalies craniofaciales dues à des anomalies de l’émigration/migration et de la survie des CCN. Dans l’étude précédente9, l’expression de Tmem2 a été analysée pendant la formation et la migration de NCC. L’expression de Tmem2 a été observée sur le site de délaminage des NCC et chez les NCC positifs pour Sox9 en émigration (Figure 1). De plus, en utilisant des cellules de crête neurale de souris O9-1 appauvries en Tmem2, l’étude a démontré que l’expression in vitro de Tmem2 était essentielle pour que les cellules O9-1 forment des adhérences focales et pour leur migration dans des substrats contenant de l’HA (Figure 2 et Figure 3)9.
Ces résultats indiquent fortement que Tmem2 est également important pour l’adhésion et la migration des CCN par l’intermédiaire de l’ECM riche en HA. Cependant, le mécanisme moléculaire de l’adhésion et de la migration des NCC au sein de l’ECM riche en HA n’est toujours pas clair. Il est donc nécessaire d’établir un système expérimental de culture in vitro pour explorer pleinement l’adhésion et la migration des NCC au sein de la MCE riche en HA.
Parmi les nombreuses approches utilisées pour tester la migration cellulaire, le test basé sur la fermeture des plaies cellulaires est une méthode simple fréquemment utilisée dans les domaines de la physiologie et de l’oncologie10. Cette approche est utile en raison de sa pertinence pour le phénotype in vivo et est efficace pour déterminer les rôles des médicaments et des chimioattractants au cours de la migration cellulaire11. Il est possible d’évaluer la capacité de migration des masses cellulaires entières et des cellules individuelles en mesurant les distances d’écart cellulaire au fil du temps11. Dans ce manuscrit, un essai modifié in vitro basé sur la fermeture des plaies est introduit pour modéliser la migration NCC dans les tissus riches en HA entourant le tube neural. Cette procédure est également applicable à l’étude de différents composants de la MCE (collagène, fibronectine et laminine) afin d’analyser le rôle de l’échafaudage de la MCE dans la migration des CCN.

<table><tbody><tr><td>Plat de culture cellulaire de 10 cm</td><td>CORNING</td><td>Cat. 353003</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Millipore</td><td>Cat. Non. BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>Inserts de culture à 2 puits</td><td>ibidi</td><td>Cat. N° 80209</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. A21422</td> Compteur automatisé de cellules <td>anti-souris dérivé de la chèvre</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>Cat. Non. TC20</td><td></td></tr><tr><td>CELLBANKER</td><td>ZENOGEN PHARMA</td><td>Cat. 11910</td><td>Milieu de congélation cellulaire</td></tr><tr><td>collagène type I</td><td>Sigma</td><td>Cat. N° 08-115</td><td></td></tr><tr><td>Cellule complète ES Medium</td><td>Millipore</td><td>Cat. Non. ES-101-B</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. 10184322</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modifié&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>Cat. 11971025</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>Cat. 10270106</td><td></td></tr><tr><td>microscope à fluorescence</td><td>Keyence</td><td>Cat. Non. BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresent marqué HA</td><td>PG Research</td><td>FAHA-H2</td><td></td></tr><tr><td>Plat à fond en verre</td><td>Iwaki</td><td>Cat. 11-0602</td><td></td></tr><tr><td>glutaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>Cat. N° G5882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher</td><td>Cat. Non. CB-40234</td><td>L’anticorps</td></tr><tr><td>monoclonal anti-vinculine</td><td>Sigma</td><td>Cat. Non. V9264</td><td></td></tr><tr><td>support de montage</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Fisher</td><td>Cat. 50062Z</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 cellules</td><td>Millipore</td><td>Cat. Non. SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>Cat. 158127</td><td></td></tr><tr><td>triéthoxysilane</td><td>Sigma</td><td>Cat. N° 390143</td><td></td></tr><tr><td>trypsine-EDTA</td><td>Millipore</td><td>Cat. Non. SM-2003-C</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro Étude des effets de la matrice extracellulaire riche en hyaluronanes sur la migration des cellules de la crête neurale

In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration

Les cellules de la crête neurale (CCN) sont des cellules hautement migratrices qui proviennent de la région dorsale du tube neural. L’émigration des NCC du tube neural est un processus essentiel pour la production de NCC et leur migration ultérieure vers les sites cibles. La voie migratoire des NCC, y compris les tissus environnants du tube neural, implique une matrice extracellulaire riche en hyaluronane (HA). Pour modéliser la migration des NCC dans ces tissus environnants riches en HA à partir du tube neural, un test de migration de substrat mixte composé d’HA (poids moléculaire moyen: 1 200-1 400 kDa) et de collagène de type I (Col1) a été établi dans cette étude. Ce test de migration démontre que les cellules de la lignée cellulaire NCC, O9-1, sont hautement migratrices sur le substrat mixte et que le revêtement HA est dégradé au site des adhérences focales au cours de la migration. Ce modèle in vitro peut être utile pour explorer davantage la base mécaniste impliquée dans la migration des CCN. Ce protocole est également applicable à l’évaluation de différents substrats comme échafaudages pour étudier la migration NCC.

Un essai de migration a été réalisé sur des substrats mixtes composés de Col1 et de HA de haut poids moléculaire (poids moléculaire moyen : 1 200-1 400 kDa) en utilisant le protocole décrit ici. On a constaté que les cellules O9-1 à la limite de l’écart migraient facilement dans l’espace riche en HA (figure 4). L’immunomarquage d’un marqueur de l’AF, la vinculine14, a confirmé que les cellules O9-1 formaient des adhérences focales (AF) aux sites de dégradation de l’AH...

Ce protocole décrit une expérience de migration in vitro adaptée à l’analyse fonctionnelle des molécules impliquées dans la migration in vivo des cellules de la crête neurale dans la matrice extracellulaire riche en hyaluronane.

In vitro Étude des effets de la matrice extracellulaire riche en hyaluronanes sur la migration des cellules de la crête neurale

Neural crest cells (NCCs) are highly migratory cells that originate from the dorsal region of the neural tube. The emigration of NCCs from the neural tube ...

L’acide hyaluronique est l’une des matrices extracellulaires les plus abondantes dans le modèle animal. L’importance de l’acide hyaluronique dans le développement embryonnaire a été démontrée. Ce modèle in vitro est utile pour explorer comment les cellules de la crête neurale adhèrent et migrent dans la matrice extracellulaire riche en acide hyaluronique.Grâce à notre technique, nous pouvons évaluer la migration et la capacité de dégradation de l’AH de la population en gros, puis des cellules individuelles au fil du temps. En outre, cette technique peut être utilisée pour le dépistage de médicaments afin de trouver des composés qui accélèrent ou empêchent la dégradation de l’HA. Pour commencer, diluez la matrice membranaire basale avec du PBS réfrigéré dans un rapport de 1:50 et conservez-la sur la glace.Enduisez une plaque de culture de 10 centimètres avec 10 millilitres de la solution matricielle diluée et incuber la plaque à température ambiante pendant une heure. Lavez la plaque trois fois avec deux millilitres de PBS. Pour mettre en culture, les cellules O9-1 sur la plaque recouverte de matrice réchauffent la souche embryonnaire complète ou le milieu cellulaire ES dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.Mélangez délicatement la suspension de cellules O9-1 et comptez le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Ajustez ensuite la concentration cellulaire à 1,1 million de cellules par millilitre avec le milieu cellulaire ES complet. Ajouter huit millilitres de milieu cellulaire ES complet préchauffé à la plaque de culture de 10 centimètres recouverte de matrice et ensemencer les cellules O9-1 à 1,1 million de cellules par plaque.Incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu de cellule ES complet frais préchauffé à 37 degrés Celsius. Remplacer par du milieu frais tous les deux ou trois jours par la suite.Lavez la plaque de culture avec deux millilitres de PBS, puis ajoutez deux millilitres de trypsine-EDTA 0,25% préchauffé. Incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter deux millilitres de milieu cellulaire ES complet préchauffé à la plaque de culture et transférer les cellules dissociées dans un tube conique de 15 millilitres.Centrifuger le tube à 300g pendant cinq minutes et jeter le surnageant sans perturber la pastille de cellule. Ajouter deux millilitres de milieu cellulaire ES complet préchauffé dans le tube et remettre soigneusement les cellules en suspension par pipetage. Ensuite, ensemencez les cellules sur une nouvelle plaque de culture à la densité cellulaire souhaitée.Ajouter soigneusement 50 microlitres de triéthoxysilane non dilué à un plat en verre de 3,5 centimètres et incuber pendant cinq minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Lavez le plat trois fois avec deux millilitres d’eau distillée et ajoutez 50 microlitres de glutaraldéhyde à 0,25% dilué 100 fois dans du PBS par boîte. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes puis laver quatre fois avec deux millilitres de PBS et enduire la vaisselle de 300 microlitres de collagène de type un dans 0,2 acide acétique normal à température ambiante pendant une heure.Encore une fois, lavez trois fois avec deux millilitres de PBS. Ajouter 300 microlitres de 200 microgrammes par millilitre de fluorescéinamine, marqué hyaluronate de sodium H2 à chaque plat et incuber pendant une nuit à température ambiante. Lavez à nouveau avec deux millilitres de PBS trois fois.Après avoir séché le plat de fond en verre enduit, fixez les deux inserts de culture de puits à la vaisselle et remplissez les inserts à l’extérieur avec un millilitre de PBS. Ensemencer les cellules O9-1 dans les puits à 10 000 cellules dans 100 microlitres de DMEM contenant 2% de sérum bovin fœtal ou FBS par insert. Culture des cellules pendant deux jours à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone, capturez des images à contraste de phase comme point de départ, à l’aide d’un microscope à fluorescence tout-en-un.Retirez soigneusement les inserts de la vaisselle à fond en verre enduit avec une pince à épiler et lavez doucement les boîtes de fond en verre enduites avec deux millilitres de PBS pour éliminer les cellules et les débris cellulaires. Ajouter deux millilitres de DMEM frais contenant 2% de FBS dans les plats cultivés. Cultivez les cellules pendant 48 heures supplémentaires à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone et capturez des images à contraste de phase après 24 heures et 48 heures en culture.Lavez la vaisselle avec du PBS et fixez les cellules après 48 heures avec un millilitre de paraformaldéhyde à 4% pendant 15 minutes à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez la vaisselle trois fois pendant cinq minutes chacune avec un millilitre de PBS frais. Enfin, placez un couvercle avec le support de montage pour une observation morphologique plus approfondie.Les coupes transversales du tube neural des embryons du drapeau Tmem2 à E9.0 sont montrées dans cette figure. Les sections au niveau crânien et tronc du tube neural ont été marquées deux fois pour la protéine drapeau Tmem2 et l’hyaluronane. L’expression de Tmem2 a été observée dans la plaque neurale et la région frontalière du tube neural alors que ces sites étaient dépourvus de coloration hyaluronane.Le double marquage des cellules de la crête neurale pour le drapeau Tmem2 et Sox9 est montré ici. Les sections transversales du tube neural E9.0 ont été colorées pour le drapeau Tmem2 et Sox9. Les images représentatives de cellules O9-1 appauvries en Tmem2 et témoins cultivées sur une boîte de culture régulière sont présentées dans cette figure.L’expression de Tmem2 dans ces cellules a été évaluée par qPCR avec GAPDH comme contrôle interne pour la normalisation. Les cellules O9-1 appauvries en Tmem2 et témoins ont été cultivées pendant 48 heures sur des lamelles de verre recouvertes d’hyaluronan fluorescéniné. L’activité dégradante de l’hyaluronane se révèle sous forme de zones sombres dans le fond fluorescent.Le niveau de dégradation de l’hyaluronane a également été comparé quantitativement entre les cellules appauvries en Tmem2 et les cellules témoins O9-1. La dégradation de l’hyaluronane lié au substrat aux adhérences focales dans les cellules O9-1 est illustrée dans cette figure. Les cellules O9-1 cultivées sur des substrats mixtes constitués de Col1/HA ont été immunomarquées avec un anticorps anti-vinculine.Les taches ou stries sombres représentent l’activité de dégradation de l’hyaluronane dans le substrat FAHA H2. Les sites de dégradation de l’hyaluronane et les adhérences focales ont été co-localisés sur les substrats mixtes. Le revêtement Coval des plats à fond de verre avec de l’AH est une étape critique du protocole, car un revêtement inadéquat peut entraîner l’élimination facile de l’AH par force mécanique pendant l’adhérence et la migration.Pour assurer un revêtement approprié, nous utilisons du glutaraldéhyde, du collagène de type un immobilisé chimiquement au verre via un couplage d’armement à l’aldéhyde. Il est possible d’utiliser un substrat de matrice extracellulaire à côté du collagène de type un, mais ils doivent avoir des groupes d’armement et il peut y avoir des limitations dans leur revêtement de coval sur des plats à fond de verre en raison de leurs propriétés chimiques. Des essais et des erreurs peuvent donc être nécessaires pour déterminer la meilleure approche.Cette expérience de laboratoire peut être utile pour étudier le fonctionnement de certaines molécules pendant le mouvement des cellules de la crête neurale dans l’environnement HA ou HA autour du tube neural. Cela pourrait également être un moyen utile de tester un médicament qui pourrait accélérer ou empêcher ce processus de migration. Il est intéressant de savoir pourquoi Tmem2 a à la fois les fonctions d’adhérence sur HA et de dégradation de HA et pourquoi HA doit être dégradé sur le site de cohésion complète.Puisque l’AH est la substance la plus courante dans la matrice extracellulaire, trouver la réponse à cette question est vraiment important en biologie et en médecine. Ce protocole expérimental est précieux car il peut être appliqué à divers types de cellules, y compris les fibroblastes cutanés, les cellules épithéliales et les cellules cancéreuses.

in-vitro-investigation-effects-hyaluronan-rich-extracellular-matrix

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous démontrons que la surexpression du facteur de croissance épidermique récepteurs (EGFR) améliore la motilité des cellules souches neurales (NSC) en utilisant un roman sur gel d'agarose dispositif basé microfluidique. Cette technologie peut être facilement adaptable à d'autres systèmes cellulaires de mammifères où les sources de cellules sont rares, telles que des cellules souches neurales, et le tour autour du temps est critique.

Évaluer la motilité Neural Stem Cell utilisant un gel d&#39;agarose à base dispositif microfluidique

Imagerie laps de temps de culture de tissu en 3D permet d'étudier le comportement migratoire des cellules individuelles en provenance éminence ganglionnaire en réaction à extraire la protéine fractionnée à partir du cortex cérébral.

Comportement migratoire des cellules générées dans les cultures éminence ganglionnaire

Une approche pour analyser la migration de cellules issues d'explants (cellules de la crête neurale trunkale) est décrite. Cette méthode est peu coûteuse, douce et capable de distinguer la chimiotaxie à la fois de la chimokinèse et des autres influences sur la polarité migratoire, telles que celles provenant des interactions entre cellules au sein de la culture primaire de cellules de la crête neurale trunkale.

Analyse de la migration cellulaire Tronc Crête neurale en utilisant une modification Zigmond Chambre Assay

Le mésenchyme crânienne subit des mouvements morphogénétiques dramatiques qui fournit sans doute une force motrice pour l'élévation des plis...

Un test pour évaluer le comportement des explants cellulaires du mésenchyme crânienne

Ce protocole décrit comment disséquer la crête neurale crânienne prémigratoire (NC) de Xenopus laevis neurulas. Ces explants peuvent être étalées sur la fibronectine et cultivées in vitro, ou greffés retour dans des embryons hôtes. Cette technique permet d'étudier les mécanismes de la NC transition épithélium-à-mésenchyme, la migration et la différenciation.

Dissection de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crête neurale pour<em&gt; In vitro</em&gt; Culture explantation ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

Les propriétés mécaniques et la microstructure de la matrice extracellulaire affectent fortement la migration de cellules 3D. Une méthode in vitro pour étudier le comportement de migration cellulaire spatio-temporelle dans des environnements biophysique variables, à des niveaux de cellules individuelles à la fois la population et, est décrit.

Système de Gel concentrique à étudier le rôle biophysique de Matrix microenvironnement sur 3D migration cellulaire

La transition épithéliale à mésenchymateuse (EMT) permet aux cancers de devenir invasifs. Pour étudier l’EMT, un modèle in vitro basé sur des cellules souches neurales (NSC) dépourvu de sérum et d’enzymes est décrit. Ce système standardisé permet une évaluation quantitative et qualitative de la migration cellulaire, de l’expression des gènes et des protéines. Le modèle est adapté à la découverte de médicaments.

Un modèle Enzyme et sans sérum Neural Culture de cellules souches pour EMT enquête Adaptés pour la découverte de médicaments

Ici, nous fournissons une méthode fiable et peu coûteuse pour générer organotypiques électroporation cerveau d’embryons de souris appropriés pour la microscopie confocale et techniques d’imagerie en direct.

Ex Utero Électroporation et culture organotypique tranche de cerveaux de souris embryonnaires pour vivre-imagerie de la migration des interneurones GABAergiques

Ce protocole décrit la dissection et la culture des cellules de crête neurale crânienne des modèles de souris, principalement pour l'étude de la migration cellulaire. Nous décrivons les techniques d'imagerie en direct utilisées et l'analyse des changements de vitesse et de forme cellulaire.

Dissection, culture et analyse des cellules neurales primaires de crête neurale de la souris pour l'étude de la délamination et de la migration neurales de cellules de crête

Ce protocole polyvalent décrit l’isolement des cellules de la crête neurale prémigratoire (CCN) par l’excision des plis neuraux crâniens des embryons de poussins. Lors du placage et de l’incubation, les NCC migrateurs émergent des explants de plis neuraux, ce qui permet d’évaluer la morphologie et la migration des cellules dans un environnement 2D simplifié.

Préparation et analyse morphologique de cultures de cellules de crête neurale crânienne de poussin

Découvrez un modèle in vitro pour étudier la migration des cellules de la crête neurale dans une matrice riche en acide hyaluronique. Cette méthode permet d'évaluer l'adhésion cellulaire et le criblage de médicaments.

In vitro Étude des effets de la matrice extracellulaire riche en hyaluronanes sur la migration des cellules de la crête neurale

Explorer plus de vidéos