Name: Manipulation CRISPR ciblée placentaire in vivo chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Découvrez la manipulation CRISPR ciblée du placenta chez la souris par injection et électroporation à E12.5. Cette méthode permet d'étudier les fonctions géniques spécifiques pendant la grossesse.

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Les auteurs reconnaissent les sources de financement suivantes : R01 MH122435, NIH T32GM008629 et NIH T32GM145441. Les auteurs remercient les laboratoires du Dr Val Sheffield et du Dr Calvin Carter à l’Université de l’Iowa pour l’utilisation de leur salle d’opération et de leur équipement, ainsi que le Dr Eric Van Otterloo, le Dr Nandakumar Narayanan et le Dr Matthew Weber pour leur aide en microscopie. Les auteurs remercient également la Dre Sara Maurer, Maya Evans et Sreelekha Kundu pour leur aide dans les chirurgies pilotes.

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux règlements fédéraux et à la politique de l’Université de l’Iowa et ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux.
1. Animaux et élevage
<ol><li>Gardez les animaux dans un cycle de lumière du jour de 12 h avec de la nourriture et de l’eau ad libitum.</li>
	<li>Utilisez des souris femelles CD-1 âgées de 8 à 15 semaines. Utilisez la présence d’un bouchon copulatoire pour identifier E0.5.</li>
	<li>Sur E0.5, logez seules les mères enceintes.</li>
</ol>2. Étalonnage de la micropipette
REMARQUE: L’étalonnage de la micropipette doit être effectué avant la chirurgie lorsque cela est possible.
<ol><li>Avant de fabriquer et d’étalonner la micropipette, diluer tous les plasmides à la concentration recommandée (0,1 μg/μL) dans de l’eau sans DNase. Mélanger le plasmide avec un colorant vert rapide dilué de manière appropriée (1 μg/μL dans du PBS) (concentration plasmidique finale : 0,06 μg/μL).</li>
	<li>Tirer des micropipettes à l’aide de capillaires en verre de 10 cm d’un diamètre extérieur de 1,5 mm et d’un diamètre intérieur de 0,86 mm avec un extracteur de micropipettes.</li>
	<li>Casser délicatement l’extrémité d’une micropipette (2-3 mm) avec une pince stérile.</li>
	<li>Chargez la micropipette dans une pointe microcapillaire fixée à un microinjecteur. Assurez-vous que le micro-injecteur est fixé à la machine de micro-injection et qu’il y a suffisamment d’azote pour étalonner la micropipette.</li>
	<li>Une fois la micropipette fixée au micro-injecteur, chargez-la avec la solution de colorant Fast Green pour effectuer l’étalonnage (1 μg/μL dans PBS). Calibrer la micropipette pour injecter un volume d’environ 3,5 μL. Vider (« nettoyer ») la micropipette en vue du chargement des solutions plasmidiques comme ci-dessous. REMARQUE: Chaque micropipette sera légèrement différente. Pour éviter d’endommager le placenta pendant l’injection, le temps d’injection doit être réglé entre 0,5 et 1,5 s. La pression doit être réglée entre 1-8,5 psi. Calibrer chaque micropipette séparément; Si la micropipette ne peut pas être étalonnée dans ces paramètres, elle ne doit pas être utilisée.</li>
</ol>3. Chirurgie (figure 1A)
REMARQUE: Pour préparer, nettoyez les surfaces de la préparation et des zones chirurgicales avec de l’éthanol à 70%. Placez un sous-tampon absorbant dans la zone de préparation. Dans la zone de chirurgie, placez un coussin chauffant, puis placez un sous-coussin absorbant par-dessus. Stérilisez tous les outils avant la chirurgie. Le temps que la mère est sous anesthésie devrait être inférieure à 1 h.
<ol><li>Anesthésiation<ol><li>Administrer 5 mg/kg d’AINS (méloxicam) ou un autre analgésique approuvé à la mère enceinte 30 min à 1 h avant la chirurgie.</li>
		<li>Placez la mère enceinte dans une chambre à induction fixée à un vaporisateur d’isoflurane.</li>
		<li>Réglez le vaporisateur à 4% d’isoflurane et 3,5 L/min d’oxygène.</li>
		<li>Une fois que l’anesthésie a été confirmée par l’absence de réponse à un pincement de l’orteil et une réduction du rythme respiratoire, retirez la digue de la chambre d’induction à la zone de préparation.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation à la chirurgie<ol><li>Dans la zone de préparation, placez la mère en décubitus dorsal avec un cône nasal.</li>
		<li>Réduire le vaporisateur à 2 % d’isoflurane et 3,5 L/min d’oxygène pendant que le barrage est dans le cône de nez.</li>
		<li>Rasez soigneusement l’abdomen de la digue et enlevez l’excès de fourrure. Alterner l’abdomen rasé avec une solution de povidone et de l’éthanol à 70% trois fois à l’aide d’applicateurs stériles à embout de coton. Appliquer la couche finale de la solution de povidone. Pour éviter le dessèchement de la cornée, placez du gel lacrymal artificiel sur les deux yeux de la digue (Figure 2A, B).</li>
		<li>Après la préparation, déplacez la digue avec le cône nasal vers la zone de chirurgie désignée.</li>
	</ol></li>
	<li>Laparotomie utérine REMARQUE: Utilisez des gants stériles tout au long de l’intervention chirurgicale. Changez les gants si une surface non stérile est en contact.<ol><li>Dans la zone de chirurgie, placez le barrage en décubitus dorsal et fixez le cône nasal en place avec du ruban adhésif. Placez le coussin chauffant sous le tampon absorbant à 45 °C.</li>
		<li>À l’aide d’une pince et de ciseaux, faites une incision médiane d’environ 2 cm à travers la peau. Utilisez des pinces pour tenter la peau et faites une incision verticale dans la peau. Après cela, faites une autre incision de taille similaire à travers le péritoine pour exposer les cornes utérines. À l’aide d’une pince, tentez le péritoine tout en faisant l’incision verticale (Figure 2C, D). REMARQUE: Ne pas se préparer correctement lors de l’incision du péritoine peut entraîner une incision mortelle des intestins.</li>
		<li>Massez doucement les cornes utérines à travers l’incision en appuyant sur les côtés de l’abdomen. Pour ce faire, guidez soigneusement l’utérus sans outils, en utilisant uniquement les doigts pour éviter les blessures accidentelles. Placez l’utérus exposé sur un champ chirurgical stérile recouvrant l’abdomen de la digue et maintenez-le humide tout au long de la chirurgie avec des gouttes de solution saline stérile, qui peut être chauffée à 30 °C avant d’être utilisée au besoin (Figure 2E, F). REMARQUE : Les cornes utérines peuvent être identifiées comme décrit dans Wang et al.27.</li>
		<li>Une fois l’utérus exposé, sélectionnez trois paires de placentas pour la manipulation. REMARQUE : Les placentas peuvent être identifiés comme décrit par Elmore et coll.24. Pour maximiser la survie des embryons, pas plus de 6 placentas doivent être traités. S’il y a moins de 12 embryons présents, pas plus de 4 placentas doivent être injectés. Sélectionnez deux placentas adjacents de sorte que l’un reçoive une injection de contrôle et l’autre le plasmide expérimental. L’utilisation de deux placentas adjacents permet une meilleure comparaison des placentas à des endroits similaires dans l’utérus et permet également une augmentation du taux de survie. Les paires placentaires sélectionnées sont choisies au hasard et espacées dans les deux cornes utérines (Figure 1B).</li>
		<li>Enregistrer l’emplacement des manipulations placentaires et l’organisation des embryons dans les cornes utérines afin que les embryons et les placentas puissent être identifiés pendant la collecte, car une mère transportera à la fois des placentas / embryons contrôlés et traités expérimentalement.</li>
	</ol></li>
	<li>Injection placentaire et électroporation du plasmide témoin NOTE: Pour maintenir une technique aseptique, stériliser les palettes d’électroporation et le micro-injecteur avec un stérilisant froid avant utilisation. Changez de gants si une surface non stérile est en contact.<ol><li>À l’aide de la micropipette étalonnée, charger une quantité suffisante du plasmide témoin approprié pour trois injections. Effectuer toutes les injections à une profondeur de ~0,5 mm latéralement dans le placenta entre la décidua (blanc) et la zone jonctionnelle (rouge foncé) (Figure 3A-F).</li>
		<li>Effectuer des injections dans les trois placentas témoins. NOTE: Effectuer toutes les injections de plasmides de contrôle avant les injections expérimentales pour éviter la contamination croisée des plasmides avec la micropipette. Cela permettra d’utiliser la même micropipette, car le changement de micropipettes et de temps d’étalonnage augmente considérablement le temps de chirurgie et diminue la survie de la mère.</li>
		<li>Effectuer l’électroporation des placentas injectés par le plasmide de contrôle dans les 2 minutes suivant l’injection.</li>
		<li>Pour l’électroporation, utilisez une paire de palettes de 3 mm fixées à une machine d’électroporation. Pour assurer l’efficacité de l’incorporation de CRISPR et la viabilité des embryons, utilisez les paramètres d’électroporation suivants : 2 impulsions, 30 V, impulsion de 30 ms, impulsion de 970 ms, unipolaire.</li>
		<li>Après l’injection mais immédiatement avant l’électroporation, enduisez les lieux de contact avec une solution saline stérile, en appliquant la solution saline précisément sur les trois sites de la paroi utérine et les palettes avec un compte-gouttes ou une seringue.</li>
		<li>Appuyez doucement sur les palettes d’électroporation sur les côtés latéraux du placenta. Placer la palette anodique sur le site d’injection et la cathode directement en face (figure 4A-C).</li>
		<li>Appuyez sur l’impulsion de la machine d’électroporation et attendez que les deux impulsions soient terminées avant de retirer les palettes d’électroporation. REMARQUE: Une petite quantité de mousse blanche est souvent observée entre les palettes et le placenta pendant les impulsions. Si cela ne se produit pas, vérifiez la tension des palettes avec un voltmètre avant de les utiliser ultérieurement. Si la lecture sur le voltmètre ne correspond pas au réglage de la tension d’électroporation, les palettes ne fonctionnent pas.</li>
	</ol></li>
	<li>Injection placentaire et électroporation du plasmide expérimental<ol><li>Suivez les mêmes instructions de l’étape 3.4.1. à l’étape 3.4.2. en utilisant le plasmide expérimental au lieu du plasmide témoin.</li>
		<li>Effectuer l’électroporation des trois placentas injectés expérimentaux dans les 2 minutes suivant l’injection. Cela doit être effectué de la même manière que pour ceux injectés avec les plasmides témoins. Suivez l’étape 3.4.4. à l’étape 3.4.7.</li>
	</ol></li>
	<li>Achèvement de la chirurgie<ol><li>Une fois la manipulation placentaire terminée, massez doucement les cornes utérines à l’intérieur de la cavité abdominale en utilisant uniquement les doigts (Figure 5A).</li>
		<li>Tout d’abord, effectuez des sutures simples à double nœud sur la couche péritonéale à l’aide de sutures solubles enduites et tressées de 45 cm de long avec un alliage d’aiguilles 3/8c de 13 mm. Espacez les sutures de 2 à 3 mm (figure 5B).</li>
		<li>Après avoir suturé la couche péritoine, suturer la peau avec des sutures solubles. Nouer trois nœuds les sutures simples à 2-3 mm l’une de l’autre pour s’assurer que le barrage ne peut pas défaire la suture (figure 5C).</li>
		<li>Une fois la suture terminée, régler l’isoflurane à 1 % et l’oxygène à 3,5 L/min, et appliquer de l’adhésif tissulaire sur les sutures de la peau (figure 5D). REMARQUE: L’adhésif tissulaire est facultatif mais recommandé pour empêcher la réouverture de l’incision due à la mastication de la mère.</li>
		<li>Lorsque l’adhésif tissulaire a séché, éteignez le vaporisateur et retirez la digue de la zone de chirurgie. Placez le barrage dans une cage de soutien sur son dos.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Soins postopératoires et surveillance
<ol><li>Laissez la mère enceinte récupérer dans une cage propre sous surveillance pendant au moins 30 minutes pour éviter les complications immédiates de la chirurgie. Observez jusqu’à ce qu’il soit complètement ambulatoire et puisse basculer sur ses pieds sans assistance. Abriter seul le barrage après la chirurgie.</li>
	<li>Suivre les soins postopératoires institutionnels et le suivi jusqu’au prélèvement d’embryons. Enregistrez le poids de la mère et surveillez quotidiennement les sutures et le site d’incision.</li>
</ol>5. Collection placentaire E14.5
<ol><li>Sur E14.5, anesthésier profondément la mère avec un cocktail kétamine/xylazine (1 mg/mL de kétamine et 0,1 mg/mL de xylazine), puis disloquer cerviquement la mère.</li>
	<li>Faites une incision en forme de V dans l’abdomen de la digue avec des ciseaux et retirez l’utérus. Placer immédiatement sur une boîte de Petri de 5 cm sur de la glace. À l’aide de forceps, retirez soigneusement l’embryon et le placenta correspondant de l’utérus. REMARQUE: Conservez un registre de l’emplacement de l’embryon et du placenta correspondant dans les cornes utérines pour déterminer lequel a reçu la manipulation directe pendant la chirurgie.</li>
	<li>Notez les poids placentaires. À l’aide de forceps et de rasoirs sans ARNase, coupez le placenta en deux le long de la ligne médiane. Mettre la moitié dans 4% PFA à 4 ° C. Couper à nouveau la moitié restante en deux et conserver les deux quartiers restants à −80 °C dans deux tubes, dont un avec un réactif de stockage d’ARN. REMARQUE : Les embryons et autres tissus maternels peuvent être conservés à partir de la collection à −80 °C pour une utilisation ultérieure.</li>
</ol>6. Analyse de l’expression génique placentaire
<ol><li>Utiliser le quart du placenta stocké à −80 °C dans un réactif de stockage d’ARN.</li>
	<li>Traiter les placentas pour la qPCR comme décrit dans Elser et al. en utilisant la méthode Trizol pour l’isolement de l’ARN, un spectrophotomètre pour la concentration d’ARN, un kit de synthèse d’ADNc et qPCR avec SYBR Green Master Mix28. Au lieu de la DNAse Turbo DNAfree kit référencée dans Elser et al., utiliser une trousse de nettoyage de l’ARN après l’isolement de l’ARN Trizol pour s’assurer que les échantillons ne contiennent pas de contaminants28. NOTE: Lisez la fiche signalétique (FS) de Trizol et utilisez-la dans une hotte chimique.</li>
	<li>Évaluer l’insertion plasmidique du plasmide témoin avec les amorces GFP et du plasmide expérimental avec les amorces BLAST (amorces énumérées dans le tableau supplémentaire 1). Utilisez la valeur CT pour déterminer la présence du plasmide. REMARQUE: Les valeurs CT supérieures à 35 sont des faux positifs, et seules celles inférieures à 35 doivent être considérées comme un indicateur positif que le plasmide a été inséré avec succès.</li>
	<li>Évaluer l’expression placentaire de l’IGF-1 normalisée au gène 18s (amorces énumérées dans le tableau supplémentaire 1). Utilisez la méthode ddCT pour calculer le changement de pli, puis calculez le changement de pli normalisé des échantillons expérimentaux au changement de pli moyen des échantillons témoins.</li>
</ol>7. Analyse du niveau de protéine placentaire
<ol><li>Utilisez le quart du placenta qui a été conservé à −80 °C. Homogénéiser le tissu dans une solution tampon composée de 11,5 mM de Tris HCl, 5 mM de MgCl2 et 10 mM d’inhibiteur de protéase dansdiH2Oavec un pH final de 7,4. Utilisez un homogénéisateur portatif et un pilon pour briser le tissu. REMARQUE : L’échantillon ne doit pas dépasser 10 % du volume du tampon.</li>
	<li>Diluer les échantillons homogénéisés dans le tampon à 1:12, de sorte qu’ils se situent dans la plage détectable d’une trousse de dosage de l’acide bicinchoninique (BCA). Effectuez le dosage BCA conformément aux instructions du fabricant et quantifiez la protéine totale à l’aide d’un lecteur de plaques.</li>
	<li>Après avoir effectué le test BCA, normaliser tous les échantillons à la même concentration totale de protéines de 2 mg/mL pour l’ELISA IGF-1, comme cela a été fait dans Gumusoglu et coll.29.</li>
	<li>Effectuer le test ELISA IGF-1 conformément aux instructions du fabricant et quantifier les niveaux de protéines IGF-1 à l’aide d’un lecteur de plaque à l’aide d’une courbe de concentration standard.</li>
</ol>8. Vérification spatiale CRIPSR par hybridation fluorescente in situ 
<ol><li>Une fois que les moitiés placentaires ont été fixées de manière appropriée dans du PFA à 4 % à 4 °C pendant 1 à 3 jours, les déplacer dans du saccharose à 20 % à 4 °C avant de les congeler dans un composé à température de coupe optimale (OCT).</li>
	<li>Couper en série les moitiés placentaires intégrées dans un cryostat à −20 °C en sections de 10 μm et les placer sur des lames à étiqueter. Couper les moitiés du placenta de manière à ce que les trois sous-régions soient visibles. Conserver les lames à −80 °C jusqu’à leur utilisation pour l’hybridation in situ .</li>
	<li>Effectuer l’étiquetage par hybridation in situ par fluorescence (FISH) en suivant les protocoles du fabricant. Hybridez une lame avec une sonde dCas9-3xNLS-VP64 et une deuxième lame « sœur » du même placenta avec une sonde Prl8a8. REMARQUE: La sonde dCas9-3xNLS-VP64 détecte la présence du plasmide de surexpression. La sonde Prl8a8 met en évidence les spongiotrophoblastes de la zone jonctionnelle, ce qui permet d’identifier les sous-régions du placenta. Ces deux sondes sont étiquetées sur des lames « sœurs » séparées pour éviter l’interférence de la fluorescence multicanal avec l’autofluorescence verte dans les placentas.</li>
	<li>Étiquetez les deux sondes avec le colorant de détection (Opal 620). Après avoir terminé le protocole du fabricant pour FISH, appliquez le support de montage DAPI et placez une lamelle de couverture sur la glissière. Scellez le couvercle avec du vernis à ongles transparent.</li>
	<li>Imagez les lames sur un microscope à fluorescence composé vertical et traitez-les à l’aide d’un logiciel de traitement d’image approprié. Ici, le logiciel CellSens a été utilisé.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le placenta est un régulateur primaire de la croissance fœtale et, comme indiqué précédemment, les changements dans l’expression ou la fonction des gènes placentaires peuvent avoir un impact significatif sur le développement du fœtus6. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour effectuer une manipulation CRISPR in vivo ciblée du placenta de souris en utilisant une approche chirurgicale relativement avancée. Cette technique permet un rendement significatif d’embryons viables et de leur...

Le placenta est un organe essentiel impliqué dans le développement du fœtus. Le rôle principal du placenta est de fournir des facteurs essentiels et de réguler le transfert des nutriments et des déchets vers et depuis le fœtus. Les placentas des mammifères sont composés à la fois de tissus fœtaux et maternels, qui constituent l’interface fœtale-maternelle et, par conséquent, la génétique de la mère et du fœtus a un impact sur la fonction1. Des anomalies génétiques ou une altération de la fonction du placenta peuvent modifier considérablement le développement du fœtus. Des travaux antérieurs ont montré que la génétique placentaire et le développement sont associés au développement altéré de systèmes d’organes spécifiques chez le fœtus. En particulier, les anomalies du placenta sont liées à des changements dans le cerveau, le cœur et le système vasculairedu fœtus 2,3,4,5.
Le transport des hormones, des facteurs de croissance et d’autres molécules du placenta au fœtus joue un rôle majeur dans le développement du fœtus6. Il a été démontré que la modification de la production placentaire de molécules spécifiques peut altérer le développement neurologique. L’inflammation maternelle peut augmenter la production de sérotonine en modifiant l’expression métabolique du gène du tryptophane (TRP) dans le placenta, ce qui crée par la suite une accumulation de sérotonine dans le cerveau du fœtus7. D’autres études ont trouvé des anomalies placentaires ainsi que des malformations cardiaques. On pense que les anomalies du placenta contribuent aux malformations cardiaques congénitales, l’anomalie congénitale la plus fréquente chez l’homme8. Une étude récente a identifié plusieurs gènes qui ont des voies cellulaires similaires dans le placenta et le cœur. Si elles sont perturbées, ces voies pourraient causer des défauts dans les deux organes9. Les défauts du placenta peuvent exacerber les malformations cardiaques congénitales. Le rôle de la génétique placentaire et de sa fonction sur le développement d’organes fœtaux spécifiques est un domaine d’étude émergent.
Les souris ont des placentas hémochoraux et d’autres caractéristiques des placentas humains, ce qui en fait des modèles très utiles pour étudier les maladies humaines1. Malgré l’importance du placenta, il y a actuellement un manque de manipulations génétiques in vivo ciblées. En outre, il existe actuellement plus d’options disponibles pour les knockouts ou knockdowns que les manipulations de surexpression ou de gain de fonction dans le placenta10. Il existe plusieurs lignées transgéniques exprimant Cre pour la manipulation spécifique du placentaire, chacune dans différentes lignées trophoblastiques à différents moments de temps. Il s’agit notamment du Cyp19-Cre, de l’Ada/Tpbpa-Cre, du PDGFRα-Creer et du Gcm1-Cre11,12,13,14. Bien que ces transgènes Cre soient efficaces, ils peuvent ne pas être capables de manipuler certains gènes à des moments spécifiques. Une autre méthode couramment utilisée pour éliminer ou surexprimer l’expression des gènes placentaires est l’insertion de vecteurs lentiviraux dans la culture de blastocystes, ce qui provoque une manipulation génétique spécifique au trophoblaste15,16. Cette technique permet un changement robuste dans l’expression du gène placentaire au début du développement. L’utilisation de l’interférence ARN in vivo a été peu utilisée dans le placenta. L’insertion de plasmides shRNA peut être réalisée de manière similaire à la technique CRIPSR décrite dans cet article. Cela a été fait à E13.5 pour diminuer avec succès l’expression de PlGF dans le placenta, avec des impacts sur le système vasculaire cérébral de la progéniture17.
En plus des techniques qui sont principalement utilisées pour knockout ou knockdown, induire une surexpression est couramment réalisée avec des adénovirus ou l’insertion d’une protéine exogène. Les techniques utilisées pour la surexpression ont des taux de réussite variables et ont pour la plupart été effectuées plus tard dans la gestation. Pour étudier le rôle du facteur de croissance analogue à l’insuline 1 (IGF-1) dans la fonction placentaire, un transfert de gène placentaire médié par l’adénovira a été effectué pour induire la surexpression du gène IGF-1 18,19. Cela a été réalisé tard dans la gestation de la souris sur E18.5 par injection placentaire directe. Pour fournir des options supplémentaires et contourner les échecs possibles des manipulations génétiques placentaires établies, telles que les échecs de la combinaison Cre-Lox, la toxicité possible des adénovirus et les effets hors cible de shRNA, la manipulation directe CRISPR in vivo du placenta peut être utilisée20,21,22. Ce modèle a été développé pour remédier au manque de modèles de surexpression et pour créer un modèle flexible.
Cette technique est basée sur les travaux de Lecuyer et al., dans lesquels les plasmides shRNA et CRISPR ont été ciblés directement in vivo sur les placentas de souris pour modifier l’expression de PlGF 17. Cette technique peut être utilisée pour modifier directement l’expression des gènes placentaires en utilisant la manipulation CRISPR à plusieurs points temporels; pour ce travail, E12.5 a été sélectionné. Le placenta a mûri à ce stade et est assez grand pour être manipulé, ce qui permet l’insertion d’un plasmide CRISPR spécifique sur E12.5, ce qui peut avoir un impact significatif sur le développement du fœtus du milieu à la fin de la grossesse23,24. Contrairement aux approches transgéniques, mais similaires aux inductions virales ou aux interférences ARN, cette technique permet une surexpression ou un knockout à des moments particuliers en utilisant une approche chirurgicale relativement avancée, évitant ainsi une éventuelle altération de la placentation ou de la létalité embryonnaire due à des changements antérieurs. Comme seuls quelques placentas reçoivent le plasmide expérimental ou témoin dans une portée, l’approche permet deux types de contrôles internes. Ces témoins sont ceux qui sont injectés et électroporés avec le plasmide de contrôle approprié et ceux qui ne reçoivent aucune manipulation directe. Cette technique a été optimisée pour créer une surexpression du gène IGF-1 dans le placenta de souris via un plasmide CRISPR médiateur d’activation synergique (SAM). Le gène IGF-1 a été choisi, car l’IGF-1 est une hormone de croissance essentielle délivrée au fœtus qui est principalement produite dans le placenta avant la naissance25,26. Cette nouvelle technique CRISPR ciblant le placental permettra une manipulation directe pour aider à définir le lien entre la fonction placentaire et le développement fœtal.

<table><tbody><tr><td>Tubes de 1,5 ml</td><td>USA Scientific Inc</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>4 % de paraformeldhyde (PFA) dans PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J61899. </td><td></td>AP</tr><tr><td>96 Plaque de puits</td><td>Cornings</td><td>3598</td><td>Pour kit BCA</td></tr><tr><td>Sous-couches absorbantes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide de contrôle d’activation</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-437275</td><td>Eau exempte de dnase fournie pour la dilution</td></tr><tr><td>AMV Transcriptase</td><td>inverse New England Biolabs</td><td>M0277L</td><td>Utilisation pour la synthèse de l’ADNc</td></tr><tr><td>Anesthésique Vaporisateur de gaz</td><td>Vetamac</td><td>VAD-601TT</td><td>Vaporisateur compact VAD</td></tr><tr><td>Artifical Tear Gel</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td>Quantification des protéines</td></tr><tr><td>Biovortexer</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>198050000</td><td>Homogénéisateur de tissus portatif</td></tr><tr><td>CellSens Software</td><td>Olympus</td><td>V4.1.1</td><td>Traitement d’images en images FISH.</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628168</td><td>Centrifugeuse à plaques</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J67241-AP</td><td>Isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Applicateurs à pointe de coton</td><td>ProAdvantage</td><td>77100</td><td>Stériliser avant utilisation</td></tr><tr><td>CRISPR/Cas9 Contrôle Plasmide</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-418922</td><td>Eau sans Dnase fournie pour la dilution</td></tr><tr><td>CryoStat</td> Microscope de dissection <td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>M125 C</td><td>Utilisé pour l’imagerie post-nécroscopie</td></tr><tr><td>Sutures solubles</td><td>Med Vet International</td><td>J385H</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée</td><td>Gibco</td><td>15230162</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>14190144</td><td>(-) Calcium ; (-) </td></tr><tr><td>Électro-électroportateur en magnésium ECM 830 (machine d’électroporation)</td><td>BTX Appareil Harvard</td><td>45-0662</td><td>Générateur uniquement</td></tr><tr><td>Rasoir électrique</td><td>Wahl</td><td>CL9990</td><td>Kent Scientific</td></tr><tr><td>Électroporation/Pince à épiler BTX</td><td>Appareil Harvard</td><td>45-0487</td><td>Palettes de 3 mm de diamètre ; fils inclus</td></tr><tr><td>Cassette d’encastrement : 250 PK</td><td>Grainger</td><td>21RK94</td><td>Cassettes d’enrobage placentaire</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>268280010</td><td></td></tr><tr><td>F-Air Canisters</td><td>Penn Veterinary Supply Inc</td><td>BIC80120</td><td>Filtre isoflurane en excès</td></tr> Fast <tr><td>Green Dye FCF</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td>Dissoudre à 1 &mu ; g/ml et filtre ; protéger de la lumière</td></tr><tr><td>Photomètre à microplaques à filtre (lecteur de plaques)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14377576</td><td>Peut être utilisé pour BCA et ELISA</td></tr><tr><td>Pinces</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>Pointes fines, droites, dentelées</td></tr><tr><td>Solution de formol, tamponnée neutre, 10 %</td> <td>Sigma Aldrich HT501128</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre - Verre borosilicaté (Micropipette)</td><td>Instrument</td> <td>SutterB150-86-10</td><td>D.E. : 1,5 mm, D.E. : 0,86 mm, longueur 10 cm</td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphotase Halt (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861281</td><td>Tampon d’homogénéisation des protéines</td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Thermotech</td><td>S766D</td><td>Coussin chauffant humide numérique</td></tr><tr><td>Hémostats</td><td>VWR</td><td>10806-188</td><td>Mâchoire entièrement surévaluée ;</td></tr><tr><td>incurvée Bain d’eau chaude</td><td>Fisher Scientific</td><td>20253</td><td>Isotemp 205</td></tr><tr><td>Igf-1 SAM Plasmide (m1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-421056-ACT</td><td>Eau exempte de Dnase fournie pour la dilution</td></tr><tr><td>Chambre d’induction</td><td>Vetamac</td><td>941443</td><td>Aucune taille de litre spécifique requise</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Pharma Limited</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Isoproponal/2-Proponal</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4</td><td>Isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Kétamine HCl 100mg/ml</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-114-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2/Magneisum Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63069-100ML</td><td>1M. Tampon d’homogénéisation des protéines</td></tr><tr><td>MicroAmp&trade ; Plaque de réaction optique à 384 puits avec code-barres</td><td>Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td>Plaques à code-barres non requises</td></tr><tr><td>Pointe microcapillaire</td><td>Eppendorf</td><td>5196082001</td><td>fixée au micro-injecteur BTX</td></tr><tr><td>Appareil BTX Harvard</td><td>45-0766</td><td>Porte-pipette en acier inoxydable, longueur 130 mm, pour pipettes de 1 à 1,5 mm</td><td></td></tr><tr><td>Microject 1000A (machine d’injection)</td><td>BTX Appareil Harvard</td><td>45-0751</td> Extracteur de micropipette <td>MicroJect 1000A Plus</td></tr><tr><td>System Modèle P-97</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Extracteur de micropipette de type flamant/brun</td></tr><tr><td>Mélangeur de microplaques (Plate Shaker)</td><td>scilogex</td><td>822000049999</td><td></td></tr><tr><td>Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA</td><td>Kit R & Aiguilles D Systems</td><td>MG100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD - Becton, Dickson, and Company</td><td>305106</td><td>30 Gx 1/2 (0,3 mm x 13 mm)</td></tr><tr><td>Réservoir d’azote</td><td>Linde</td><td>7727-37-9</td><td>Tout gaz interne</td></tr><tr><td>Anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS)</td><td>Norbrook Laboratories Limited</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>Analesgiques tels que Meloxicam</td></tr><tr><td>Nez Cône</td><td>Vetamac</td><td>921609</td><td>9-14 mm</td></tr><tr><td>Colorant de détection Opal 620</td><td>Akoya Biosciences</td><td>SKU FP1495001KT</td><td>Utilisé pour le FISH</td></tr><tr><td>Composé à température de coupe optimale (O.C.T)</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir d’oxygène</td><td>Linde</td><td>7782 - 44 - 7</td><td>Pilons d’oxygène de qualité médicale</td></tr><tr><td></td><td>USA Scientific Inc</td><td>14155390</td><td></td></tr><tr><td>Solution de povidone et d’iode, 5 %</td> <td>Avrio Health L.P.</td><td>NDC 67618-155-16</td><td></td></tr><tr><td>Puissance SYBR&trade ; Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4367659</td><td>Utilisation pour qPCR</td></tr><tr><td>Hexamères aléatoires (amorces aléatoires)</td><td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td><td>Utilisation pour la synthèse de l’ADNc</td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Grainger</td><td>26X080</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nettoyage de l’ARN & Concentrateur</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNALater</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNAscope v.2.5</td><td>Advanced Cells Diagnostics</td><td>323100</td><td>Contient tous les réactifs nécessaires à l’hybridation in situ fluorescente. Sondes vendues séparément.</td></tr><tr><td>ARNASCOPE&commerce ; Sonde- MM-PRL8A8-C2</td><td>Advanced Cells Diagnostics</td><td>&nbsp ; 528641-C2</td><td></td></tr><tr><td>ARNASCOPE&trade ; Sonde- Vector-dCas9-3xNLS-VP64</td><td>Advanced Cells Diagnostics</td><td>527421</td><td></td></tr><tr><td>Roto-Therm Mini</td><td>Benchmark</td><td>R2020</td><td>Four sec pour hybridation in situ</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td>Ciseaux de dissection, pointe acérée, 4&sup1 ;/ ?</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (salin)</td><td>Hospra</td><td>NDC 0409-4888-03</td><td>Stérile, &nbsp ; 0,9 %</td></tr> <tr><td>Citrate de sodium, sel trisodique, dihydraté, [Acide citrique, dihydraté]</td> <td>Research Product International</td><td>03-04-6132</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium 1N concentré, Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS277</td><td>Tampon d’homogénéisation des protéines</td></tr><tr><td>Steamer</td><td>Bella</td><td>B00DPX8UBA</td><td></td></tr><tr><td>Champ chirurgical stérile</td><td>Busse</td><td>696</td><td>Stériliser avant utilisation</td></tr><tr><td>Lames de microscope Superfrost Plus Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture Surgipath 24x60</td><td>Seringues Leica</td><td>3800160</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD - Becton, Dickson, and Company</td><td>309659</td><td>BD Seringue Luer Slip Tip stérile, à usage unique, 1 mL</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&commerce ; Invitrogen&trade ; Nanodrop&commerce ; Un spectrophotomètre avec WiFi et Qubit&trade ; Fluorimètre</td><td>4 Fisher Scientific</td><td>13-400-525</td><td>Cette configuration est livrée avec le fluorimètre Qubit 4. La quantification des qubits n’est pas requise.</td></tr><tr><td>Adhésif tissulaire</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>VetBond</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15568025</td><td>1M. Tampon d’homogénéisation des protéines</td></tr><tr><td>TRIzol&trade ; Réactif</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td>Isolation de l’ARN</td></tr><tr><td>TSA Buffer Pack</td><td>Advanced Cells Diagnostics</td><td>322810</td><td>Utilisé pour diluer le colorant de détection Opal 620</td></tr><tr><td>Universal F-Circuit</td><td>Vetamac</td><td>40200</td><td>Fixé au vaporisateur et aux accessoires de vaporisation</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence composé vertical</td><td>Olympus</td><td>BX61VS</td><td>Utilisé pour l’imagerie FISH</td></tr><tr><td>Vectorshield avec support de montage DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Coverslip</td></tr><tr><td>ViiA&trade ; 7 Système de PCR en temps réel avec bloc à 384 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4453536</td><td>Il s’agit de la détection de blocs SYBR à 384 puits. TaqMan et/ou plus petits blocs disponibles</td></tr><tr><td>Wet n Wild Vernis à ongles Wild Shine, Protecteur pour ongles transparent, Couleur pour les ongles</td><td>Amazon</td><td>C450B</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 20mg/ml</td><td>Anased</td><td>343730_RX</td><td></td></tr></tbody></table>

manipulation crispr ciblée placentaire in vivo chez la souris

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

Le placenta est un organe essentiel qui régule et maintient le développement des mammifères in utero. Le placenta est responsable du transfert des nutriments et des déchets entre la mère et le fœtus et de la production et de l’administration des facteurs de croissance et des hormones. Les manipulations génétiques placentaires chez la souris sont essentielles pour comprendre le rôle spécifique du placenta dans le développement prénatal. Les souris transgéniques exprimant Cre spécifiques au placental ont une efficacité variable, et d’autres méthodes de manipulation du gène placentaire peuvent être des alternatives utiles. Cet article décrit une technique pour modifier directement l’expression des gènes placentaires en utilisant la manipulation du gène CRISPR, qui peut être utilisée pour modifier l’expression des gènes ciblés. En utilisant une approche chirurgicale relativement avancée, les mères enceintes subissent une laparotomie au jour embryonnaire 12.5 (E12.5), et un plasmide CRISPR est délivré par une micropipette en verre dans les placentas individuels. Le plasmide est immédiatement électroporé après chaque injection. Après la récupération de la mère, les placentas et les embryons peuvent continuer à se développer jusqu’à une évaluation ultérieure. L’évaluation du placenta et de la progéniture après l’utilisation de cette technique peut déterminer le rôle de la fonction placentaire spécifique au temps dans le développement. Ce type de manipulation permettra de mieux comprendre l’impact de la génétique et de la fonction placentaires sur la croissance et le développement du fœtus dans de multiples contextes de maladies.

Résultats de la procédure générale (Figure 6) Dans l’étude, il y avait trois groupes manipulés. Ceux-ci comprenaient des placentas injectés avec un plasmide de contrôle général CRISPR Cas9 (Cas9 Control), un plasmide CRISPR de contrôle d’activation (Act Control) ou un plasmide d’activation IGF-1 SAM (Igf1-OE). Le Cas9 Control est mieux adapté aux plasmides knock-out, et le contrôle d’activation est mieux adapté aux plasmides de surexpression / ac...

Nous décrivons ici une méthode spécifique au temps pour manipuler efficacement les voies de développement critiques dans le placenta de la souris in vivo. Ceci est réalisé par injection et électroporation de plasmides CRISPR dans les placentas des mères gravides au jour embryonnaire 12.5.

Manipulation CRISPR ciblée placentaire in vivo chez la souris

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

Ce protocole est important car il permet une manipulation ciblée spécifique dans le temps des placentas de souris à l’aide de CRISPR. Cela permettra aux chercheurs d’élucider des fonctions génétiques spécifiques au milieu ou à la fin de la grossesse. Les manipulations génétiques provoquant une surexpression dans le placenta de la souris sont très rares.Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une gamme de changements d’expression génique dans le placenta. Ne vous découragez pas si les termes préliminaires ont cette technique sont infructueux. Comme cette technique est difficile, il faut un peu de temps pour s’entraîner à maîtriser.Pour commencer, placez la mère anesthésiée en décubitus dorsal avec un cône nasal pour maintenir l’anesthésie dans la zone de préparation. Raser soigneusement l’abdomen du barrage. Pour éviter le séchage de la cornée, placez du gel lacrymal artificiel sur les deux yeux de la mère.Ensuite, utilisez des applicateurs à embout de coton stérile pour désinfecter le site chirurgical avec au moins trois cycles alternés d’une solution de povidone iodée, suivie d’éthanol à 70% avec une couche finale de solution de povidone iodée. Après la préparation, déplacez la digue avec le cône nasal d’anesthésie vers la zone de chirurgie désignée. Pour la laparotomie utérine, placez la mère en décubitus dorsal sur la table d’opération et fixez le cône nasal en place avec du ruban adhésif.Placez un coussin chauffant sous un tampon absorbant réglé à 45 degrés Celsius. Après avoir confirmé la profondeur de l’anesthésie par l’absence de reflux de pincement des orteils, utilisez des pinces et des ciseaux pour faire une incision médiane d’environ deux centimètres à travers la peau de la tente. Ensuite, faites une incision verticale à travers le péritoine à l’aide de forceps stériles, doucement tendues loin des cornes utérines.Massez les deux cornes utérines en appuyant de chaque côté de l’abdomen avec les doigts pour les guider. Placez l’utérus exposé sur des champs chirurgicaux stériles placés sur le bas-ventre et maintenez-le humide avec des gouttes de solution saline stérile chaude si nécessaire. Une fois l’utérus exposé, sélectionnez trois paires de placentas pour la manipulation.Enregistrer l’emplacement des manipulations placentaires et l’organisation des embryons dans les cornes utérines. Pour l’injection placentaire du plasmide témoin, charger une quantité suffisante du plasmide témoin approprié pour trois injections à l’aide d’une micropipette étalonnée. Effectuer toutes les injections entre la décidua et la zone jonctionnelle à une profondeur d’environ 0,5 millimètres latéralement dans le placenta.Après l’injection mais immédiatement avant l’électroporation, enduisez les lieux de contact avec une solution saline stérile, en appliquant la solution saline précisément sur les trois sites de la paroi utérine et les palettes avec un compte-gouttes ou une seringue. Dans les deux minutes suivant l’injection, effectuez l’électroporation à l’aide d’une paire de palettes de trois millimètres fixées à une machine d’électroporation. Pour assurer l’efficacité de l’incorporation de CRISPR et la viabilité des embryons, réglez les réglages à 30 volts, impulsion de 30 millisecondes, deux impulsions, impulsion de 970 millisecondes éteinte et unipolaire.Appuyez doucement sur les palettes d’électroporation sur les parois utérines sur les côtés latéraux du placenta. Placez la palette anodique sur le site d’injection et la cathode directement en face. Appuyez sur l’impulsion de la machine d’électroporation et attendez que les deux impulsions soient terminées avant de retirer les palettes d’électroporation.Procédez ensuite à l’injection placentaire du plasmide expérimental comme démontré précédemment. Effectuer l’électroporation des trois placentas injectés expérimentaux dans les deux minutes suivant l’injection, comme cela a été fait pour le groupe témoin. Une fois la manipulation placentaire terminée, massez doucement les cornes utérines à l’intérieur de la cavité abdominale en utilisant uniquement les doigts pour manipuler directement les cornes utérines.Effectuer des sutures interrompues sur la couche du péritoine à l’aide de sutures solubles enduites et tressées de 45 centimètres de long avec un alliage d’aiguilles circulaires de 13 millimètres, trois huitièmes. Après avoir suturé la couche du péritoine, suturer la peau avec des sutures solubles en utilisant le même type de sutures solubles utilisées pour le péritoine. Une fois la suture terminée, appliquez de l’adhésif tissulaire sur les sutures de la peau.Lorsque l’adhésif tissulaire a séché, éteignez le vaporisateur et transférez la digue de la zone chirurgicale à une cage de soutien sur son dos. Les placentas ont été injectés avec un plasmide de contrôle général CRISPR Cas9 et un plasmide de contrôle d’activation CRISPR ou un plasmide d’activation SAM IGF-1. Les images représentatives post-nécropsie n’ont montré aucun dommage notable ou changement dans l’apparence phénotypique dans les groupes de traitement.Le taux de survie des embryons non traités dans les portées manipulées a diminué à une moyenne de 79,05%, tandis qu’il y avait une diminution significative de la survie des embryons manipulés avec une moyenne de 55,56%Il n’y avait pas de différence significative dans le poids placentaire d’aucun groupe. Il n’y avait pas de différence significative dans la prise de poids maternelle immédiatement après la chirurgie par rapport aux chirurgies simulées. De nombreuses mères enceintes ont montré une légère diminution ou aucun changement de poids le lendemain de l’intervention, probablement en raison de la perturbation de l’alimentation pendant et brièvement après la chirurgie.La plupart des mères ont montré une augmentation du poids sur E14.5, mais parfois une diminution du poids a encore été observée. La qPCR a montré une augmentation significative de l’expression de l’IGF-1 dans les placentas de surexpression de l’IGF-1 par rapport aux placentas témoins. L’évaluation ELIZA des placentas E14.5 a montré une augmentation significative des taux de protéines IGF-1 dans les placentas de surexpression de l’IGF-1 par rapport aux placentas témoins.L’autofluorescence verte a démontré les sous-régions de l’interface fœtale maternelle placentaire avec un marquage Cas9 rouge dans le placenta de surexpression IGF-1, indiquant une incorporation réussie de CRISPR dans les trois sous-régions du placenta. Le marquage par hybridation fluorescente dans C2 a confirmé l’incorporation du plasmide d’activation de l’IGF-1 sans migration dans les placentas non traités. La zone déciduale et la zone labyrinthique ont pu être identifiées autour de la zone jonctionnelle rouge marquée par la coloration Prl8a8.N’oubliez pas d’enregistrer le type de manipulation et l’emplacement des placentas et des embryons correspondants. Il est fortement recommandé d’enregistrer l’emplacement du col de l’utérus et des embryons dans les cornes utérines. Après cette procédure, une analyse du placenta, de l’embryon et de la mère peut être effectuée.Cela permettra une meilleure compréhension des rôles spécifiques des gènes placentaires dans la grossesse, la fonction placentaire et le développement embryonnaire.

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Génétique

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